内皮素A受体在oxLDL促血管平滑肌细胞增殖中的作用*
作者：荆 清 秦永文 沈 茜 张国元 吴宗贵
单位：第二军大学长海医院心血管内科，上海，200433；沈茜 第二军医大学长海医院实验诊断科；张国元 吴宗贵 第二军医大学长征医院心血管内科
关键词：受体；内皮素；脂蛋白类；LDL；血管平滑肌细胞；增殖
摘要 目的摘要 目的：研究氧化低密度脂蛋白(oxLDL)对培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中内皮素受体A亚型(ETRA) mRNA表达水平的影响。方法：Cu2+氧化法制备oxLDL，观察oxLDL对大鼠主动脉VSMC增殖和ETRA mRNA表达的影响。将VSMC用非肽类ETRA拮抗剂BMS-182874预处理后，加入10 μg/ml oxLDL温育24 h。采用非核素MTS吸光度法测定细胞增殖，RNA印迹法检测ETRA mRNA水平。结果：低浓度oxLDL促进VSMC增殖，高浓度引起细胞毒作用；oxLDL升高ETRA mRNA水平；ETRA拮抗剂BMS-182874明显抑制oxLDL引起的增殖作用。结论：动脉粥样硬化形成中有ETRA参与，ETRA拮抗剂可能具有临床应用价值。
, 百拇医药
中图分类号 R 541.4 文章编号：0258-879X(1999)12-0941-03 文献标识码：A
Effect of endothelin subtype-A receptor in vascular smooth muscle cells proliferation evoked by oxidized low-density lipoprotein
Jing Qing, Qin Yongwen, Shen Qian, Zhang Guoyuan, Wu Zonggui
(Department of Cardiovasology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effects of endothelin and its receptors in the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) in the intima of arteries stimulated by oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). Methods: Aortic rabbit SMC were grown in 20% and then 0.5% newborn calf serum. Then cells were incubated with different concentrations of LDL or oxLDL (oxidation of LDL was induced by incubation with Cu2+) for 24 h, and pretreated with different concentrations of selective non-peptide ETRA antagonist BMS-182874 followed by incubation with 10 μg/ml oxLDL for 24 h. Cell proliferation was measured by non-radioactive MTS absorbance at 490 nm. ETRA mRNA expression levels of VSMC incubated with oxLDL were also performed by Northern blot. Results: Low levels of oxLDL had significantly proliferative effect on VSMC, while high levels of which had cytotoxic effect. oxLDL increased ETRA mRNA expression levels of VSMC. BMS-182874 significantly inhibited the proliferative response of VSMC evoked by oxLDL. Conclusion: ETRA may be involved in atherogenesis. Selective non-peptide ETRA antagonist BMS-182874 may potentially have clinical implication.
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KEY WORDS receptors, endothelin; lipoproteins, LDL; vascular smooth muscle cells; proliferation
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 941～943]
动脉粥样硬化(AS)是心血管系统中最常见的疾病之一，目前对其发病机制尚未完全阐明。内皮素(ET)为一含21个氨基酸的多肽家族[1,2]，研究发现，它通过特异性受体亚型发挥了强烈的血管活性作用和促细胞分裂效应。近年来的研究表明ET及其受体在AS中也具有一定的作用[3,4]。本研究以氧化低密度脂蛋白(oxLDL)促血管平滑肌细胞(VSMC)增殖作为AS的细胞模型，以选择性内皮素受体A亚型(ETRA)非肽类拮抗剂BMS-182874作代表药物，以期了解内皮素及ETRA在AS形成中的作用，并探讨BMS-182874的临床应用前景。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 IMDM培养基：美国Gibco BRL公司产品；四唑盐MTS [3-(4, 5-dimethylthiazol-2 - yl) - 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) - 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium]细胞增殖测定试剂盒：美国Promega公司；低密度脂蛋白(LDL)：美国Sigma公司；ET-1：美国Peninsula公司；BMS-182874：由美国Bristol-Myers Squibb药物研究所Moreland博士提供。
1.2 oxLDL的制备与鉴定 LDL溶于PBS，加入灭菌CuSO4溶液至终浓度为5 μmol/L，37℃温育24 h，制备oxLDL，经0.4%琼脂糖凝胶电泳，苏丹黑B染色后观察迁移率以验证氧化程度。
1.3 细胞培养 采用组织贴块法原代培养兔主动脉VSMC，并经VSMC典型的光镜、电镜形态学特征及抗β-肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性鉴定。实验用4～8代细胞，静止期及指数生长期VSMC分别采用含0.5%和20%小牛血清IMDM进行培养。
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1.4 细胞增殖测定 通过测定四唑盐MTS在活细胞线粒体中的代谢率(490 nm处的光密度)来反映存活的细胞数。
1.5 培养上清液LDH活性测定 采用LDH活性检测试剂盒(宝灵曼公司)测定，按说明书步骤进行。
1.6 RNA印迹法检测 采用Qiagen公司RNeasy试剂盒提取总RNA，按所附说明书步骤进行。总RNA经1%甲醛变性胶电泳，电转移至尼龙膜，采用DIG标记试剂盒(宝灵曼公司)标记ETRA cDNA探针杂交，NBT-BCIP显色。
1.7 统计学处理 数据用
±s表示，资料采用方差分析，SNK法两两比较。
, 百拇医药 2 结果
2.1 oxLDL对VSMC的增殖和细胞毒作用 不同剂量oxLDL与VSMC温育24 h后，oxLDL在低剂量(5～10 μg/ml)时显著刺激细胞增殖(图1A)；在高剂量(50～100 μg/ml)时活细胞明显减少，LDH释放增加，表明对细胞产生明显的细胞毒作用(图1B)。而各浓度的LDL对培养的VSMC无明显作用，细胞生长形态也未见明显变化。提示LDL对VSMC的增殖无明显的作用。
图1 oxLDL对VSMC的增殖作用(A)和细胞毒作用(B)
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Fig 1 Effect of oxLDL on VSMC proliferation (A) and cytotoxicity (B)
□: LDL； ■: oxLDL; *P<0.05, **P<0.01 vs control (0); n=3,±s
2.2 BMS-182874对oxLDL促VSMC增殖作用的影响 培养细胞经同步后，分别预先加入含0.1, 1, 10, 100 μmol BMS-182874的培养液，30 min后每孔再各加入10 μg/ml的oxLDL，经培养24 h后，上述oxLDL的促增殖作用则呈剂量依赖性地受到明显抑制，D(490)分别为(1.02±0.16)，(0.93±0.11)，(0.55±0.07),(0.35±0.08)。
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2.3 oxLDL对VSMC的ETRA mRNA表达水平的影响 RNA印迹法分析表明，以内参照GAPDH为标志，10 μg/ml的oxLDL组作用于VSMC 24 h后，ETRA的mRNA表达水平较空白对照组显著上升(图2)。
图2 VSMC ETRA mRNA的表达(RNA印迹法)
Fig 2 Expression of ETRA mRNA (Northern blotting)
A: oxLDL； B: Control
3 讨论
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近年来研究表明，oxLDL与AS的形成和发展具有非常密切的关系[5]。oxLDL能强烈地促进VSMC由中膜向内膜下迁移并不断增殖，这就导致在AS形成过程中血管壁增厚、管腔变窄。VSMC的增殖是AS发生发展中病理生理变化的重要组成部分。在致病因素的作用下，VSMC产生了表型的转化并增殖，已有研究表明在此过程中有多种生长因子、细胞因子参与了调控作用。其中促进VSMC增殖的生长因子有血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、白介素2(IL-2)、胰岛素和胰岛素样生长因子-1，抑制VSMC增殖的生长因子主要有转化生长因子β，IL-1和干扰素γ等。近年来研究发现ET具有强烈的促细胞有丝分裂作用，对VSMC能够产生明显的促增殖效应。ET具有的调节血管张力和促细胞有丝分裂等生物学活性提示了ET在AS形成中有潜在作用。已经发现AS的患者血浆ET水平升高，在人AS斑块中测得ETRA和ETRB mRNA的表达。在体外实验中，oxLDL刺激内皮细胞、巨噬细胞释放ET-1，并能引起ET-1 mRNA的表达，但对ET受体的影响未见报道。
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本研究结果证实了低浓度oxLDL对VSMC的促增殖作用，高浓度的oxLDL则产生细胞毒作用，而LDL则对VSMC无促增殖作用。进一步研究发现，oxLDL在促VSMC增殖中，促进VSMC的ETRA mRNA水平的表达；而选择性ETRA拮抗剂BMS-182874具有抑制oxLDL促VSMC增殖的作用。本研究结果表明ETRA直接参与了oxLDL促VSMC增殖。推测其机制可能是oxLDL刺激细胞产生ET，通过自分泌或旁分泌形式进而作用于自身细胞的ETRA，激活ET系统；同时也可能直接刺激ETRA的mRNA表达水平增加，从而使ETRA的密度上调，进一步通过ETRA的途径刺激VSMC增殖。提示了oxLDL促VSMC增殖作用中，ETRA受体亚型途径至少是一个重要的组成部分。BMS-182874为新发现的选择性ETRA非肽类拮抗剂[6]，属于萘磺胺类结构物质，能竞争性抑制125I-ET-1与大鼠VSMC上ETRA的结合(Ki=61 nmol/L)，但对ETRB(Ki>50 μmol/L)和非ET类受体的抑制作用很弱。BMS-182874能够抑制oxLDL的促VSMC增殖作用，而BMS-182874对ETRB的拮抗作用很弱，这也提示oxLDL的促VSMC增殖作用可能不是通过ETRB途径。当然对ETRB的确切结论有待深入研究。我们的结果提示BMS-182874在抗AS中具有一定的意义。由于是非肽类物质，BMS-182874口服给药经胃肠道不易被降解，且吸收良好，因此BMS-182874可能具有临床应用前景。
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*国家自然科学基金资助项目,批准号3960063
作者简介：荆清，男，1965年11月生博士，主治医师
参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells[J]. Nature， 1988, 332(6163): 411
2 Arai H, Hori S, Aramori I, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding an endothelin receptor[J]. Nature, 1990, 348(6303): 730
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3 Warner TD, Elliott JD, Ohlstein EH. California dreaming about endothelin: emerging new therapeutics[J]. Trends Pharmacol Sci, 1996, 17(5): 177
4 荆 清，张国元. 内皮素及其受体与动脉粥样硬化[J]. 中国动脉粥样硬化杂志，1997, 5(2): 172
5 Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, et al. Atherosclerosis: basic mechanisms: oxidation, inflammation, and genetics[J]. Circulation, 1995, 91(9): 2488
6 Webb ML, Bird JE, Liu EC, et al. BMS-182874 is a selective, nonpeptide endothelin ETA receptor antagonist[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 272(3): 1124
(1999-05-11收稿，1999-09-20修回), 百拇医药
单位：第二军大学长海医院心血管内科，上海，200433；沈茜 第二军医大学长海医院实验诊断科；张国元 吴宗贵 第二军医大学长征医院心血管内科
关键词：受体；内皮素；脂蛋白类；LDL；血管平滑肌细胞；增殖
摘要 目的摘要 目的：研究氧化低密度脂蛋白(oxLDL)对培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中内皮素受体A亚型(ETRA) mRNA表达水平的影响。方法：Cu2+氧化法制备oxLDL，观察oxLDL对大鼠主动脉VSMC增殖和ETRA mRNA表达的影响。将VSMC用非肽类ETRA拮抗剂BMS-182874预处理后，加入10 μg/ml oxLDL温育24 h。采用非核素MTS吸光度法测定细胞增殖，RNA印迹法检测ETRA mRNA水平。结果：低浓度oxLDL促进VSMC增殖，高浓度引起细胞毒作用；oxLDL升高ETRA mRNA水平；ETRA拮抗剂BMS-182874明显抑制oxLDL引起的增殖作用。结论：动脉粥样硬化形成中有ETRA参与，ETRA拮抗剂可能具有临床应用价值。
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中图分类号 R 541.4 文章编号：0258-879X(1999)12-0941-03 文献标识码：A
Effect of endothelin subtype-A receptor in vascular smooth muscle cells proliferation evoked by oxidized low-density lipoprotein
Jing Qing, Qin Yongwen, Shen Qian, Zhang Guoyuan, Wu Zonggui
(Department of Cardiovasology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effects of endothelin and its receptors in the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) in the intima of arteries stimulated by oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). Methods: Aortic rabbit SMC were grown in 20% and then 0.5% newborn calf serum. Then cells were incubated with different concentrations of LDL or oxLDL (oxidation of LDL was induced by incubation with Cu2+) for 24 h, and pretreated with different concentrations of selective non-peptide ETRA antagonist BMS-182874 followed by incubation with 10 μg/ml oxLDL for 24 h. Cell proliferation was measured by non-radioactive MTS absorbance at 490 nm. ETRA mRNA expression levels of VSMC incubated with oxLDL were also performed by Northern blot. Results: Low levels of oxLDL had significantly proliferative effect on VSMC, while high levels of which had cytotoxic effect. oxLDL increased ETRA mRNA expression levels of VSMC. BMS-182874 significantly inhibited the proliferative response of VSMC evoked by oxLDL. Conclusion: ETRA may be involved in atherogenesis. Selective non-peptide ETRA antagonist BMS-182874 may potentially have clinical implication.
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KEY WORDS receptors, endothelin; lipoproteins, LDL; vascular smooth muscle cells; proliferation
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 941～943]
动脉粥样硬化(AS)是心血管系统中最常见的疾病之一，目前对其发病机制尚未完全阐明。内皮素(ET)为一含21个氨基酸的多肽家族[1,2]，研究发现，它通过特异性受体亚型发挥了强烈的血管活性作用和促细胞分裂效应。近年来的研究表明ET及其受体在AS中也具有一定的作用[3,4]。本研究以氧化低密度脂蛋白(oxLDL)促血管平滑肌细胞(VSMC)增殖作为AS的细胞模型，以选择性内皮素受体A亚型(ETRA)非肽类拮抗剂BMS-182874作代表药物，以期了解内皮素及ETRA在AS形成中的作用，并探讨BMS-182874的临床应用前景。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 IMDM培养基：美国Gibco BRL公司产品；四唑盐MTS [3-(4, 5-dimethylthiazol-2 - yl) - 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) - 2 - (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium]细胞增殖测定试剂盒：美国Promega公司；低密度脂蛋白(LDL)：美国Sigma公司；ET-1：美国Peninsula公司；BMS-182874：由美国Bristol-Myers Squibb药物研究所Moreland博士提供。
1.2 oxLDL的制备与鉴定 LDL溶于PBS，加入灭菌CuSO4溶液至终浓度为5 μmol/L，37℃温育24 h，制备oxLDL，经0.4%琼脂糖凝胶电泳，苏丹黑B染色后观察迁移率以验证氧化程度。
1.3 细胞培养 采用组织贴块法原代培养兔主动脉VSMC，并经VSMC典型的光镜、电镜形态学特征及抗β-肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性鉴定。实验用4～8代细胞，静止期及指数生长期VSMC分别采用含0.5%和20%小牛血清IMDM进行培养。
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1.4 细胞增殖测定 通过测定四唑盐MTS在活细胞线粒体中的代谢率(490 nm处的光密度)来反映存活的细胞数。
1.5 培养上清液LDH活性测定 采用LDH活性检测试剂盒(宝灵曼公司)测定，按说明书步骤进行。
1.6 RNA印迹法检测 采用Qiagen公司RNeasy试剂盒提取总RNA，按所附说明书步骤进行。总RNA经1%甲醛变性胶电泳，电转移至尼龙膜，采用DIG标记试剂盒(宝灵曼公司)标记ETRA cDNA探针杂交，NBT-BCIP显色。
1.7 统计学处理 数据用
±s表示，资料采用方差分析，SNK法两两比较。, 百拇医药 2 结果
2.1 oxLDL对VSMC的增殖和细胞毒作用 不同剂量oxLDL与VSMC温育24 h后，oxLDL在低剂量(5～10 μg/ml)时显著刺激细胞增殖(图1A)；在高剂量(50～100 μg/ml)时活细胞明显减少，LDH释放增加，表明对细胞产生明显的细胞毒作用(图1B)。而各浓度的LDL对培养的VSMC无明显作用，细胞生长形态也未见明显变化。提示LDL对VSMC的增殖无明显的作用。
图1 oxLDL对VSMC的增殖作用(A)和细胞毒作用(B)
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Fig 1 Effect of oxLDL on VSMC proliferation (A) and cytotoxicity (B)
□: LDL； ■: oxLDL; *P<0.05, **P<0.01 vs control (0); n=3,
±s2.2 BMS-182874对oxLDL促VSMC增殖作用的影响 培养细胞经同步后，分别预先加入含0.1, 1, 10, 100 μmol BMS-182874的培养液，30 min后每孔再各加入10 μg/ml的oxLDL，经培养24 h后，上述oxLDL的促增殖作用则呈剂量依赖性地受到明显抑制，D(490)分别为(1.02±0.16)，(0.93±0.11)，(0.55±0.07),(0.35±0.08)。
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2.3 oxLDL对VSMC的ETRA mRNA表达水平的影响 RNA印迹法分析表明，以内参照GAPDH为标志，10 μg/ml的oxLDL组作用于VSMC 24 h后，ETRA的mRNA表达水平较空白对照组显著上升(图2)。
图2 VSMC ETRA mRNA的表达(RNA印迹法)
Fig 2 Expression of ETRA mRNA (Northern blotting)
A: oxLDL； B: Control
3 讨论
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近年来研究表明，oxLDL与AS的形成和发展具有非常密切的关系[5]。oxLDL能强烈地促进VSMC由中膜向内膜下迁移并不断增殖，这就导致在AS形成过程中血管壁增厚、管腔变窄。VSMC的增殖是AS发生发展中病理生理变化的重要组成部分。在致病因素的作用下，VSMC产生了表型的转化并增殖，已有研究表明在此过程中有多种生长因子、细胞因子参与了调控作用。其中促进VSMC增殖的生长因子有血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、白介素2(IL-2)、胰岛素和胰岛素样生长因子-1，抑制VSMC增殖的生长因子主要有转化生长因子β，IL-1和干扰素γ等。近年来研究发现ET具有强烈的促细胞有丝分裂作用，对VSMC能够产生明显的促增殖效应。ET具有的调节血管张力和促细胞有丝分裂等生物学活性提示了ET在AS形成中有潜在作用。已经发现AS的患者血浆ET水平升高，在人AS斑块中测得ETRA和ETRB mRNA的表达。在体外实验中，oxLDL刺激内皮细胞、巨噬细胞释放ET-1，并能引起ET-1 mRNA的表达，但对ET受体的影响未见报道。
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本研究结果证实了低浓度oxLDL对VSMC的促增殖作用，高浓度的oxLDL则产生细胞毒作用，而LDL则对VSMC无促增殖作用。进一步研究发现，oxLDL在促VSMC增殖中，促进VSMC的ETRA mRNA水平的表达；而选择性ETRA拮抗剂BMS-182874具有抑制oxLDL促VSMC增殖的作用。本研究结果表明ETRA直接参与了oxLDL促VSMC增殖。推测其机制可能是oxLDL刺激细胞产生ET，通过自分泌或旁分泌形式进而作用于自身细胞的ETRA，激活ET系统；同时也可能直接刺激ETRA的mRNA表达水平增加，从而使ETRA的密度上调，进一步通过ETRA的途径刺激VSMC增殖。提示了oxLDL促VSMC增殖作用中，ETRA受体亚型途径至少是一个重要的组成部分。BMS-182874为新发现的选择性ETRA非肽类拮抗剂[6]，属于萘磺胺类结构物质，能竞争性抑制125I-ET-1与大鼠VSMC上ETRA的结合(Ki=61 nmol/L)，但对ETRB(Ki>50 μmol/L)和非ET类受体的抑制作用很弱。BMS-182874能够抑制oxLDL的促VSMC增殖作用，而BMS-182874对ETRB的拮抗作用很弱，这也提示oxLDL的促VSMC增殖作用可能不是通过ETRB途径。当然对ETRB的确切结论有待深入研究。我们的结果提示BMS-182874在抗AS中具有一定的意义。由于是非肽类物质，BMS-182874口服给药经胃肠道不易被降解，且吸收良好，因此BMS-182874可能具有临床应用前景。
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*国家自然科学基金资助项目,批准号3960063
作者简介：荆清，男，1965年11月生博士，主治医师
参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells[J]. Nature， 1988, 332(6163): 411
2 Arai H, Hori S, Aramori I, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding an endothelin receptor[J]. Nature, 1990, 348(6303): 730
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3 Warner TD, Elliott JD, Ohlstein EH. California dreaming about endothelin: emerging new therapeutics[J]. Trends Pharmacol Sci, 1996, 17(5): 177
4 荆 清，张国元. 内皮素及其受体与动脉粥样硬化[J]. 中国动脉粥样硬化杂志，1997, 5(2): 172
5 Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, et al. Atherosclerosis: basic mechanisms: oxidation, inflammation, and genetics[J]. Circulation, 1995, 91(9): 2488
6 Webb ML, Bird JE, Liu EC, et al. BMS-182874 is a selective, nonpeptide endothelin ETA receptor antagonist[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 272(3): 1124
(1999-05-11收稿，1999-09-20修回), 百拇医药