明胶法分离外周血单核细胞*
作者：雷著斌 秦永文 沈 茜 荆 清
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；沈茜 第二军医大学长海医院实验诊断科
关键词：单核细胞；明胶；流式细胞术
外周血单核细胞在动脉粥样硬化
外周血单核细胞在动脉粥样硬化(AS)形成中起着重要的作用，但人们对AS中单核细胞作用的机制仍不完全清楚，甚至有相矛盾的文献报道，这可能是由于单核细胞提纯困难的缘故。单核细胞大约占外周血单个核细胞的10%～20%[1]。以往单核细胞的提纯方法经常会造成高比例的淋巴细胞污染。近几年来，人们发展了一些纯度较高的提纯方法，但费用昂贵。我们结合以往经验，摸索了一种价廉而简便的单核细胞提纯方法，现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 试剂和仪器 RPMI 1640为Gibco公司产品，内加10%小牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、链霉素各100 U/ml。人淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。A液：为5 mmol/L EDTA无钙、镁PBS液，内含10%小牛血清。CD14-FITC、小鼠IgG2a-FITC均为美国Pharmingen公司产品。碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。流式细胞仪、塑料细胞培养瓶均为美国Becton & Dickson公司产品。
1.2 塑料细胞培养瓶的准备 取 2%的明胶溶液10 ml，加入75 ml的细胞培养瓶。细胞培养瓶放置于37℃干燥的培养箱中温育7～10 d，然后完全吸净明胶液，并把细胞培养瓶置于37℃、干燥的培养箱中3 d以上，这些细胞培养瓶可以用3～4周。
1.3 单个核细胞的分离 取人肝素(10 U/ml)抗凝血，等量生理盐水稀释；在另一试管底部加入人淋巴细胞分离液，由上方缓慢加入2～3倍量的稀释血液，形成清晰界面；室温18～20℃下，2 000×g 离心30 min；吸取中间层的单个核细胞到另一个离心管，并制备成RPMI 1640单个核细胞悬液(2×106～4×106个/ml)。
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1.4 单核细胞的分离 取上述准备好的塑料细胞培养瓶，加10 ml RPMI 1640在室温下预培养30～40 min。每个75 ml塑料细胞培养瓶中加入15 ml单个核细胞悬液，在湿化、5% CO2，37℃下培育1 h。用10 ml 37℃的RPMI 1640洗去未粘附的细胞，共3次。然后加入37℃10 ml A液在室温下放1 min，以洗去松散粘附的B淋巴细胞、树突状细胞和血小板。用37℃ RPMI 1640冲洗培养瓶，同时在显微镜下观察培养瓶，直至细胞培养瓶无明显的松散粘附细胞。加入10 ml 37℃的A液在37℃下培育15 min，并在培养前后加适当的叩击，以收获粘附的细胞。
1.5 细胞的鉴定 用单克隆抗体分析明胶法分离的粘附及单个核细胞，单核细胞定义为CD14阳性细胞。为了减少分析中细胞的粘附，抗体标记均在4℃、2 mmol/L EDTA中进行。标记的细胞中加入CD14-FITC或对照的同亚型抗体小鼠IgG2a-FITC培育30 min，随后用PBS清洗2次。再加入500 μl含PI(2 μg/ml)的PBS溶液，共同培育20 min后，即上流式细胞仪(FACS)测定。用非特性酯酶(NSE)试剂盒鉴定单个核细胞及粘附细胞，NSE染色阳性细胞定义为单核细胞，并用锥虫蓝染色后，计数有活性的粘附细胞数。
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2 结果
用人淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞，再经明胶法分离获得单核细胞。用FACS分析细胞特性，结果表明，明胶法获得的单核细胞和单个核细胞中CD14 阳性细胞分别为(90.9±1.0)% 和 (20.9±3.0)%，分离出了单个核细胞中(70.5±4.6)%的单核细胞，而且粘附细胞中死亡细胞占(2.6±0.9)%。用NSE试剂盒分析细胞特性，结果表明，明胶法获得的单核细胞和单个核细胞中NSE 阳性细胞分别是(92±2)%和(23±3)%，分离出了单个核细胞中(71±5)%的单核细胞，而且粘附细胞中的活细胞占(97±1)% 。
3 讨论
基于单核细胞比其他单个核细胞密度低，人们常用密度梯度离心法分离单核细胞，例如ficoll-hypague，percoll[2]和nycodenz都能因此用于分离单核细胞，但nycodenz法分离的单核细胞产量极低，而其他方法分离出的单核细胞纯度不稳定，且percoll中胶体成分二氧化硅被单核细胞吞噬，造成单核细胞活化。近年来，人们发展了几种单核细胞分离方法：如根据细胞体积和密度不同而采用的淘洗器[3]，根据细胞表面标志分子不同而采用的流式细胞分类器、磁式细胞分类器[4]。虽然这些方法都能提取较高纯度的单核细胞，但均有很大局限性。淘洗器和流式细胞分类器均是昂贵的高技术性设备；流式细胞分类器和磁式细胞分类器不但需要昂贵的抗体，而且这些抗体会激活单核细胞；磁式细胞分类器中磁珠还不能除去。此外，由于单核细胞较其他细胞有较高的粘附性，单核细胞粘附到其他材料的表面后不易被洗掉，这点可使其与其他细胞分开。人们曾采用了多种表面，其中包括玻璃、组织培养处理或未处理的塑料、纤连蛋白和明胶等。这些方法虽比较简便、价廉，但单核细胞纯度不够。Beliacqda研究发现，在室温条件下单核细胞不能结合到铺有明胶的细胞培养瓶，除非细胞培养瓶被铺上纤连蛋白。我们在实验中注意到在37℃、湿化条件下，单核细胞同明胶的结合与作用时间长短有关。时间如短于1 h，单核细胞粘附率明显较低。此外，培养瓶在使用前处理时间的长短也可影响单核细胞的粘附。 2%明胶液在干燥、37℃的培养箱中放置1周以上，能明显增加明胶在塑料培养瓶上的铺垫。Alitalo研究表明单核-巨噬细胞分泌一种与细胞膜有联系的纤连蛋白，这种纤连蛋白被发现能连接到各种类型的胶原，包括变性胶原——明胶上。我们提纯单核细胞的方法推测可能是通过纤连蛋白同铺有明胶的细胞培养瓶的结合。为了使粘附的单核细胞脱落，若使用细胞刮匙将会损伤细胞。我们使用EDTA，通过显微镜观察，在铺有明胶的表面，5 mmol/L EDTA几乎能使单核细胞完全脱落。这种EDTA使单核细胞脱落的确切机制尚不清楚。EDTA作为一种螯合剂，能够与Ca2+，Mg2+和单价阳离子结合，而这些离子在细胞间的连接上起着重要作用。当螯合剂与这些离子结合后，这些离子就从组织间替代出来，从而使组织细胞解聚。可能EDTA能够通过这种作用干扰单核细胞对铺有明胶的细胞培养瓶上明胶的结合力，从而使单核细胞脱落下来。我们采用多种方法分析发现，使用我们这种明胶法分离的单核细胞纯度较高，产量可观。总之，我们这种明胶法提纯单核细胞是一种价廉、容易操作的方法，分离出的单核细胞能够满足实验的需要。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
中图分类号 R 543.12 文章编号：0258-879X(1999)12-1039-02 文献标识码：B
作者简介：雷著斌，男，1965年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Jones BM, Nicholson JKA, Holman RC, et al .Comparison of monocyte separation methods using flow cytometric analysis[J]. J Immunol Methods,1989， 125(1/2):41
2 Sozzani S, Luini W, Molino M, et al. The signal transduction pathway involved in the migration induced by a monocyte chemotactic cytokine[J]. J Immunol, 1991，147(7): 2215
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3 Terui Y, Furukawa Y, Sakai T， et al. Up-regulation of VLA-5 expression during monocytic differentiation and its role in negative control of the survival of peripheral blood monocytes[J]. J Immunol,1996， 156(5):1981
4 Gercken J, Pryjma J, Ernst M, et al. Defective antigen presentation by mycobacterium tuberculosis-infected monocytes[J]. Infect Immun, 1994， 62(8):3472
(1999-05-11收稿，1999-09-20修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；沈茜 第二军医大学长海医院实验诊断科
关键词：单核细胞；明胶；流式细胞术
外周血单核细胞在动脉粥样硬化
外周血单核细胞在动脉粥样硬化(AS)形成中起着重要的作用，但人们对AS中单核细胞作用的机制仍不完全清楚，甚至有相矛盾的文献报道，这可能是由于单核细胞提纯困难的缘故。单核细胞大约占外周血单个核细胞的10%～20%[1]。以往单核细胞的提纯方法经常会造成高比例的淋巴细胞污染。近几年来，人们发展了一些纯度较高的提纯方法，但费用昂贵。我们结合以往经验，摸索了一种价廉而简便的单核细胞提纯方法，现报道如下。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂和仪器 RPMI 1640为Gibco公司产品，内加10%小牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、链霉素各100 U/ml。人淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。A液：为5 mmol/L EDTA无钙、镁PBS液，内含10%小牛血清。CD14-FITC、小鼠IgG2a-FITC均为美国Pharmingen公司产品。碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。流式细胞仪、塑料细胞培养瓶均为美国Becton & Dickson公司产品。
1.2 塑料细胞培养瓶的准备 取 2%的明胶溶液10 ml，加入75 ml的细胞培养瓶。细胞培养瓶放置于37℃干燥的培养箱中温育7～10 d，然后完全吸净明胶液，并把细胞培养瓶置于37℃、干燥的培养箱中3 d以上，这些细胞培养瓶可以用3～4周。
1.3 单个核细胞的分离 取人肝素(10 U/ml)抗凝血，等量生理盐水稀释；在另一试管底部加入人淋巴细胞分离液，由上方缓慢加入2～3倍量的稀释血液，形成清晰界面；室温18～20℃下，2 000×g 离心30 min；吸取中间层的单个核细胞到另一个离心管，并制备成RPMI 1640单个核细胞悬液(2×106～4×106个/ml)。
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1.4 单核细胞的分离 取上述准备好的塑料细胞培养瓶，加10 ml RPMI 1640在室温下预培养30～40 min。每个75 ml塑料细胞培养瓶中加入15 ml单个核细胞悬液，在湿化、5% CO2，37℃下培育1 h。用10 ml 37℃的RPMI 1640洗去未粘附的细胞，共3次。然后加入37℃10 ml A液在室温下放1 min，以洗去松散粘附的B淋巴细胞、树突状细胞和血小板。用37℃ RPMI 1640冲洗培养瓶，同时在显微镜下观察培养瓶，直至细胞培养瓶无明显的松散粘附细胞。加入10 ml 37℃的A液在37℃下培育15 min，并在培养前后加适当的叩击，以收获粘附的细胞。
1.5 细胞的鉴定 用单克隆抗体分析明胶法分离的粘附及单个核细胞，单核细胞定义为CD14阳性细胞。为了减少分析中细胞的粘附，抗体标记均在4℃、2 mmol/L EDTA中进行。标记的细胞中加入CD14-FITC或对照的同亚型抗体小鼠IgG2a-FITC培育30 min，随后用PBS清洗2次。再加入500 μl含PI(2 μg/ml)的PBS溶液，共同培育20 min后，即上流式细胞仪(FACS)测定。用非特性酯酶(NSE)试剂盒鉴定单个核细胞及粘附细胞，NSE染色阳性细胞定义为单核细胞，并用锥虫蓝染色后，计数有活性的粘附细胞数。
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2 结果
用人淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞，再经明胶法分离获得单核细胞。用FACS分析细胞特性，结果表明，明胶法获得的单核细胞和单个核细胞中CD14 阳性细胞分别为(90.9±1.0)% 和 (20.9±3.0)%，分离出了单个核细胞中(70.5±4.6)%的单核细胞，而且粘附细胞中死亡细胞占(2.6±0.9)%。用NSE试剂盒分析细胞特性，结果表明，明胶法获得的单核细胞和单个核细胞中NSE 阳性细胞分别是(92±2)%和(23±3)%，分离出了单个核细胞中(71±5)%的单核细胞，而且粘附细胞中的活细胞占(97±1)% 。
3 讨论
基于单核细胞比其他单个核细胞密度低，人们常用密度梯度离心法分离单核细胞，例如ficoll-hypague，percoll[2]和nycodenz都能因此用于分离单核细胞，但nycodenz法分离的单核细胞产量极低，而其他方法分离出的单核细胞纯度不稳定，且percoll中胶体成分二氧化硅被单核细胞吞噬，造成单核细胞活化。近年来，人们发展了几种单核细胞分离方法：如根据细胞体积和密度不同而采用的淘洗器[3]，根据细胞表面标志分子不同而采用的流式细胞分类器、磁式细胞分类器[4]。虽然这些方法都能提取较高纯度的单核细胞，但均有很大局限性。淘洗器和流式细胞分类器均是昂贵的高技术性设备；流式细胞分类器和磁式细胞分类器不但需要昂贵的抗体，而且这些抗体会激活单核细胞；磁式细胞分类器中磁珠还不能除去。此外，由于单核细胞较其他细胞有较高的粘附性，单核细胞粘附到其他材料的表面后不易被洗掉，这点可使其与其他细胞分开。人们曾采用了多种表面，其中包括玻璃、组织培养处理或未处理的塑料、纤连蛋白和明胶等。这些方法虽比较简便、价廉，但单核细胞纯度不够。Beliacqda研究发现，在室温条件下单核细胞不能结合到铺有明胶的细胞培养瓶，除非细胞培养瓶被铺上纤连蛋白。我们在实验中注意到在37℃、湿化条件下，单核细胞同明胶的结合与作用时间长短有关。时间如短于1 h，单核细胞粘附率明显较低。此外，培养瓶在使用前处理时间的长短也可影响单核细胞的粘附。 2%明胶液在干燥、37℃的培养箱中放置1周以上，能明显增加明胶在塑料培养瓶上的铺垫。Alitalo研究表明单核-巨噬细胞分泌一种与细胞膜有联系的纤连蛋白，这种纤连蛋白被发现能连接到各种类型的胶原，包括变性胶原——明胶上。我们提纯单核细胞的方法推测可能是通过纤连蛋白同铺有明胶的细胞培养瓶的结合。为了使粘附的单核细胞脱落，若使用细胞刮匙将会损伤细胞。我们使用EDTA，通过显微镜观察，在铺有明胶的表面，5 mmol/L EDTA几乎能使单核细胞完全脱落。这种EDTA使单核细胞脱落的确切机制尚不清楚。EDTA作为一种螯合剂，能够与Ca2+，Mg2+和单价阳离子结合，而这些离子在细胞间的连接上起着重要作用。当螯合剂与这些离子结合后，这些离子就从组织间替代出来，从而使组织细胞解聚。可能EDTA能够通过这种作用干扰单核细胞对铺有明胶的细胞培养瓶上明胶的结合力，从而使单核细胞脱落下来。我们采用多种方法分析发现，使用我们这种明胶法分离的单核细胞纯度较高，产量可观。总之，我们这种明胶法提纯单核细胞是一种价廉、容易操作的方法，分离出的单核细胞能够满足实验的需要。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
中图分类号 R 543.12 文章编号：0258-879X(1999)12-1039-02 文献标识码：B
作者简介：雷著斌，男，1965年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Jones BM, Nicholson JKA, Holman RC, et al .Comparison of monocyte separation methods using flow cytometric analysis[J]. J Immunol Methods,1989， 125(1/2):41
2 Sozzani S, Luini W, Molino M, et al. The signal transduction pathway involved in the migration induced by a monocyte chemotactic cytokine[J]. J Immunol, 1991，147(7): 2215
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3 Terui Y, Furukawa Y, Sakai T， et al. Up-regulation of VLA-5 expression during monocytic differentiation and its role in negative control of the survival of peripheral blood monocytes[J]. J Immunol,1996， 156(5):1981
4 Gercken J, Pryjma J, Ernst M, et al. Defective antigen presentation by mycobacterium tuberculosis-infected monocytes[J]. Infect Immun, 1994， 62(8):3472
(1999-05-11收稿，1999-09-20修回), 百拇医药