肿瘤转移抑制基因nm23H1 mRNA在人非小细胞肺癌中的表达
作者：陈仕林 梅 举 张宝仁 朱家麟 叶玉坤 苏长青 汪 栋 邵 冲 张传生
单位：第二军医大学长海医院胸心版税，上海，200433；叶玉坤 苏长青 汪 栋 邵 冲 张传生 解放军第81医院胸心外科
关键词：肺癌；非小细胞；基因；nm23H1
第二军医大学学报991245 nm23H1是癌转移抑制基因，位于人17号染色体长臂(17q21)[1],其产物为相对分子质量1.7万的核苷二磷酸激酶(NDPK)，该基因表达水平与肺癌转移扩散及预后的关系尚无定论。我们应用原位杂交技术对nm23H1 mRNA在肺癌组织中的表达进行分析，以探讨其与临床病理的关系。
1 材料和方法
1.1 标本 搜集1993～1997年间157例手术切除的原发性肺癌组织标本。根据Naruke等肺癌淋巴结分布图对肺门、同侧纵隔淋巴结进行清扫，所有清扫淋巴结分别标记，病理证实后进行国际P-TNM分期。其中男94例，女63例，年龄35～68岁。鳞癌81例(Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期35例；中高分化32例，低分化49例)；腺癌76例(Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期43例；中高分化52例，低分化24例)；标本取材后均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。
, 百拇医药
1.2 探针及生物素标记试剂盒 nm23-H1 DNA探针及生物素标记试剂盒均为美国Sigma公司产品。
1.3 原位杂交 按常规进行[2] 。在石蜡切片上进行原位杂交。切片脱蜡至水，蔗糖PBS清洗，3 mg/L蛋白酶K(Sigma)消化；蔗糖PBS清洗，4%多聚甲醛固定5 min,脱水干燥。滴加预杂交液(50%去离子甲酰胺、2×SSC、 2×denhardt液、10%硫酸葡聚糖，4.0×107 U/L RNase、 0.5 g/L鲑精DNA、0.5 g/L酵母tRNA)，37℃ 60 min。以预杂交液配制0.5 mg/L的探针杂交液，变性后滴加到切片上，44℃杂交过夜；2×SSC(含50%去离子甲酰胺)洗，封闭液(pH 7.5的0.1 mol/LTBS液，含3%BSA、1 mmol/L EDTA)室温10 min；链菌素亲生物素-过氧化酶(1∶20)37℃孵育1 h，2×SSC和TBS清洗后，ABC显色。
, http://www.100md.com 1.4 对照设置 阴性对照以未加探针的切片及以RNase(Sigma)预先处理的切片进行同步杂交，阳性对照用正常人肺组织(包括癌周、非肿瘤性肺组织)，结果为弱阳性。
1.5 结果判断 原位杂交显示：nm23H1 mRNA阳性产物定位于胞质内，阳性结果均为蓝色颗粒或团块，据染色强度将染色结果分为3级：染色强度低于或相似于癌周正常组织为(-)；染色强度比癌周正常组织稍强者为(+)，部分肿瘤细胞内可见阳性颗粒；染色强度比癌周正常组织强者为(++)，绝大多数肿瘤细胞内阳性颗粒多且聚集成粗大颗粒。
1.6 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 nm23H1 mRNA在肺癌组织中的表达 nm23H1 mRNA在157例非小细胞肺癌组织中阳性表达率为53.5%(84/157)，鳞癌阳性表达率为43.2%(35/81)，腺癌阳性表达率为64.5%(49/76)，明显高于鳞癌(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 nm23H1 mRNA表达与肺癌P-TNM分期的关系 nm23H1 mRNA在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌组织中阳性表达率为62.0%(49/79)，Ⅲ～Ⅳ期为44.9%(35/78)，但无统计学意义(P>0.05)。其中腺癌Ⅰ～Ⅱ期阳性表达率为81.8%(27/33)，Ⅲ～Ⅳ期为51.2%(22/43)，相差不显著(P>0.05)；而鳞癌Ⅰ-Ⅱ期阳性表达率为47.8%(22/46)，Ⅲ～Ⅳ期为37.1%(13/35)，差异显著(P<0.05)。
2.3 nm23-H1 mRNA表达与肺癌淋巴结转移的关系 在无淋巴结转移的肺癌中，阳性表达率为60.8%(45/74)，高于有淋巴结转移者的47.0%(39/83)，但无统计学意义(P>0.05)。在无与有淋巴结转移的腺癌中阳性表达率分别为66.7%(30/45)、61.3%(19/31)，无显著差别(P>0.05)；在无淋巴结转移的鳞癌中阳性表达率为60.5%(26/43)，高于有淋巴结转移者[23.7%(9/38)]，差异显著(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 nm23H1 mRNA表达与肺癌分化程度的关系 nm23H1 mRNA在高、中分化癌中阳性表达率分别为80%(12/15)、66.67%(46/69)，明显高于低分化癌的27.4% (20/73)，相差显著(P<0.05)。
3 讨论
与癌细胞转移有关的nm23基因有nm23H1和nm23H2，其产物为NDPK A、B两种亚基[3]。在许多恶性肿瘤中，nm23基因表达降低与恶性肿瘤转移特性相关，但也有研究结果表明在某些实体瘤中nm23并不是转移的抑制基因[3]，这种不一致的报道说明对nm23的研究尚需深入。
本研究应用原位杂交技术发现在原发性肺鳞癌中nm23H1基因阳性表达率为43.2%，且与肺鳞癌淋巴结转移及P-TNM分期有关，在伴有淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期肺鳞癌中nm23H1 mRNA表达显著低下。说明nm23H1基因可能与肺鳞癌发生、肺鳞癌淋巴结转移及病程进展过程有关，其机制可能与其表达产物NDPK的生物活性高低有关。NDPK可直接影响微丝、微管等细胞骨架的积聚及DNA合成等，从而调控细胞的增殖与迁移；此外，尚可激活G蛋白而调节细胞信号传递，从而抑制癌细胞浸润转移。
, 百拇医药
在原发性肺腺癌中nm23H1基因阳性表达率显著高于肺鳞癌，且与肺腺癌有无淋巴结转移及P-TNM分期无关，这一结果显示在原发性肺腺癌中nm23H1并不具备抑制癌细胞形成及转移的作用。nm23H1基因之所以在不同组织类型肺癌中作用不同，可能与其状态不同及传递信号的途径不同有关。有研究证实nm23基因在不同细胞中与转录因子相结合的位点不同导致其调控方式的差异[3]。
本研究另一结果显示，nm23H1 mRNA表达水平与非小细胞肺癌分化程度有一定关系，随分化程度的降低而表达减弱，这可能与其基因突变、表达的蛋白结构或功能异常有关[5]。
有关nm23H1 mRNA表达水平与非小细胞肺癌淋巴结转移、病程进展、分化程度及预后关系的研究尚需从不同角度、不同层次深入进行。
中图分类号 R 734.2 文章编号：0258-879X(1999)12-1048-02 文献标识码：B
, http://www.100md.com
作者简介：陈仕林，男，1964年1月生，博士，主治医师
参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua A, Kopper I, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastastic potential[J]. J Natl Cancer Inst,1988,80(3):200
2 林万明.核酸探针杂交实验技术[M].北京：中国科学技术出版社，1991.105
3 Okada K,Urano T,Baba H, et al. Independent and differencial expression of two isotypes of human nm23:analysis of the promoter regions of the nm23H1 and nm23H2 genes[J].Oncogene,1996,13(9)：1937
4 Royds JA,Rees RC,Stephenson TJ. nm23: a metastasis suppresser gene?[J]. J Pathol,1994,173(2):211
5 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M,et al .Expression of nm23H1 RNA levels in human gastric cancer tissues[J].Cancer,1994,73(2):259
(1999-05-11收稿，1999-10-19修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院胸心版税，上海，200433；叶玉坤 苏长青 汪 栋 邵 冲 张传生 解放军第81医院胸心外科
关键词：肺癌；非小细胞；基因；nm23H1
第二军医大学学报991245 nm23H1是癌转移抑制基因，位于人17号染色体长臂(17q21)[1],其产物为相对分子质量1.7万的核苷二磷酸激酶(NDPK)，该基因表达水平与肺癌转移扩散及预后的关系尚无定论。我们应用原位杂交技术对nm23H1 mRNA在肺癌组织中的表达进行分析，以探讨其与临床病理的关系。
1 材料和方法
1.1 标本 搜集1993～1997年间157例手术切除的原发性肺癌组织标本。根据Naruke等肺癌淋巴结分布图对肺门、同侧纵隔淋巴结进行清扫，所有清扫淋巴结分别标记，病理证实后进行国际P-TNM分期。其中男94例，女63例，年龄35～68岁。鳞癌81例(Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ～Ⅳ期35例；中高分化32例，低分化49例)；腺癌76例(Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期43例；中高分化52例，低分化24例)；标本取材后均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。
, 百拇医药
1.2 探针及生物素标记试剂盒 nm23-H1 DNA探针及生物素标记试剂盒均为美国Sigma公司产品。
1.3 原位杂交 按常规进行[2] 。在石蜡切片上进行原位杂交。切片脱蜡至水，蔗糖PBS清洗，3 mg/L蛋白酶K(Sigma)消化；蔗糖PBS清洗，4%多聚甲醛固定5 min,脱水干燥。滴加预杂交液(50%去离子甲酰胺、2×SSC、 2×denhardt液、10%硫酸葡聚糖，4.0×107 U/L RNase、 0.5 g/L鲑精DNA、0.5 g/L酵母tRNA)，37℃ 60 min。以预杂交液配制0.5 mg/L的探针杂交液，变性后滴加到切片上，44℃杂交过夜；2×SSC(含50%去离子甲酰胺)洗，封闭液(pH 7.5的0.1 mol/LTBS液，含3%BSA、1 mmol/L EDTA)室温10 min；链菌素亲生物素-过氧化酶(1∶20)37℃孵育1 h，2×SSC和TBS清洗后，ABC显色。
, http://www.100md.com 1.4 对照设置 阴性对照以未加探针的切片及以RNase(Sigma)预先处理的切片进行同步杂交，阳性对照用正常人肺组织(包括癌周、非肿瘤性肺组织)，结果为弱阳性。
1.5 结果判断 原位杂交显示：nm23H1 mRNA阳性产物定位于胞质内，阳性结果均为蓝色颗粒或团块，据染色强度将染色结果分为3级：染色强度低于或相似于癌周正常组织为(-)；染色强度比癌周正常组织稍强者为(+)，部分肿瘤细胞内可见阳性颗粒；染色强度比癌周正常组织强者为(++)，绝大多数肿瘤细胞内阳性颗粒多且聚集成粗大颗粒。
1.6 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 nm23H1 mRNA在肺癌组织中的表达 nm23H1 mRNA在157例非小细胞肺癌组织中阳性表达率为53.5%(84/157)，鳞癌阳性表达率为43.2%(35/81)，腺癌阳性表达率为64.5%(49/76)，明显高于鳞癌(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 nm23H1 mRNA表达与肺癌P-TNM分期的关系 nm23H1 mRNA在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌组织中阳性表达率为62.0%(49/79)，Ⅲ～Ⅳ期为44.9%(35/78)，但无统计学意义(P>0.05)。其中腺癌Ⅰ～Ⅱ期阳性表达率为81.8%(27/33)，Ⅲ～Ⅳ期为51.2%(22/43)，相差不显著(P>0.05)；而鳞癌Ⅰ-Ⅱ期阳性表达率为47.8%(22/46)，Ⅲ～Ⅳ期为37.1%(13/35)，差异显著(P<0.05)。
2.3 nm23-H1 mRNA表达与肺癌淋巴结转移的关系 在无淋巴结转移的肺癌中，阳性表达率为60.8%(45/74)，高于有淋巴结转移者的47.0%(39/83)，但无统计学意义(P>0.05)。在无与有淋巴结转移的腺癌中阳性表达率分别为66.7%(30/45)、61.3%(19/31)，无显著差别(P>0.05)；在无淋巴结转移的鳞癌中阳性表达率为60.5%(26/43)，高于有淋巴结转移者[23.7%(9/38)]，差异显著(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 nm23H1 mRNA表达与肺癌分化程度的关系 nm23H1 mRNA在高、中分化癌中阳性表达率分别为80%(12/15)、66.67%(46/69)，明显高于低分化癌的27.4% (20/73)，相差显著(P<0.05)。
3 讨论
与癌细胞转移有关的nm23基因有nm23H1和nm23H2，其产物为NDPK A、B两种亚基[3]。在许多恶性肿瘤中，nm23基因表达降低与恶性肿瘤转移特性相关，但也有研究结果表明在某些实体瘤中nm23并不是转移的抑制基因[3]，这种不一致的报道说明对nm23的研究尚需深入。
本研究应用原位杂交技术发现在原发性肺鳞癌中nm23H1基因阳性表达率为43.2%，且与肺鳞癌淋巴结转移及P-TNM分期有关，在伴有淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期肺鳞癌中nm23H1 mRNA表达显著低下。说明nm23H1基因可能与肺鳞癌发生、肺鳞癌淋巴结转移及病程进展过程有关，其机制可能与其表达产物NDPK的生物活性高低有关。NDPK可直接影响微丝、微管等细胞骨架的积聚及DNA合成等，从而调控细胞的增殖与迁移；此外，尚可激活G蛋白而调节细胞信号传递，从而抑制癌细胞浸润转移。
, 百拇医药
在原发性肺腺癌中nm23H1基因阳性表达率显著高于肺鳞癌，且与肺腺癌有无淋巴结转移及P-TNM分期无关，这一结果显示在原发性肺腺癌中nm23H1并不具备抑制癌细胞形成及转移的作用。nm23H1基因之所以在不同组织类型肺癌中作用不同，可能与其状态不同及传递信号的途径不同有关。有研究证实nm23基因在不同细胞中与转录因子相结合的位点不同导致其调控方式的差异[3]。
本研究另一结果显示，nm23H1 mRNA表达水平与非小细胞肺癌分化程度有一定关系，随分化程度的降低而表达减弱，这可能与其基因突变、表达的蛋白结构或功能异常有关[5]。
有关nm23H1 mRNA表达水平与非小细胞肺癌淋巴结转移、病程进展、分化程度及预后关系的研究尚需从不同角度、不同层次深入进行。
中图分类号 R 734.2 文章编号：0258-879X(1999)12-1048-02 文献标识码：B
, http://www.100md.com
作者简介：陈仕林，男，1964年1月生，博士，主治医师
参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua A, Kopper I, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastastic potential[J]. J Natl Cancer Inst,1988,80(3):200
2 林万明.核酸探针杂交实验技术[M].北京：中国科学技术出版社，1991.105
3 Okada K,Urano T,Baba H, et al. Independent and differencial expression of two isotypes of human nm23:analysis of the promoter regions of the nm23H1 and nm23H2 genes[J].Oncogene,1996,13(9)：1937
4 Royds JA,Rees RC,Stephenson TJ. nm23: a metastasis suppresser gene?[J]. J Pathol,1994,173(2):211
5 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M,et al .Expression of nm23H1 RNA levels in human gastric cancer tissues[J].Cancer,1994,73(2):259
(1999-05-11收稿，1999-10-19修回), 百拇医药