纸片相邻法用于细菌超广谱β-内酰胺酶的检测
作者：刘丁 敖平 陈萍 张文俊 邓光贵
单位：刘丁 陈萍 张文俊 邓光贵：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所检验科，重庆 400042；敖平：重庆长安汽车第二职工医院感染监控室，重庆 400023
关键词：超广谱β-内酰胺酶；纸片相邻法；大肠埃希菌；肺炎克雷伯菌；Etest
提要 目的
提要 目的：探讨用纸片相邻法检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶时，两纸片距离及各种底物对结果的影响。方法：采用阿莫西林/棒酸纸片分别与氨曲南、头孢他啶、头孢曲松及头孢噻肟在相邻20 mm、25 mm时进行检测。结果：大肠埃希菌多种纸片法检出率为25.2%，Etest为22.4%；肺炎克雷伯菌纸片法总检出率为23.4%，Etest为20.3%。结论：纸片相邻法应将两纸片距离相间25 mm，头孢他啶、头孢曲松分别可作为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的最佳底物，结果与Etest相似。
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中图法分类号 R378 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(1999)12-0947-02
Detection of extended-spectrum β-lactamases in bacteria with a disk approximation method
超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBL)是以能灭活超广谱头孢菌素、单环类、窄谱头孢菌素及抗革兰氏阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的β-内酰胺酶[1]。随着第3代头孢菌素的广泛使用，产ESBL的细菌也日益增加，建立及完善其检测手段，在给临床医生用药提示和掌握细菌耐药动态方面有着重要作用。目前，检测ESBL的方法主要有纸片相邻法、Etest以及Vitek自动鉴定法[2]，由于Etest试条昂贵，而Vitek法需特殊设备，在临床上应用较少。纸片相邻法因其简便、成本低，故易于临床检测。但该法受影响因素多。为此，我们进行了有关实验，以找出其最佳检测条件，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受试菌株
1998年1月至1998年3月从重庆市6家医院临床微生物室分离的菌株，经Vitek鉴定系统最后鉴定为107株大肠埃希菌和64株肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.1.2 药敏纸片
阿莫西林/棒酸(AMC，20 μg/10 μg)，头孢他啶(CAZ，30 μg)，头孢曲松(CRO，30 μg)，头孢噻肟(CTX，30 μg)，氨曲南(ATM，30 μg)，均由BBL公司生产。
1.1.3 Etest试条
由瑞典AB BIODISK公司生产，该试条有2个连续的浓度梯度：一端为头孢他啶(MIC：0.5～32 μg/ml)，另一端为头孢他啶/棒酸(MIC：0.125～8 μg/ml)。
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1.1.4 MH培养基
购自浙江省军区防疫检验所，按说明书配制，分装每个9 cm平板，约25 ml MH琼脂。
1.2 方法
1.2.1 纸片相邻法
按琼脂扩散法将同一菌液均匀涂布于2个平皿表面，分别于2平皿中央贴放AMC，并于其上下及左右4方分别距离20 mm、25 mm处贴放CAZ、CRO、CTX和ATM于35℃孵育16～18 h后观察结果，如出现钥匙状为阳性。
1.2.2 Etest法
同纸片相邻法制备药敏平皿，用镊子将Etest条贴放在平皿中央于35℃孵育，16～18 h后读结果，分别判读头孢他啶(TZ)端的MIC和头孢他啶/棒酸(TZL)端的MIC，以TZ/TZL≥4为阳性判断标准。
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2 结果
2.1 大肠埃希菌检出结果
107株大肠埃希菌纸片法检出阳性菌27株，检出率为25.2%。在不同药物纸片中的检出结果如表1，其中ATM的阳性符合率最低为70.4%，其次为CRO为77.8%，CAZ和CTX均为85.2%。另外，相距25 mm的检出率高于20 mm处(P<0.01)。
表1 纸片法检测大肠埃希菌产酶株结果比较
距离(mm)
阳性株数
ATM
CAZ
CTX
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CRO
合计
20
8
11
8
12
15
25
15
17
20
16
24
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19
23
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2.2 肺炎克雷伯菌检出结果
64株肺炎克雷伯纸片法检出阳性菌15株，检出率为23.4%。在不同药物纸片中的检出结果如表2，ATM的符合率为46.7%，CTX为73.3%，CAZ为86.7%，CRO为80%。两纸片相距比较，25 mm时明显优于20 mm(P<0.01)。表2 纸片法检测肺炎克雷伯菌产酶株结果比较
距离(mm)
, 百拇医药 阳性株数
ATM
CAZ
CTX
CRO
合计
20
3
6
5
4
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5
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11
10
11
12
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7
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15
2.3 与Etest检出结果比较 Etest试条检出大肠埃希菌阳性24株，为22.4%，其中3株纸片法为阳性，而Etest为阴性；肺炎克雷伯菌13株为20.3%，其中2株纸片法为阳性，而Etest为阴性。虽Etest较多种纸片法结果低，但均高于单一药物的纸片相邻法。
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3 讨论
3.1 纸片相邻法结果分析
ESBL大多是质粒介导的β-内酰胺酶，主要分为TEM类和SHV类，它们都能被β-内胺酶抑制剂如棒酸、青霉烷砜、Tazabactam(TAZ)所抑制，故在邻近含棒酸的纸片端出现抑菌圈的协同作用(呈钥匙状)从而被检测出来。本实验运用这原理将第3代头孢的药敏纸片同含棒酸的阿莫西林纸片相邻来检测ESBL。结果表明，大肠埃希菌的阳性率为25.2%，肺炎克雷伯菌为23.4%，均高于国内有关报道[3]，这可能与本地区超广谱头孢菌素使用较多或有可能存在局部小流行有关。同时，我们采取多底物检测法，也使其检出率有所提高。从多种药敏纸片检出结果来看，CAZ可作为检测大肠埃希菌的最佳底物，而CRO则为肺炎克雷伯菌产酶株检测的最好药物，它们在两种产酶菌中的检出率分别为85.2%和86.7%。从两纸片相邻距离比较，相距20 mm组的阳性率远低于25 mm组，这主要是相距20 mm易使两抑菌圈融合，不能观察到正确的结果，但为了进一步提高其检出率，我们认为对疑为产ESBL的菌株检测时两纸片间相距为25 mm，若大肠埃希菌用头孢他啶，肺炎克雷伯菌用头孢曲松。
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3.2 2种方法比较
Etest法具有方法便、快速，结果判断随机误差小的特点，从本次实验来看其阳性检出率低于多种底物的纸片法，其中对大肠埃希菌漏检3株，肺炎克雷伯菌2株，这主要是与其作用底物不同有关，Etest法选用的是CAZ作为指示物，而所漏检的5株菌中，其中被ATM检出1株，CTX和CRO检出各2株，就单一药物纸片检出来看，纸片相邻法与Etest法结果较为一致。说明纸片相邻法能替代Etest法，作为临床分离菌产ESBL的有效筛选法。
作者简介：刘 丁，男，1967.02.17生，山东省祁县人，在读博士生，主治医师，讲师，主要从事医院感染方面的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68757992
参考文献
[1] Jacoby G A. Genetics of extended-spectrum beta-lactamases[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1994,13(Suppl):2-7.
[2] Katsanis G P, Spargo J, Ferraro M J, et al. Detection of klebsiella pneumoniac and Escherichia coli strains reducing extended-spectrum β-lactamases[J].J of Clin Microbiol,1994,32(3):691-696.
[3] 熊剑辉.Etest用于革兰阴性杆菌超广谱β-内酰胺酶测定[J].临床检验杂志，1998，16(3)：138-140.
收稿日期：1998-12-16；修回日期：1999-09-22, 百拇医药
单位：刘丁 陈萍 张文俊 邓光贵：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所检验科，重庆 400042；敖平：重庆长安汽车第二职工医院感染监控室，重庆 400023
关键词：超广谱β-内酰胺酶；纸片相邻法；大肠埃希菌；肺炎克雷伯菌；Etest
提要 目的
提要 目的：探讨用纸片相邻法检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶时，两纸片距离及各种底物对结果的影响。方法：采用阿莫西林/棒酸纸片分别与氨曲南、头孢他啶、头孢曲松及头孢噻肟在相邻20 mm、25 mm时进行检测。结果：大肠埃希菌多种纸片法检出率为25.2%，Etest为22.4%；肺炎克雷伯菌纸片法总检出率为23.4%，Etest为20.3%。结论：纸片相邻法应将两纸片距离相间25 mm，头孢他啶、头孢曲松分别可作为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的最佳底物，结果与Etest相似。
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中图法分类号 R378 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(1999)12-0947-02
Detection of extended-spectrum β-lactamases in bacteria with a disk approximation method
超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBL)是以能灭活超广谱头孢菌素、单环类、窄谱头孢菌素及抗革兰氏阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的β-内酰胺酶[1]。随着第3代头孢菌素的广泛使用，产ESBL的细菌也日益增加，建立及完善其检测手段，在给临床医生用药提示和掌握细菌耐药动态方面有着重要作用。目前，检测ESBL的方法主要有纸片相邻法、Etest以及Vitek自动鉴定法[2]，由于Etest试条昂贵，而Vitek法需特殊设备，在临床上应用较少。纸片相邻法因其简便、成本低，故易于临床检测。但该法受影响因素多。为此，我们进行了有关实验，以找出其最佳检测条件，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受试菌株
1998年1月至1998年3月从重庆市6家医院临床微生物室分离的菌株，经Vitek鉴定系统最后鉴定为107株大肠埃希菌和64株肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.1.2 药敏纸片
阿莫西林/棒酸(AMC，20 μg/10 μg)，头孢他啶(CAZ，30 μg)，头孢曲松(CRO，30 μg)，头孢噻肟(CTX，30 μg)，氨曲南(ATM，30 μg)，均由BBL公司生产。
1.1.3 Etest试条
由瑞典AB BIODISK公司生产，该试条有2个连续的浓度梯度：一端为头孢他啶(MIC：0.5～32 μg/ml)，另一端为头孢他啶/棒酸(MIC：0.125～8 μg/ml)。
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1.1.4 MH培养基
购自浙江省军区防疫检验所，按说明书配制，分装每个9 cm平板，约25 ml MH琼脂。
1.2 方法
1.2.1 纸片相邻法
按琼脂扩散法将同一菌液均匀涂布于2个平皿表面，分别于2平皿中央贴放AMC，并于其上下及左右4方分别距离20 mm、25 mm处贴放CAZ、CRO、CTX和ATM于35℃孵育16～18 h后观察结果，如出现钥匙状为阳性。
1.2.2 Etest法
同纸片相邻法制备药敏平皿，用镊子将Etest条贴放在平皿中央于35℃孵育，16～18 h后读结果，分别判读头孢他啶(TZ)端的MIC和头孢他啶/棒酸(TZL)端的MIC，以TZ/TZL≥4为阳性判断标准。
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2 结果
2.1 大肠埃希菌检出结果
107株大肠埃希菌纸片法检出阳性菌27株，检出率为25.2%。在不同药物纸片中的检出结果如表1，其中ATM的阳性符合率最低为70.4%，其次为CRO为77.8%，CAZ和CTX均为85.2%。另外，相距25 mm的检出率高于20 mm处(P<0.01)。
表1 纸片法检测大肠埃希菌产酶株结果比较
距离(mm)
阳性株数
ATM
CAZ
CTX
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CRO
合计
20
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2.2 肺炎克雷伯菌检出结果
64株肺炎克雷伯纸片法检出阳性菌15株，检出率为23.4%。在不同药物纸片中的检出结果如表2，ATM的符合率为46.7%，CTX为73.3%，CAZ为86.7%，CRO为80%。两纸片相距比较，25 mm时明显优于20 mm(P<0.01)。表2 纸片法检测肺炎克雷伯菌产酶株结果比较
距离(mm)
, 百拇医药 阳性株数
ATM
CAZ
CTX
CRO
合计
20
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2.3 与Etest检出结果比较 Etest试条检出大肠埃希菌阳性24株，为22.4%，其中3株纸片法为阳性，而Etest为阴性；肺炎克雷伯菌13株为20.3%，其中2株纸片法为阳性，而Etest为阴性。虽Etest较多种纸片法结果低，但均高于单一药物的纸片相邻法。
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3 讨论
3.1 纸片相邻法结果分析
ESBL大多是质粒介导的β-内酰胺酶，主要分为TEM类和SHV类，它们都能被β-内胺酶抑制剂如棒酸、青霉烷砜、Tazabactam(TAZ)所抑制，故在邻近含棒酸的纸片端出现抑菌圈的协同作用(呈钥匙状)从而被检测出来。本实验运用这原理将第3代头孢的药敏纸片同含棒酸的阿莫西林纸片相邻来检测ESBL。结果表明，大肠埃希菌的阳性率为25.2%，肺炎克雷伯菌为23.4%，均高于国内有关报道[3]，这可能与本地区超广谱头孢菌素使用较多或有可能存在局部小流行有关。同时，我们采取多底物检测法，也使其检出率有所提高。从多种药敏纸片检出结果来看，CAZ可作为检测大肠埃希菌的最佳底物，而CRO则为肺炎克雷伯菌产酶株检测的最好药物，它们在两种产酶菌中的检出率分别为85.2%和86.7%。从两纸片相邻距离比较，相距20 mm组的阳性率远低于25 mm组，这主要是相距20 mm易使两抑菌圈融合，不能观察到正确的结果，但为了进一步提高其检出率，我们认为对疑为产ESBL的菌株检测时两纸片间相距为25 mm，若大肠埃希菌用头孢他啶，肺炎克雷伯菌用头孢曲松。
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3.2 2种方法比较
Etest法具有方法便、快速，结果判断随机误差小的特点，从本次实验来看其阳性检出率低于多种底物的纸片法，其中对大肠埃希菌漏检3株，肺炎克雷伯菌2株，这主要是与其作用底物不同有关，Etest法选用的是CAZ作为指示物，而所漏检的5株菌中，其中被ATM检出1株，CTX和CRO检出各2株，就单一药物纸片检出来看，纸片相邻法与Etest法结果较为一致。说明纸片相邻法能替代Etest法，作为临床分离菌产ESBL的有效筛选法。
作者简介：刘 丁，男，1967.02.17生，山东省祁县人，在读博士生，主治医师，讲师，主要从事医院感染方面的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68757992
参考文献
[1] Jacoby G A. Genetics of extended-spectrum beta-lactamases[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1994,13(Suppl):2-7.
[2] Katsanis G P, Spargo J, Ferraro M J, et al. Detection of klebsiella pneumoniac and Escherichia coli strains reducing extended-spectrum β-lactamases[J].J of Clin Microbiol,1994,32(3):691-696.
[3] 熊剑辉.Etest用于革兰阴性杆菌超广谱β-内酰胺酶测定[J].临床检验杂志，1998，16(3)：138-140.
收稿日期：1998-12-16；修回日期：1999-09-22, 百拇医药