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编号:10214336
壳多糖对兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响*
http://www.100md.com 《第二军医大学学报》 1999年第12期
     作者:王大新 吴宗贵 周 斌 姜远英 殷 明

    单位:第二军医大学长征医院心血管内科,上海,200003;周 斌 姜远英 殷 明 第二军大学药学院药理学教研室

    关键词:壳多糖;平滑肌细胞;内皮细胞

    第二军医大学学报991209 摘要 目的: 研究壳多糖对体外培养的兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法:将不同质量浓度(0.2,2,20,200,2 000 μg/ml)的壳多糖溶液分别加入兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞培养液中,培养12,24,48 h后用MTT比色法测定细胞数。结果:平滑肌细胞数随着壳多糖质量浓度和作用时间的增加而减少;内皮细胞数随着其质量浓度和作用时间的增加,在一定范围内相应增加。结论:壳多糖能抑制兔主动脉平滑肌细胞增殖,促进兔主动脉内皮细胞生长。

    中图分类号 R 541.4 文章编号:0258-879X(1999)12-0962-03 文献标识码:A
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    Effects of chitin on the proliferation of rabbit aortic smooth muscle and endothelial cells

    Wang Daxin, Wu Zonggui, Zhou Bin, Jiang Yuanying,Yin Ming

    (Department of Cardiovasology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)

    ABSTRACT Objective: To study the effects of chitin on cultured rabbit aortic smooth muscle cells and endothelial cells. Methods: After various concentrations of chitin were added into cultured rabbit aortic smooth muscle and endothelial cells, the survey cell number were determinated by MTT colorimetric method at 12 h, 24 h and 48 h. Results: With increase of chitin concentration and action time, the number of smooth muscle cells increased and the endothelial cells reduced. Conclusion: Chitin may inhibit rabbit aortic smooth muscle cells proliferation and promote endothelial cells growth.
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    KEY WORDS chitin; smooth muscle cells; endothelial cells

    [Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 962~964]

    壳多糖(几丁质)是从虾蟹外壳中提取的天然高分子化合物,在强碱环境下脱N-乙酰后衍生为氨基葡萄糖多聚体,化学结构为β-(1-4)-2-脱氧-D-葡糖。壳多糖是高分子不规范化合物,其相对分子质量为90~120万,经提炼后的壳多糖相对分子质量为50~70万,平均60万。作为一种生物相容性良好的新型医用生物材料,体外实验和临床应用表明,壳多糖具有选择性抑制人成纤维细胞和促进表皮细胞生长的独特生物活性[1]。 本实验旨在证实壳多糖溶液在体外环境下对兔主动脉平滑肌和内皮细胞的影响,为壳多糖在临床用于防治经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄提供实验依据。

, http://www.100md.com     1 材料和方法

    1.1 材料 实验药品:2%壳多糖,上海其胜生物材料技术研究所提供(批号981102)。实验动物:体质量2.5 kg左右的雄性新西兰纯种兔, 第二军医大学实验动物中心提供。主要试剂:DMEM培养基、胰蛋白酶(活力1∶250) 均为Gibco 公司产品; 小牛血清(NBS)为上海实生细胞生物技术公司产品;胶原酶Ⅱ型为Sigma公司产品;鼠抗人α-actin抗体(单抗)、羊抗鼠IgG-FITC均为上海华美生物公司产品;四唑盐(MTT)溶液为瑞典Fluka公司产品;鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体为丹麦Dako公司产品。

    1.2 细胞培养 血管平滑肌细胞培养:按Hirata等[2]组织贴块法进行。血管内皮细胞培养:参照盛民立等[3]方法。细胞长成致密单层后加入0.1%胰酶1 ml,37℃消化1~2 min,加入含20%NBS的DMEM培养液终止消化,用球形滴管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于培养液中,以1∶2比例传代,每3 d换液1次,长成致密单层(5~7 d) 可再次传代。
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    1.3 细胞鉴定

    1.3.1 平滑肌细胞鉴定 (1)倒置相差显微镜下观察:细胞长满瓶底时可见平滑肌细胞典型的生长方式,即细胞呈梭形,平行生长,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状,峰处为多层细胞,谷处为单层或双层细胞。(2)免疫组织化学方法:取3~5代细胞按104个/ml接种入小培养瓶中;孵育48 h后用95%乙醇浸泡固定细胞30 min(4℃);加入鼠抗人α-actin抗体,孵育2 h后滴加二抗荧光IgG-FITC,4℃下放置30 min; 细胞经漂洗后置于荧光显微镜下, 负载了FITC的细胞经500 nm的波长激发下产生荧光,可见95% 以上的细胞显示了阳性荧光标记,说明为平滑肌细胞。

    1.3.2 内皮细胞鉴定 (1)倒置相差显微镜下观察:细胞呈卵石样排列;传代细胞5 h左右开始贴壁,24 h大部分细胞贴壁生长,细胞由圆形变为多角形,折光性强,5~7 d可长成致密单层。(2)免疫荧光染色鉴定,参照Jaffe法[7],用鼠抗人Ⅷ因子相关抗原抗血清与羊抗兔IgG荧光抗体进行免疫荧光鉴定,细胞均被染成亮黄色荧光,证明该细胞上存在内皮细胞特征的Ⅷ因子抗原,为内皮细胞。
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    1.4 细胞计数 用MTT比色试验测定各孔光密度(D)值,以此代表细胞数量。方法: 0.1%胰酶消化细胞,制成5×104个/ml细胞悬液,接种入24孔培养液中,每孔0.5 ml细胞悬液,孵育24 h后换成含5% NBS的DMEM培养液,48 h后换成含20%NBS的DMEM培养液,同时加入药物(质量浓度分别为0.2,2,20,200,2 000 μg/ml的壳多糖),另设不加药物的对照。继续孵育至60,72和96 h后终止培养; 尔后加入50 μl MTT(浓度为5 mg/ml),孵育4 h后取出,弃去培养液和MTT,每孔加入0.5 ml异丙醇(含0.1 mol/L HCl),放置4 min,使MTT结晶溶解,然后在酶标分析仪上595 nm处测D值。

    1.5 统计学处理 所有数据均以±s表示,以Microsoft Excel 97软件行方差分析。
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    2 结果

    2.1 壳多糖对血管平滑肌细胞增殖的影响 倒置相差显微镜下见无壳多糖溶液的空白对照组细胞数量多、生长旺盛;在有壳多糖溶液的板孔中,细胞数相对减少,生长受抑制,随着壳多糖质量浓度和作用时间的增加,细胞数愈来愈少。MTT比色试验测定的结果见图1。5个剂量组的壳多糖溶液均明显抑制NBS诱导的血管平滑肌细胞增殖作用,且呈量效和时效关系。

    图1 不同质量浓度壳多糖对平滑肌细胞增殖的影响

    Fig 1 Effects of various concentrations of chitin

    on proliferation of smooth muscle cells
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    ▲:12 h; ■: 24 h; ●: 48 h

    n=3,±s;**P<0.01 vs control group

    2.2 壳多糖对血管内皮细胞增殖的影响 倒置相差显微镜下见内皮细胞生长情况与平滑肌细胞正好相反:在空白对照组,细胞数量较少,细胞生长正常;在有壳多糖的实验组,12 h和24 h与对照组比较无显著差异;而在48 h后,随着壳多糖浓度的增加,细胞数量增多,细胞生长旺盛。MTT比色试验测定的结果见图2,有明显的量效和时效关系。

    图2 不同质量浓度壳多糖对内皮细胞增殖的影响

    Fig 2 Effects of various concentrations of chitin
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    on proliferation of endothelial cells

    ▲:12 h; ■: 24 h; ●: 48 h

    n=3,±s;**P<0.01 vs control group

    3 讨论

    PTCA后再狭窄的发生可能是多种因素共同作用的结果。内皮细胞的损伤是再狭窄的启动因素,它不仅可以促进血管局部血栓的形成,还可释放血管活性物质,进而启动和引起一系列血管损伤和修复反应。内皮细胞屏障保护功能的破坏,导致单核-巨噬细胞和T淋巴细胞附着及向内膜下浸润,合成和分泌多种细胞因子、生长因子和趋化因子等,从而引起局部的炎症反应。血管成形术后24~72 h血管平滑肌细胞即开始增殖、向内膜下迁移和再增殖。细胞外基质主要是由增生的血管平滑肌细胞和成纤维细胞所分泌,含有胶原、弹力纤维、纤连蛋白和层粘连蛋白等。因此血管再塑是内膜损伤后血管修复反应的结果,是产生再狭窄的根本原因,它不仅包括血管壁结构的改变而引起血管的阻塞,而且再塑后的血管反应性亦发生明显变化,其反应性降低,收缩功能增加,舒张反应降低, 分泌功能旺盛[4~6]。壳多糖为一种天然高分子化合物,无毒副作用。 因其本身所含的复杂的空间结构而表现出许多生物活性。壳多糖可抑制成纤维细胞生长和促进表皮细胞生长[1], 因此设想壳多糖亦对平滑肌细胞增殖具有抑制作用和对内皮细胞生长则有促进作用,从而防治再狭窄的发生。目前国内外尚无文献报道壳多糖对平滑肌细胞和内皮细胞的作用,亦无对动脉球囊损伤后再狭窄的研究。
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    生长因子(如PDGF、EGF、TGFβ等)、活性代谢物(PAF等)是促进血管平滑肌细胞增殖的主要因素,与再狭窄的形成密切相关[2,7]。本实验采用含多种生长因子的高浓度NBS作为刺激剂,在血管平滑肌细胞增殖的基础上, 加用壳多糖后细胞计数明显低于对照组,说明壳多糖可抑制NBS引起的血管平滑肌细胞增殖。

    血管内皮细胞对于维持血管正常的生理状态具有极其重要意义,内皮细胞的损伤是再狭窄的启动因素。平滑肌细胞增生、向内膜下迁移是再狭窄的核心和主要特点,向而内膜下迁移的首要步骤是白细胞粘附于血管内皮。内皮细胞表达粘附分子并与单核细胞发生粘附是内皮细胞功能受损而处于激活状态的表现之一,也是再狭窄发生的主要步骤。本实验证实壳多糖可促进内皮细胞生长,从而预防或减轻PTCA 后再狭窄的发生。

    至于壳多糖抑制血管平滑肌细胞增殖和促进内皮细胞生长的机制如何,将是下一步实验需解决的问题。

, http://www.100md.com     *国家自然科学基金资助项目,批准号39670316

    作者简介:王大新,男,1962年1月生,博士,主治医师

    参考文献

    1 盛志坚,侯春林.壳多糖影响体外细胞生长的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,1993,7(4):244

    2 Tirata Y, Taragi Y, Takata S. CGRP recepter in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Common,1988,151(11):1113

    3 盛民立. 血管内皮细胞培养及鉴定[J].上海医科大学学报,1987,14(1):71
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    4 高 炜,霍 勇,朱国英,等.再狭窄的细胞和分子生物学.中国介入心脏病学杂志,1997,5(2):84

    5 Bauriedel G, Windstetter U,DeMaio SJ,et al.Migratory activity of human smooth muscle cells cultured from coronary and peripheral primary and restenotic lesions removed by percutaneous atherectomy[J]. Circulation, 1992,85(6):554

    6 Yang HP. Study of c-sis and c-myc expression in arterial smooth muscle cells of different phenotypes[J]. Chin Med Sci J, 1991,6(3):117

    7 Raisanen A, Mennander A, Ustinor J, et al. PAF-receptor blocks on SMC replication in vitro and allograft arteriosclerosis in vivo[J]. Transplant,1993,6(5):251

    (1999-07-15收稿,1999-10-29修回), 百拇医药