肝细胞癌组织中P16蛋白表达与丙型肝炎病毒感染的关系
作者：卜保国 杨建民 汪荣泉 陈文生 罗元辉 房殿春 周子成
单位：第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038
关键词：肝细胞癌；P16蛋白；丙型肝炎病毒
提要 目的
提要 目的：研究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中P16蛋白表达与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的关系。方法：用免疫组化ABC法检测46例HCC及其癌旁肝组织中P16蛋白和HCV抗原的表达。结果：P16蛋白的阴性表达率在HCC癌组织(58.7%,27/46)明显高于其癌旁组织(36.8%,14/38)(P<0.05)，在Edmondson Ⅲ/Ⅳ级HCC(78.9%,15/19)明显高于Ⅰ/Ⅱ级HCC(44.4%,12/27)(P<0.05)，在HCV抗原阳性组(80.0%,16/20)明显高于HCV抗原阴性组(42.3%,11/26)(P<0.05)。结论：P16蛋白的表达与HCC发生发展关系密切，HCV致癌过程可能与细胞周期负性调节因子P16基因功能受抑有关。
, 百拇医药
中图法分类号 R512.63;R735.7 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0916-03
Relationship of P16 protein expression with hepatitis C virus infection in hepatocellular carcinoma
BU Bao-guo, YANG Jian-ming, WANG Rong-quan, CHEN Wen-sheng, LUO Yuan-hui, FANG Dian-chun, ZHOU Zhi-chen
(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the relationship betwee P16 protein expression and hepatitis C virus (HCV) infection in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods: P16 protein expression and HCV antigens were examined in the tissue samples of 46 cases of HCC and 38 samples of peri-carcinoma tissues with immunohistochemical and avidin-biotin complex methods.Results: The rate of negative P16 protein expression was significantly higher in the carcinomatous tissue (58.7%,27/46) than in the pericarcinomatous tissues (36.8%,14/38) and in Edmondson grade Ⅲ and Ⅳ HCC(78.9%,15/19) than in Edmondson grade Ⅰ and Ⅱ HCC (44.4%,12/27) (P<0.05).The rate of negative P16 protein expression was significantly higher in HCV antigen positive group (80%,16/20) than in HCV antigen negative group (42.3%,11/26) (P<0.05).Conclusion: P16 protein expression seems to be related closely to the pathogenesis and development of HCC and HCV antigen may be involved in its pathogenesis through the inhibition on the function of P16 gene, which exerts a negative regulation of cell proliferation of HCC.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma; P16 protein expression; hepatitis C virus
以前研究表明，HCV感染与重庆地区HCC的发生密切相关[1,2]，但其致癌机制迄今尚不明确。P16基因是新近发现的1种抑癌基因，亦属细胞周期负性调节因子，编码16 ×103u蛋白，已发现多种原发性肿瘤和肿瘤细胞系有P16基因缺失与突变[3,4]。为明确HCV感染能否导致P16基因表达的异常，我们用免疫组化技术检测46例HCC及其癌旁肝组织中P16蛋白和HCV抗原的表达，以分析P16蛋白表达与肝细胞癌发生发展及其与HCV感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
46例手术切除的HCC标本均系10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的组织块，其中38例含有癌旁肝组织。鼠抗人P16单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗HCV CP10单克隆抗体由本院传染科制备，鼠抗HCV NS3、NS5单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供，ABC试剂盒购自VECTOR公司。
, 百拇医药
1.2 方法
蜡块组织5μm厚连续切片，分别作常规HE染色及P16蛋白和HCV CP10、NS3、NS5抗原免疫组化染色。免疫组化染色采用ABC法，按试剂盒说明步骤操作，DAB显色。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定
P16蛋白以胞核染色为准[5]，胞核染色或胞核、胞浆均染色者为阳性，胞核、胞浆均不染色或仅胞浆染色为阴性。HCV CP10、NS3、NS5抗原以胞浆染色为阳性[6]。
1.4 统计学处理
所得数据采用χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 P16蛋白表达与HCC分级的关系
46例HCC癌组织中P16蛋白阳性19例(41.3%)，阴性27例(58.7%)；38例癌旁肝组织中P16蛋白阳性24例(63.2%)，阴性14例(36.8%)，癌组织中P16的阴性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。P16蛋白的表达与HCC的Edmondson分级有关，Ⅰ和Ⅱ级27例HCC中P16蛋白阳性15例(55.6%)，阴性12例(44.4%)；Ⅲ和Ⅳ级19例中P16蛋白阳性4例(21.1%)，阴性15例(78.9%)，两组间差异显著(P<0.05)，见表1。说明P16蛋白表达与HCC分化程度有关，HCC分化愈差，P16蛋白的表达缺失率愈高。
表1 P16蛋白表达与HCC分级的关系
Tab 1 Relationship of P16 protein expression with
, 百拇医药
Edmondson grade in hepatocellular carcionma
Edmondson grade
n
P16 protein(+)
P16 protein(-)
Ⅰ
6
4
2
Ⅱ
21
11
, 百拇医药
10
Ⅲ
11
3
8
Ⅳ
8
1
7
Total
46
19
27
2.2 HCV抗原与P16蛋白表达的关系
, 百拇医药
若将HCV CP10、NS3及NS5 3种抗原出现其中1种抗原阳性染色，即认为该例HCV抗原阳性，则46例HCC中HCV抗原阳性20例(43.5%)。HCV抗原阳性组P16蛋白阳性4例(20.0%)，HCV抗原阴性组P16蛋白阳性15例(57.7%)，HCV抗原阳性组HCC中P16蛋白阴性表达率明显高于HCV抗原阴性组(P0.05)，见表2。表2 HCV抗原与HCC癌组织中P16表达的关系
Tab 2 Relationship of hepatitis C virus antigen expression
with P16 protein in hepatocellular carcinoma
Group
n
P16 protein(+)
, 百拇医药
P16 protein(-)
n
%
n
%
HCVantigen(+)
20
4
20.0
16
80.0
HCV antigen(-)
26
, http://www.100md.com
15
57.7
11
42.3
3 讨论
P16基因位于人染色体9p21，全长8.5 kb，编码16×103u的蛋白。P16蛋白能够抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)介导的Rb基因蛋白产物——Rb蛋白磷酸化，而磷酸化的Rb蛋白能抑制细胞G1期向S期演进，从而抑制细胞分裂增殖[3,4]。当P16蛋白缺失时，细胞增殖失控，可致肿瘤形成。有报道[7]发现，P16蛋白在肝癌细胞系中的表达缺失率为50.0%(3/6)，在原发性肝癌中的表达缺失率为34.4%(11/32)。Piao等[8]发现HCC组织中P16基因纯合缺失率为61%(25/41)。本文用免疫组化研究发现，HCC组织中P16蛋白的阴性表达率高达58.7%，癌旁组织中P16的阴性表达率也达36.8%，并发现P16蛋白的表达与HCC分化程度有关，分化程度愈低，P16蛋白的阴性表达率愈高，提示P16蛋白的表达缺失可能与HCC的发生发展及预后有关。
, 百拇医药
HCV感染与HCC的发生密切相关[1,2,9]，但其致癌机制尚不清楚。HCV由于为RNA病毒，一般认为不会通过整合作用直接改变宿主的基因结构，因而HCV对细胞生长调控因子的影响是其目前致癌机制研究的重点之一。最近文献[10]报道，HCV核心区蛋白能抑制P21基因促进子的转录，从而干扰正常的细胞周期调控，促进细胞的异常增殖。本研究发现，HCV抗原阳性组HCC的P16蛋白阴性表达率明显高于HCV抗原阴性组，提示HCV的致癌过程可能与细胞周期负性调节因子P16基因功能受抑制有关。
作者简介：卜保国，男，1973.06.06生，山西人，硕士，住院医师，主要从事肝癌基础研究。
参考文献
[1] Yang J M, Liu W W, Jin H Y.Relationship of hepatitis C virus infection with primary hepatic carcinoma: An investigation of serum HCV RNA in different population groups[J].J Med Coll PLA，1993，8(2):109-113.
, 百拇医药
[2] 杨建民,刘为纹,晋华源.肝细胞癌中HCV复制中间体的研究[J].中华消化内科杂志，1994，14(4):210-212.
[3] Kamb A, Cruis N A, Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science，1994，264(5157):436-440.
[4] Nobori T, Miura K,Wu D J, et al.Deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in mutiple human cancers[J].Nature，1994，368(6473):753-756.
[5] Geradts J, Kratzke R A, Niehans G A, et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/mutiple tumor suppresor 1(CDK2/MTS1)puduct P16INK4/CDKN2 in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma protein expression[J].Cancer Res，1995，55(24):6006-6011.
, 百拇医药
[6] 汪荣泉,周子成,杨建民,等.肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒NS5抗原的免疫组织化学研究[J].中华医学杂志，1996，76(8):623-624.
[7] Hui A M, Sakamoto M, Kanai Y, et al.Inactivation of P16INK4 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，1996，24(3):575-579.
[8] Piao Z, Park C, Lee J S, et al.Homozygous deletions of the CDKN2 gene and heterozygosity of 9P in primary hepatocellular carcinoma[J].Cancer Letter，1998，122(1-2):201-207.
[9] Resnick R H, Koff R.Hepatitis C-related hepatocellular carcinoma: Prevalence and significance[J].Arch Int Med，1993，153(14):1672-1677.
[10] Ray R B, Steele R, Meyer K, et al.Hepatitis C virus core protein represses P21WAF1/Gip1/Sid1 promoter activity[J].Gene，1998，208(2):331-336.
收稿日期：1999-01-30；修回日期：1999-04-19, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属西南医院消化内科，重庆 400038
关键词：肝细胞癌；P16蛋白；丙型肝炎病毒
提要 目的
提要 目的：研究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中P16蛋白表达与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的关系。方法：用免疫组化ABC法检测46例HCC及其癌旁肝组织中P16蛋白和HCV抗原的表达。结果：P16蛋白的阴性表达率在HCC癌组织(58.7%,27/46)明显高于其癌旁组织(36.8%,14/38)(P<0.05)，在Edmondson Ⅲ/Ⅳ级HCC(78.9%,15/19)明显高于Ⅰ/Ⅱ级HCC(44.4%,12/27)(P<0.05)，在HCV抗原阳性组(80.0%,16/20)明显高于HCV抗原阴性组(42.3%,11/26)(P<0.05)。结论：P16蛋白的表达与HCC发生发展关系密切，HCV致癌过程可能与细胞周期负性调节因子P16基因功能受抑有关。
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中图法分类号 R512.63;R735.7 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0916-03
Relationship of P16 protein expression with hepatitis C virus infection in hepatocellular carcinoma
BU Bao-guo, YANG Jian-ming, WANG Rong-quan, CHEN Wen-sheng, LUO Yuan-hui, FANG Dian-chun, ZHOU Zhi-chen
(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the relationship betwee P16 protein expression and hepatitis C virus (HCV) infection in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods: P16 protein expression and HCV antigens were examined in the tissue samples of 46 cases of HCC and 38 samples of peri-carcinoma tissues with immunohistochemical and avidin-biotin complex methods.Results: The rate of negative P16 protein expression was significantly higher in the carcinomatous tissue (58.7%,27/46) than in the pericarcinomatous tissues (36.8%,14/38) and in Edmondson grade Ⅲ and Ⅳ HCC(78.9%,15/19) than in Edmondson grade Ⅰ and Ⅱ HCC (44.4%,12/27) (P<0.05).The rate of negative P16 protein expression was significantly higher in HCV antigen positive group (80%,16/20) than in HCV antigen negative group (42.3%,11/26) (P<0.05).Conclusion: P16 protein expression seems to be related closely to the pathogenesis and development of HCC and HCV antigen may be involved in its pathogenesis through the inhibition on the function of P16 gene, which exerts a negative regulation of cell proliferation of HCC.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma; P16 protein expression; hepatitis C virus
以前研究表明，HCV感染与重庆地区HCC的发生密切相关[1,2]，但其致癌机制迄今尚不明确。P16基因是新近发现的1种抑癌基因，亦属细胞周期负性调节因子，编码16 ×103u蛋白，已发现多种原发性肿瘤和肿瘤细胞系有P16基因缺失与突变[3,4]。为明确HCV感染能否导致P16基因表达的异常，我们用免疫组化技术检测46例HCC及其癌旁肝组织中P16蛋白和HCV抗原的表达，以分析P16蛋白表达与肝细胞癌发生发展及其与HCV感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
46例手术切除的HCC标本均系10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的组织块，其中38例含有癌旁肝组织。鼠抗人P16单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗HCV CP10单克隆抗体由本院传染科制备，鼠抗HCV NS3、NS5单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供，ABC试剂盒购自VECTOR公司。
, 百拇医药
1.2 方法
蜡块组织5μm厚连续切片，分别作常规HE染色及P16蛋白和HCV CP10、NS3、NS5抗原免疫组化染色。免疫组化染色采用ABC法，按试剂盒说明步骤操作，DAB显色。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定
P16蛋白以胞核染色为准[5]，胞核染色或胞核、胞浆均染色者为阳性，胞核、胞浆均不染色或仅胞浆染色为阴性。HCV CP10、NS3、NS5抗原以胞浆染色为阳性[6]。
1.4 统计学处理
所得数据采用χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 P16蛋白表达与HCC分级的关系
46例HCC癌组织中P16蛋白阳性19例(41.3%)，阴性27例(58.7%)；38例癌旁肝组织中P16蛋白阳性24例(63.2%)，阴性14例(36.8%)，癌组织中P16的阴性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。P16蛋白的表达与HCC的Edmondson分级有关，Ⅰ和Ⅱ级27例HCC中P16蛋白阳性15例(55.6%)，阴性12例(44.4%)；Ⅲ和Ⅳ级19例中P16蛋白阳性4例(21.1%)，阴性15例(78.9%)，两组间差异显著(P<0.05)，见表1。说明P16蛋白表达与HCC分化程度有关，HCC分化愈差，P16蛋白的表达缺失率愈高。
表1 P16蛋白表达与HCC分级的关系
Tab 1 Relationship of P16 protein expression with
, 百拇医药
Edmondson grade in hepatocellular carcionma
Edmondson grade
n
P16 protein(+)
P16 protein(-)
Ⅰ
6
4
2
Ⅱ
21
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10
Ⅲ
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Ⅳ
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Total
46
19
27
2.2 HCV抗原与P16蛋白表达的关系
, 百拇医药
若将HCV CP10、NS3及NS5 3种抗原出现其中1种抗原阳性染色，即认为该例HCV抗原阳性，则46例HCC中HCV抗原阳性20例(43.5%)。HCV抗原阳性组P16蛋白阳性4例(20.0%)，HCV抗原阴性组P16蛋白阳性15例(57.7%)，HCV抗原阳性组HCC中P16蛋白阴性表达率明显高于HCV抗原阴性组(P0.05)，见表2。表2 HCV抗原与HCC癌组织中P16表达的关系
Tab 2 Relationship of hepatitis C virus antigen expression
with P16 protein in hepatocellular carcinoma
Group
n
P16 protein(+)
, 百拇医药
P16 protein(-)
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HCVantigen(+)
20
4
20.0
16
80.0
HCV antigen(-)
26
, http://www.100md.com
15
57.7
11
42.3
3 讨论
P16基因位于人染色体9p21，全长8.5 kb，编码16×103u的蛋白。P16蛋白能够抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)介导的Rb基因蛋白产物——Rb蛋白磷酸化，而磷酸化的Rb蛋白能抑制细胞G1期向S期演进，从而抑制细胞分裂增殖[3,4]。当P16蛋白缺失时，细胞增殖失控，可致肿瘤形成。有报道[7]发现，P16蛋白在肝癌细胞系中的表达缺失率为50.0%(3/6)，在原发性肝癌中的表达缺失率为34.4%(11/32)。Piao等[8]发现HCC组织中P16基因纯合缺失率为61%(25/41)。本文用免疫组化研究发现，HCC组织中P16蛋白的阴性表达率高达58.7%，癌旁组织中P16的阴性表达率也达36.8%，并发现P16蛋白的表达与HCC分化程度有关，分化程度愈低，P16蛋白的阴性表达率愈高，提示P16蛋白的表达缺失可能与HCC的发生发展及预后有关。
, 百拇医药
HCV感染与HCC的发生密切相关[1,2,9]，但其致癌机制尚不清楚。HCV由于为RNA病毒，一般认为不会通过整合作用直接改变宿主的基因结构，因而HCV对细胞生长调控因子的影响是其目前致癌机制研究的重点之一。最近文献[10]报道，HCV核心区蛋白能抑制P21基因促进子的转录，从而干扰正常的细胞周期调控，促进细胞的异常增殖。本研究发现，HCV抗原阳性组HCC的P16蛋白阴性表达率明显高于HCV抗原阴性组，提示HCV的致癌过程可能与细胞周期负性调节因子P16基因功能受抑制有关。
作者简介：卜保国，男，1973.06.06生，山西人，硕士，住院医师，主要从事肝癌基础研究。
参考文献
[1] Yang J M, Liu W W, Jin H Y.Relationship of hepatitis C virus infection with primary hepatic carcinoma: An investigation of serum HCV RNA in different population groups[J].J Med Coll PLA，1993，8(2):109-113.
, 百拇医药
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[5] Geradts J, Kratzke R A, Niehans G A, et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/mutiple tumor suppresor 1(CDK2/MTS1)puduct P16INK4/CDKN2 in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma protein expression[J].Cancer Res，1995，55(24):6006-6011.
, 百拇医药
[6] 汪荣泉,周子成,杨建民,等.肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒NS5抗原的免疫组织化学研究[J].中华医学杂志，1996，76(8):623-624.
[7] Hui A M, Sakamoto M, Kanai Y, et al.Inactivation of P16INK4 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，1996，24(3):575-579.
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收稿日期：1999-01-30；修回日期：1999-04-19, http://www.100md.com