血流切应力变化对血管壁平滑肌细胞合成胶原的影响
作者：韩 林 张宝仁 柳兆荣 朱家麟 覃开荣
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：内皮细胞；平滑肌细胞；切应力；胶原
第二军医大学学报991210 摘要 目的：观察血流切应力变化对血管壁胶原含量的影响,以探讨循环血管局部血流环境变化对血管结构的影响。方法：体外培养内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)，建立平行平板流动腔模型模拟产生切应力作用于EC，测定不同大小切应力作用后的内皮细胞条件培养液(EC-CM)中SMC的胶原合成量。结果：在0，0.10，0.15，0.25 mN/cm2切应力作用后的EC-CM中培养24 h后，每103 SMC合成2,3-3H-羟脯氨酸的量分别为(1.31±0.123),(0.844±0.081),(0.609±0.099),(0.466±0.067) Bq;分泌的胶原量分别为(0.147±0.015),(0.101±0.026),(0.077±0.010),(0.041±0.004) Bq。结论：在生理范围内，随所受切应力的减小， EC-CM中SMC的胶原合成增加，提示血管局部血流速度的减缓使血管壁胶原沉积增多。
, 百拇医药
中图分类号 R 543 文章编号：0258-879X(1999)12-0965-03 文献标识码：A
Effects of the change of hemodynamic shear forces on smooth muscle cells collagen synthesis on the vessel wall
Han Lin, Zhang Baoren, Liu Zhaorong, Zhu Jialin, Qin Kairong
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To gain the knowlege whether the changes of local blood flow affect the structure of vessel wall. Methods: The effects of culture medium conditioned with endothelial cells (EC) exposed to hemodynamic shear forces on modulation of smooth muscle cells (SMC) collagen synthesis in the arterial wall was investigated. Endothelial and SMC were isolated and cultured in vitro. The parallel-plated flow chamber device was established to simulate blood flow environment. Supernatant of EC exposed to laminar flow was used to study collagen synthesis of SMC by 2,3-3H proline incorporation into 3H hydroxyproline. Results: After cultured in the culture medium conditioned with EC exposed to 0.25，0.15，0.10，0 mN/cm2 shear stress for 24 h, the contents of 3H hydroxyproline incorporated into SMC was (1.31±0.123), (0.844±0.081), (0.609±0.099), (0.466±0.067) Bq per 103 cells, and the contents of 3H hydroxyproline secreted into culture medium was (0.147±0.015), (0.101±0.026), (0.077±0.010), (0.041±0.004) Bq per 103 cells. Conclusion: The results suggest that the reduction of local blood flow might stimulate accumulation of vascular collagen.
, 百拇医药
KEY WORDS endothelial cell; smooth muscle cell; shear stress; collagen
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 965～967]
胶原是构成血管壁的重要结缔组织成分，主要来源于平滑肌细胞 (SMC)。血液中的化学因素和物理因素的刺激，往往通过影响内皮细胞(EC)的功能，调节SMC合成胶原[1]。本实验观察了不同大小切应力作用对EC条件培养液(EC-CM)中SMC胶原合成的影响，以讨论循环血管局部血流环境变化对血管结构的影响。
1 材料和方法
1.1 小牛肺动脉EC的培养和鉴定 用0.1%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，根据相差显微镜下观察细胞形态及凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测结果鉴定培养的细胞。用于本实验为第4～7代，PAEC接种于 110 mm×70 mm×10 mm玻璃平板，细胞长满后2 d用于剪切实验。
, 百拇医药
1.2 小牛肺动脉SMC的培养和鉴定 用0.2%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉肌条，根据细胞形态(长松形，稀疏生长时少数可是多角形)、生长特点鉴定培养的细胞。用于本实验为第5代细胞。
1.3 平行平板流动腔的建立和使用 实验装置构成、切应力产生原理及计算公式见文献[2] 。流室、灌注管道和贮液槽预先经高压灭菌，于37℃ SHH 生化培养箱内无菌条件下进行装配、使用。分别在0.10，0.15，0.25 mN/cm2 切应力作用18 h 后，收集灌流液，1 000 ×g离心5 min，取上清液备用。
1.4 EC-CM 中SMC胶原合成量的测定 SMC以4×104接种于6孔培养皿，2 d后长成单层融合，吸弃培养液，用Hanks液轻洗3遍，用无血清DMEM培养液培养24 h，各孔换入各组条件培养液1 ml，37℃培养24 h，然后换入含0.1 mmol抗坏血酸的无血清DMEM 1 ml，37℃培养30 min，加入185 kBq 2,3-3H-脯氨酸继续培养3 h，收集细胞及培养液，按文献介绍的方法测定细胞胶原的合成量[3]。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 结果均以
±s表示，采用未配对资料的t检验。
2 结果
2.1 EC-CM对SMC合成胶原的影响 用静息状态EC-CM培养液培养24 h后，SMC合成2,3-3H-羟脯氨酸的量明显升高，由对照组的每103细胞(0.846±0.178) Bq 升至 (1.31±0.123) Bq (P<0.01)，细胞分泌入培养液中胶原量也相应升高[每103细胞为(0.059±0.013)对 (0.147±0.015) Bq， P<0.01]。
2.2 剪切作用对EC-CM中SMC合成胶原的影响 SMC在不同切应力作用后的EC-CM中培养24 h后，细胞合成2,3-3H-羟脯氨酸的量和分泌的胶原量，随切应力的增大而减少(表1)。
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表1 切应力作用对EC-CM中SMC(×103)
胶原合成量的影响
Tab 1 Effect of hemodynamic shear forces on modulation
of SMC (×103)collagen synthesis in culture medium
conditioned with endothelial cells
(n=6,±s, A/Bq) Shear(τ/mN.cm-2)
, 百拇医药
Cell
In EC-CM
0
1.31±0.123▲▲
0.147±0.015▲▲
0.10
0.844±0.081△△
0.101±0.026△△
0.15
0.609±0.099**
, 百拇医药 0.077±0.010**
0.25
0.466±0.067
0.041±0.004
**P<0.01 vs 0.25 mN/cm2; △△P<0.01 vs 0.15 mN/cm2; ▲▲P<0.01 vs 0.10 mN/cm2
3 讨论
EC和SMC是构成血管壁的两种主体细胞，两者之间存在着结构和体液性联系，前者可通过合成和分泌多种生物活性因子，调节SMC的舒缩、增殖和细胞外基质的合成。胶原是主要的细胞外基质之一，以往国内外的研究和本实验结果均提示，在静息状态下培养的EC-CM能促使胶原的合成[3]。
, 百拇医药
血管壁胶原含量受血液环境多种因素的影响，其中血液流动作用于血管壁的机械刺激参与调节血管壁结构，局部血流环境的紊乱参与许多血管疾病的病理生理过程。机械应力包括侧向的压力和牵张力以及切向的切应力。Nathalie[4]和Tozzi[5]研究发现，血管壁中合成胶原的能力与所受压力和牵张力密切相关，其生理效应有赖于血管壁内皮的完整性，然而切应力的变化与胶原合成的关系尚未见报道。
切应力是血流流经血管作用于内膜的摩擦力，只对EC具有生理效应，在正常生理条件下大血管中内皮所受的切应力为0.20～0.25 mN/cm2。目前尚缺乏在体研究切应力的生理效应的手段。我们采用离体的平行平板流动腔模型模拟产生切应力，比较SMC在不同切应力作用后的EC-CM中合成胶原量的变化，以反映切应力变化对血管壁中胶原含量的影响。 结果发现，在生理范围内，随所受切应力的减小， EC-CM中SMC 胶原合成增加，由此我们推断血管局部血流速度的减缓使血管壁胶原沉积增多。但由于实验条件的限制，还不能研究切应力在超过生理范围时，其对血管壁胶原含量的影响。
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以往的研究发现，切应力参与EC内多种活性因子基因表达的调节，这些活性因子又参与调节SMC胶原的合成[6,7]。因此，血管局部血流速度的减缓引起血管壁胶原沉积，可能与EC生长促进因子合成减少和(或)生长抑制因子合成增多有关。
作者简介：韩林，男，1968年9月生，博士，主治医师
参考文献
1 Dzau VJ. Vascular remodeling: mechanisms and implications[J]. J Cardiovas Pharm，1993,21(Suppl 1):S1
2 韩 林，张宝仁，柳兆荣,等. 稳态层流下的内皮细胞形态特征变化[J]. 第二军医大学学报，1999，20(10)：801
3 但清宏，黄元伟，楼定安. 内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞合成胶原的影响[J]. 中国病理生理学杂志，1993,9(3):498
, http://www.100md.com
4 Nathalie B, Karillon GJ, Merval R,et al. Differential effects of pressure and flow on DNA and protein synthesis and on fibronectin expression by arteries and a novel organ culture system[J]. Circ Res,1995,77(2):684
5 Tozzi CA. Pressure-induced connective tissue synthesis in pulmonary artery segments is dependent on intace endothelium[J]. J Clin Invest,1989,84(4):1005
6 Malek AM. Physiological fluid shear stress cause downregulation of endothelin-1 mRNA in bovine aortic endothelium[J]. Am J Physiol,1992,263(1): C38
7 Malek AM. Fluid shear stress differentially modulates expression of genes encoding basic fibroblast growth factors and platelet-derived growth B chain in vascular endothelium[J]. J Clin Invest, 1993,92(8):2013
(1999-05-11收稿，1999-09-10修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：内皮细胞；平滑肌细胞；切应力；胶原
第二军医大学学报991210 摘要 目的：观察血流切应力变化对血管壁胶原含量的影响,以探讨循环血管局部血流环境变化对血管结构的影响。方法：体外培养内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)，建立平行平板流动腔模型模拟产生切应力作用于EC，测定不同大小切应力作用后的内皮细胞条件培养液(EC-CM)中SMC的胶原合成量。结果：在0，0.10，0.15，0.25 mN/cm2切应力作用后的EC-CM中培养24 h后，每103 SMC合成2,3-3H-羟脯氨酸的量分别为(1.31±0.123),(0.844±0.081),(0.609±0.099),(0.466±0.067) Bq;分泌的胶原量分别为(0.147±0.015),(0.101±0.026),(0.077±0.010),(0.041±0.004) Bq。结论：在生理范围内，随所受切应力的减小， EC-CM中SMC的胶原合成增加，提示血管局部血流速度的减缓使血管壁胶原沉积增多。
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中图分类号 R 543 文章编号：0258-879X(1999)12-0965-03 文献标识码：A
Effects of the change of hemodynamic shear forces on smooth muscle cells collagen synthesis on the vessel wall
Han Lin, Zhang Baoren, Liu Zhaorong, Zhu Jialin, Qin Kairong
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To gain the knowlege whether the changes of local blood flow affect the structure of vessel wall. Methods: The effects of culture medium conditioned with endothelial cells (EC) exposed to hemodynamic shear forces on modulation of smooth muscle cells (SMC) collagen synthesis in the arterial wall was investigated. Endothelial and SMC were isolated and cultured in vitro. The parallel-plated flow chamber device was established to simulate blood flow environment. Supernatant of EC exposed to laminar flow was used to study collagen synthesis of SMC by 2,3-3H proline incorporation into 3H hydroxyproline. Results: After cultured in the culture medium conditioned with EC exposed to 0.25，0.15，0.10，0 mN/cm2 shear stress for 24 h, the contents of 3H hydroxyproline incorporated into SMC was (1.31±0.123), (0.844±0.081), (0.609±0.099), (0.466±0.067) Bq per 103 cells, and the contents of 3H hydroxyproline secreted into culture medium was (0.147±0.015), (0.101±0.026), (0.077±0.010), (0.041±0.004) Bq per 103 cells. Conclusion: The results suggest that the reduction of local blood flow might stimulate accumulation of vascular collagen.
, 百拇医药
KEY WORDS endothelial cell; smooth muscle cell; shear stress; collagen
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 965～967]
胶原是构成血管壁的重要结缔组织成分，主要来源于平滑肌细胞 (SMC)。血液中的化学因素和物理因素的刺激，往往通过影响内皮细胞(EC)的功能，调节SMC合成胶原[1]。本实验观察了不同大小切应力作用对EC条件培养液(EC-CM)中SMC胶原合成的影响，以讨论循环血管局部血流环境变化对血管结构的影响。
1 材料和方法
1.1 小牛肺动脉EC的培养和鉴定 用0.1%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，根据相差显微镜下观察细胞形态及凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测结果鉴定培养的细胞。用于本实验为第4～7代，PAEC接种于 110 mm×70 mm×10 mm玻璃平板，细胞长满后2 d用于剪切实验。
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1.2 小牛肺动脉SMC的培养和鉴定 用0.2%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉肌条，根据细胞形态(长松形，稀疏生长时少数可是多角形)、生长特点鉴定培养的细胞。用于本实验为第5代细胞。
1.3 平行平板流动腔的建立和使用 实验装置构成、切应力产生原理及计算公式见文献[2] 。流室、灌注管道和贮液槽预先经高压灭菌，于37℃ SHH 生化培养箱内无菌条件下进行装配、使用。分别在0.10，0.15，0.25 mN/cm2 切应力作用18 h 后，收集灌流液，1 000 ×g离心5 min，取上清液备用。
1.4 EC-CM 中SMC胶原合成量的测定 SMC以4×104接种于6孔培养皿，2 d后长成单层融合，吸弃培养液，用Hanks液轻洗3遍，用无血清DMEM培养液培养24 h，各孔换入各组条件培养液1 ml，37℃培养24 h，然后换入含0.1 mmol抗坏血酸的无血清DMEM 1 ml，37℃培养30 min，加入185 kBq 2,3-3H-脯氨酸继续培养3 h，收集细胞及培养液，按文献介绍的方法测定细胞胶原的合成量[3]。
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1.5 统计学处理 结果均以
±s表示，采用未配对资料的t检验。2 结果
2.1 EC-CM对SMC合成胶原的影响 用静息状态EC-CM培养液培养24 h后，SMC合成2,3-3H-羟脯氨酸的量明显升高，由对照组的每103细胞(0.846±0.178) Bq 升至 (1.31±0.123) Bq (P<0.01)，细胞分泌入培养液中胶原量也相应升高[每103细胞为(0.059±0.013)对 (0.147±0.015) Bq， P<0.01]。
2.2 剪切作用对EC-CM中SMC合成胶原的影响 SMC在不同切应力作用后的EC-CM中培养24 h后，细胞合成2,3-3H-羟脯氨酸的量和分泌的胶原量，随切应力的增大而减少(表1)。
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表1 切应力作用对EC-CM中SMC(×103)
胶原合成量的影响
Tab 1 Effect of hemodynamic shear forces on modulation
of SMC (×103)collagen synthesis in culture medium
conditioned with endothelial cells
(n=6,
±s, A/Bq) Shear(τ/mN.cm-2), 百拇医药
Cell
In EC-CM
0
1.31±0.123▲▲
0.147±0.015▲▲
0.10
0.844±0.081△△
0.101±0.026△△
0.15
0.609±0.099**
, 百拇医药 0.077±0.010**
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0.466±0.067
0.041±0.004
**P<0.01 vs 0.25 mN/cm2; △△P<0.01 vs 0.15 mN/cm2; ▲▲P<0.01 vs 0.10 mN/cm2
3 讨论
EC和SMC是构成血管壁的两种主体细胞，两者之间存在着结构和体液性联系，前者可通过合成和分泌多种生物活性因子，调节SMC的舒缩、增殖和细胞外基质的合成。胶原是主要的细胞外基质之一，以往国内外的研究和本实验结果均提示，在静息状态下培养的EC-CM能促使胶原的合成[3]。
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血管壁胶原含量受血液环境多种因素的影响，其中血液流动作用于血管壁的机械刺激参与调节血管壁结构，局部血流环境的紊乱参与许多血管疾病的病理生理过程。机械应力包括侧向的压力和牵张力以及切向的切应力。Nathalie[4]和Tozzi[5]研究发现，血管壁中合成胶原的能力与所受压力和牵张力密切相关，其生理效应有赖于血管壁内皮的完整性，然而切应力的变化与胶原合成的关系尚未见报道。
切应力是血流流经血管作用于内膜的摩擦力，只对EC具有生理效应，在正常生理条件下大血管中内皮所受的切应力为0.20～0.25 mN/cm2。目前尚缺乏在体研究切应力的生理效应的手段。我们采用离体的平行平板流动腔模型模拟产生切应力，比较SMC在不同切应力作用后的EC-CM中合成胶原量的变化，以反映切应力变化对血管壁中胶原含量的影响。 结果发现，在生理范围内，随所受切应力的减小， EC-CM中SMC 胶原合成增加，由此我们推断血管局部血流速度的减缓使血管壁胶原沉积增多。但由于实验条件的限制，还不能研究切应力在超过生理范围时，其对血管壁胶原含量的影响。
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以往的研究发现，切应力参与EC内多种活性因子基因表达的调节，这些活性因子又参与调节SMC胶原的合成[6,7]。因此，血管局部血流速度的减缓引起血管壁胶原沉积，可能与EC生长促进因子合成减少和(或)生长抑制因子合成增多有关。
作者简介：韩林，男，1968年9月生，博士，主治医师
参考文献
1 Dzau VJ. Vascular remodeling: mechanisms and implications[J]. J Cardiovas Pharm，1993,21(Suppl 1):S1
2 韩 林，张宝仁，柳兆荣,等. 稳态层流下的内皮细胞形态特征变化[J]. 第二军医大学学报，1999，20(10)：801
3 但清宏，黄元伟，楼定安. 内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞合成胶原的影响[J]. 中国病理生理学杂志，1993,9(3):498
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4 Nathalie B, Karillon GJ, Merval R,et al. Differential effects of pressure and flow on DNA and protein synthesis and on fibronectin expression by arteries and a novel organ culture system[J]. Circ Res,1995,77(2):684
5 Tozzi CA. Pressure-induced connective tissue synthesis in pulmonary artery segments is dependent on intace endothelium[J]. J Clin Invest,1989,84(4):1005
6 Malek AM. Physiological fluid shear stress cause downregulation of endothelin-1 mRNA in bovine aortic endothelium[J]. Am J Physiol,1992,263(1): C38
7 Malek AM. Fluid shear stress differentially modulates expression of genes encoding basic fibroblast growth factors and platelet-derived growth B chain in vascular endothelium[J]. J Clin Invest, 1993,92(8):2013
(1999-05-11收稿，1999-09-10修回), 百拇医药