人血管形成素腺病毒重组粘粒构建*
作者：黄盛东 梅 举 于伟勇 李白翎 张宝仁
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：血管形成素；腺病毒载体
第二军医大学学报991234
血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子，目前已发现有两种分型，即Ⅰ和Ⅱ型血管形成素(ANG,ANG2)[1，2]。其中Ⅰ型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3]，其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区，受体为Tie-2。体内外实验均表明，Ⅰ型血管形成素除了本身具有较强的促血管生长作用之外，还能与促血管生长因子VEGF等产生协同效应[4] 。因此，其在缺血性组织中的促血管生长作用正越来越受到人们的重视。本研究采用反转录PCR方法，从人脾组织中扩增出编码人血管形成素的cDNA，并在此基础上构建成血管形成素腺病毒载体重组粘粒(ANG-pAxCAwt)。为研究其在心肌缺血区基因转染后的促血管生长作用打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 反转录试剂盒：德国Boehringer公司产品；PCR试剂：加拿大生工公司产品；PCR引物：加拿大生工公司合成；限制性内切酶、T4 DNA多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶等：美国BioLabs公司产品； DNA标准品：皓嘉公司产品；腺病毒表达载体试剂盒：日本TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒：德国Qiagen公司产品。DNA包装蛋白：美国Novagen公司产品。
1.1.2 菌株、质粒和粘粒 PUC119质粒、大肠杆菌TG1菌株由复旦大学遗传学研究所提供。粘粒载体pAxCAwt及菌株LE392为日本TaKaRa公司腺病毒表达载体试剂盒所带。
1.2 方法
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1.2.1 血管形成素反转录PCR引物的设计 根据基因文库报道的血管形成素基因的核苷酸序列和基因克隆、表达的要求，用PC-GENE软件辅助设计PCR上、下游引物，分别在两条引物的5′端添加KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点。
1.2.2 人体脾组织总RNA及mRNA的提取和纯化 采用改良异硫氰酸胍一步法提取肾组织总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收扫描分析确定RNA的质量，然后用Oligo-(dT)-cellurose层析法分离、纯化mRNA。
1.2.3 反转录反应 取1 μg mRNA、100 ng Oligo-(dT)，在含2.5 mmol/L MgCl2 的反转录缓冲体系中于68℃变性5 min，立刻放入冰浴中冷却，再加入dNTP至终浓度1 mmol/L、RNAsin 20 U，禽源反转录酶(AMV)100 U，反应体积为20 μl，置42℃反应30 min后于95℃加热5 min以灭活反转录酶。
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1.2.4 PCR扩增血管形成素 cDNA 以0.5 μl上述反转录反应液为模板，加入上、下游引物各15 pmol/L，在含0.4 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2 和2 U Taq DNA聚合酶的50 μl反应体系中，在GeneAmp9600 PCR仪上按94℃ 45 s、56℃ 45 s和72℃ 45 s进行30个循环的PCR反应。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 血管形成素cDNA的克隆和测序 PCR反应所得的cDNA经KpnⅠ、BamHⅠ双酶切后与同样酶切的PUC119 DNA以5∶1摩尔比混合，加入80 U T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，转化大肠杆菌TG1感受态细胞。挑取6个白色菌落，扩增后用碱裂解法小量制备其质粒DNA，用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。阳性克隆测序分析。
1.2.6 血管形成素的腺病毒重组粘粒构建 取1.5 μg pAxCAwt粘粒,用SwaⅠ酶切; 用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切血管形成素PUC119重组质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳回收血管形成素cDNA片段，用Klenow大片段将两端补平。片段DNA与粘粒DNA以20∶1摩尔比混合，加入500 U高浓度T4 DNA连接酶，置16℃连接过夜。酚-氯仿抽提后用DNA包装蛋白包装，转染LE392细菌，涂布加有氨苄西林的TB固体培养基，37℃培养过夜，挑取菌落培养抽提粘粒。
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1.2.7 重组粘粒及插入方向鉴定 用PCR扩增及SwaⅠ酶切后琼脂糖电泳判断是否为重组粘粒，凡是PCR阳性及SwaⅠ酶切未被切断的为重组阳性克隆。进一步用SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收6 900 bp大小的片段，自连后转染TG1感受态菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRⅠ酶切电泳，片段为1 552 bp和5 348 bp的为反向插入，片段为2 059 bp和4 841 bp的为正向插入。挑取正向插入克隆扩增粘粒待用。
2 结果
2.1 人体脾组织总RNA及mRNA的分离纯化 脾组织总RNA和mRNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见总RNA中18 S和28 S rRNA条带非常清晰，mRNA呈连续拖带，表明mRNA在抽提过程中没有被降解；总RNA的D(260)/D(280)值为1.91，D(260)/D(230)值为1.98，表明其纯度良好。
, http://www.100md.com 2.2 反转录PCR反应扩增血管形成素 cDNA 反转录PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见在约1 515 bp处有高度特异的DNA条带(图1)。
图1 反转录PCR电泳结果
A，D，E：阳性；B：DNA标志物；C：阴性
2.3 克隆和DNA序列分析 挑选的7个白色噬菌斑扩增后经PCR鉴定，其中6个可扩增出长约1 515 bp的片段。对这6个克隆的RF DNA进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，均切出了长约1 515 bp的片段。然后，抽提其中一个克隆的质粒分别用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切，均得到500左右的条带，与序列酶切分析结果一致。质粒纯化后测序，结果表明重组克隆PUC119/ANG中的血管形成素 cDNA序列与国外报道完全一致。
, http://www.100md.com 2.4 血管形成素的腺病毒重组粘粒及插入鉴定 挑取8个阳性菌落进行培养，抽提粘粒,用PCR扩增后电泳。结果，其中5个克隆PCR呈阳性。进一步用SwaⅠ酶切，3个克隆呈阳性。
2.5 重组粘粒插入方向鉴定 用SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收6 900 bp大小的片段，自连后转染TG1菌，经LB培养基培养后挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRⅠ酶切电泳，其中两个为正向插入阳性克隆，一个为反向插入阳性克隆(图2)。
图2 ANG重组质粒EcoRⅠ酶切电泳结果
A，B：反向插入；C：DNA标志物；D：正向插入
3 讨论
目的基因的获得是基因转染的基础。反转录PCR技术简便易行，是目前最常用的获取已知基因的方法，较从cDNA文库中筛取基因和化学合成基因等方法优点明显。提取RNA的组织材料不但要求目的基因丰度高，而且要新鲜，以免RNA降解。因此，我们选用血管形成素含量较高的人体脾组织作为获取RNA的材料。抽提总RNA时，应注意在组织研碎过程中及时添加液氮以确保脾组织的坚实性，防止RNA降解。设计PCR引物时应充分考虑到引物的高特异性及模板相应区域cDNA二级结构等因素。
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目前，有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体。和其他基因载体系统相比，腺病毒载体具有宿主范围广、感染率高、理化性质较稳定、遗传毒性较低等优点。其最大的缺点是重组腺病毒的产生较复杂，且效率不高。因此，Miyake等[5]用基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染293细胞的方法，使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百倍。
该系统虽具有上述优点，但在实际操作中我们发现，由于所用的粘粒较大，为44 kb,所以在构建重组粘粒的过程中，无论是连接了目的基因的粘粒转染细菌，还是重组粘粒中目的基因插入方向鉴定，较通常操作要困难得多。我们在用连接了目的基因的粘粒转染LE392菌时，使用了DNA包装蛋白，使转染率得到了明显的提高。同样，在鉴定粘粒载体中是否有目的基因插入及插入方向时，直接用酶切粘粒的方法几乎是不可能的。PCR方法虽能大规模筛选插入阳性克隆，但存在一定的假阳性率，且无法判断目的基因的插入方向。因此，我们在用PCR粗筛后，将所得粘粒用SalⅠ酶切后亚克隆为带有目的基因的重组质粒，进一步酶切鉴定是否有插入及插入方向。
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血管形成素是近年来新发现的促血管生长因子，有关其在心肌缺血区促血管生长的研究国内外尚未见报道。本研究应用反转录PCR技术获取了人血管形成素的cDNA，并在此基础上成功地构建了ANG-pAxCAwt重组粘粒，为进一步探索血管形成素在心肌缺血区基因转染后促血管生长作用研究打下了坚实的基础。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39970735
中图分类号 Q 782 文章编号：0258-879X(1999)12-1036-02 文献标识码：B
作者简介：黄盛东，男，1965年1月生，博士，助理研究员
参考文献
1 Davis S, Aldrich TH, Jones PF,et al.Isolation of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,by secretion-trap expression cloning[J]. Cell, 1996,87(7):1161
, http://www.100md.com
2 Stratmann A,Risau W,Plate KH,et al. Cell type-specific expression of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis[J]. Am J Pathol，1998,153(5):1459
3 Shyu KG,Manor O, Magner M,et al. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemia hindlimb[J]. Circulation, 1998,98 (19): 2081
4 Asahara T,Chen D,Takahashi T,et al. Tie-2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2，modulate VEGF-induced postnatal neovascularization[J].Circ Res,1998, 83(3):342
5 Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, et al. Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996 ,93(3)：1320
(1999-09-21收稿，1999-10-30修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：血管形成素；腺病毒载体
第二军医大学学报991234
血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子，目前已发现有两种分型，即Ⅰ和Ⅱ型血管形成素(ANG,ANG2)[1，2]。其中Ⅰ型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3]，其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区，受体为Tie-2。体内外实验均表明，Ⅰ型血管形成素除了本身具有较强的促血管生长作用之外，还能与促血管生长因子VEGF等产生协同效应[4] 。因此，其在缺血性组织中的促血管生长作用正越来越受到人们的重视。本研究采用反转录PCR方法，从人脾组织中扩增出编码人血管形成素的cDNA，并在此基础上构建成血管形成素腺病毒载体重组粘粒(ANG-pAxCAwt)。为研究其在心肌缺血区基因转染后的促血管生长作用打下基础。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 反转录试剂盒：德国Boehringer公司产品；PCR试剂：加拿大生工公司产品；PCR引物：加拿大生工公司合成；限制性内切酶、T4 DNA多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶等：美国BioLabs公司产品； DNA标准品：皓嘉公司产品；腺病毒表达载体试剂盒：日本TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒：德国Qiagen公司产品。DNA包装蛋白：美国Novagen公司产品。
1.1.2 菌株、质粒和粘粒 PUC119质粒、大肠杆菌TG1菌株由复旦大学遗传学研究所提供。粘粒载体pAxCAwt及菌株LE392为日本TaKaRa公司腺病毒表达载体试剂盒所带。
1.2 方法
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1.2.1 血管形成素反转录PCR引物的设计 根据基因文库报道的血管形成素基因的核苷酸序列和基因克隆、表达的要求，用PC-GENE软件辅助设计PCR上、下游引物，分别在两条引物的5′端添加KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点。
1.2.2 人体脾组织总RNA及mRNA的提取和纯化 采用改良异硫氰酸胍一步法提取肾组织总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收扫描分析确定RNA的质量，然后用Oligo-(dT)-cellurose层析法分离、纯化mRNA。
1.2.3 反转录反应 取1 μg mRNA、100 ng Oligo-(dT)，在含2.5 mmol/L MgCl2 的反转录缓冲体系中于68℃变性5 min，立刻放入冰浴中冷却，再加入dNTP至终浓度1 mmol/L、RNAsin 20 U，禽源反转录酶(AMV)100 U，反应体积为20 μl，置42℃反应30 min后于95℃加热5 min以灭活反转录酶。
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1.2.4 PCR扩增血管形成素 cDNA 以0.5 μl上述反转录反应液为模板，加入上、下游引物各15 pmol/L，在含0.4 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2 和2 U Taq DNA聚合酶的50 μl反应体系中，在GeneAmp9600 PCR仪上按94℃ 45 s、56℃ 45 s和72℃ 45 s进行30个循环的PCR反应。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 血管形成素cDNA的克隆和测序 PCR反应所得的cDNA经KpnⅠ、BamHⅠ双酶切后与同样酶切的PUC119 DNA以5∶1摩尔比混合，加入80 U T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，转化大肠杆菌TG1感受态细胞。挑取6个白色菌落，扩增后用碱裂解法小量制备其质粒DNA，用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。阳性克隆测序分析。
1.2.6 血管形成素的腺病毒重组粘粒构建 取1.5 μg pAxCAwt粘粒,用SwaⅠ酶切; 用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切血管形成素PUC119重组质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳回收血管形成素cDNA片段，用Klenow大片段将两端补平。片段DNA与粘粒DNA以20∶1摩尔比混合，加入500 U高浓度T4 DNA连接酶，置16℃连接过夜。酚-氯仿抽提后用DNA包装蛋白包装，转染LE392细菌，涂布加有氨苄西林的TB固体培养基，37℃培养过夜，挑取菌落培养抽提粘粒。
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1.2.7 重组粘粒及插入方向鉴定 用PCR扩增及SwaⅠ酶切后琼脂糖电泳判断是否为重组粘粒，凡是PCR阳性及SwaⅠ酶切未被切断的为重组阳性克隆。进一步用SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收6 900 bp大小的片段，自连后转染TG1感受态菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRⅠ酶切电泳，片段为1 552 bp和5 348 bp的为反向插入，片段为2 059 bp和4 841 bp的为正向插入。挑取正向插入克隆扩增粘粒待用。
2 结果
2.1 人体脾组织总RNA及mRNA的分离纯化 脾组织总RNA和mRNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见总RNA中18 S和28 S rRNA条带非常清晰，mRNA呈连续拖带，表明mRNA在抽提过程中没有被降解；总RNA的D(260)/D(280)值为1.91，D(260)/D(230)值为1.98，表明其纯度良好。
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图1 反转录PCR电泳结果
A，D，E：阳性；B：DNA标志物；C：阴性
2.3 克隆和DNA序列分析 挑选的7个白色噬菌斑扩增后经PCR鉴定，其中6个可扩增出长约1 515 bp的片段。对这6个克隆的RF DNA进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，均切出了长约1 515 bp的片段。然后，抽提其中一个克隆的质粒分别用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切，均得到500左右的条带，与序列酶切分析结果一致。质粒纯化后测序，结果表明重组克隆PUC119/ANG中的血管形成素 cDNA序列与国外报道完全一致。
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2.5 重组粘粒插入方向鉴定 用SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收6 900 bp大小的片段，自连后转染TG1菌，经LB培养基培养后挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRⅠ酶切电泳，其中两个为正向插入阳性克隆，一个为反向插入阳性克隆(图2)。
图2 ANG重组质粒EcoRⅠ酶切电泳结果
A，B：反向插入；C：DNA标志物；D：正向插入
3 讨论
目的基因的获得是基因转染的基础。反转录PCR技术简便易行，是目前最常用的获取已知基因的方法，较从cDNA文库中筛取基因和化学合成基因等方法优点明显。提取RNA的组织材料不但要求目的基因丰度高，而且要新鲜，以免RNA降解。因此，我们选用血管形成素含量较高的人体脾组织作为获取RNA的材料。抽提总RNA时，应注意在组织研碎过程中及时添加液氮以确保脾组织的坚实性，防止RNA降解。设计PCR引物时应充分考虑到引物的高特异性及模板相应区域cDNA二级结构等因素。
, 百拇医药
目前，有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体。和其他基因载体系统相比，腺病毒载体具有宿主范围广、感染率高、理化性质较稳定、遗传毒性较低等优点。其最大的缺点是重组腺病毒的产生较复杂，且效率不高。因此，Miyake等[5]用基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染293细胞的方法，使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百倍。
该系统虽具有上述优点，但在实际操作中我们发现，由于所用的粘粒较大，为44 kb,所以在构建重组粘粒的过程中，无论是连接了目的基因的粘粒转染细菌，还是重组粘粒中目的基因插入方向鉴定，较通常操作要困难得多。我们在用连接了目的基因的粘粒转染LE392菌时，使用了DNA包装蛋白，使转染率得到了明显的提高。同样，在鉴定粘粒载体中是否有目的基因插入及插入方向时，直接用酶切粘粒的方法几乎是不可能的。PCR方法虽能大规模筛选插入阳性克隆，但存在一定的假阳性率，且无法判断目的基因的插入方向。因此，我们在用PCR粗筛后，将所得粘粒用SalⅠ酶切后亚克隆为带有目的基因的重组质粒，进一步酶切鉴定是否有插入及插入方向。
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血管形成素是近年来新发现的促血管生长因子，有关其在心肌缺血区促血管生长的研究国内外尚未见报道。本研究应用反转录PCR技术获取了人血管形成素的cDNA，并在此基础上成功地构建了ANG-pAxCAwt重组粘粒，为进一步探索血管形成素在心肌缺血区基因转染后促血管生长作用研究打下了坚实的基础。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39970735
中图分类号 Q 782 文章编号：0258-879X(1999)12-1036-02 文献标识码：B
作者简介：黄盛东，男，1965年1月生，博士，助理研究员
参考文献
1 Davis S, Aldrich TH, Jones PF,et al.Isolation of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,by secretion-trap expression cloning[J]. Cell, 1996,87(7):1161
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2 Stratmann A,Risau W,Plate KH,et al. Cell type-specific expression of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis[J]. Am J Pathol，1998,153(5):1459
3 Shyu KG,Manor O, Magner M,et al. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemia hindlimb[J]. Circulation, 1998,98 (19): 2081
4 Asahara T,Chen D,Takahashi T,et al. Tie-2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2，modulate VEGF-induced postnatal neovascularization[J].Circ Res,1998, 83(3):342
5 Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, et al. Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996 ,93(3)：1320
(1999-09-21收稿，1999-10-30修回), http://www.100md.com