毛囊真皮鞘成纤维细胞的培养
作者：钟白玉 吕中法 刘荣卿 伍津津
单位：第三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038
关键词：真皮鞘成纤维细胞；组织块培养法
第三军医大学学报991222
提要 目的：为了解真皮鞘成纤维细胞的生物学特征。方法：采用酶消化法、组织块法分别进行毛囊真皮鞘成纤维细胞培养。结果：2种方法均获成功。培养的真皮鞘成纤维细胞具有聚集生长的特征，胞体较大，一般有2个突起；酶消化培养法操作简便、省时，但容易混有其它成纤维细胞；组织块法培养的细胞虽然培养速度较慢，但纯度较高。结论：组织块法是进行毛囊真皮鞘成纤维细胞研究较理想的培养方法。
中图法分类号 R322.99;R329.2 文献标识码 B
, http://www.100md.com 文章编号：1000-5404(1999)12-0935-02
Culture of fibroblasts in dermal sheath hair follicle
脱发在临床上十分常见，一些难治性脱发如早秃目前尚无有效的治疗方法。一些研究显示毛乳头细胞在诱导毛囊再生和毛发生长周期的调控中起重要作用，已有报告毛乳头细胞在体内条件下可诱导出完整的毛囊，并且长出毛干[1]。真皮鞘是围绕毛囊最外层的真皮源性组织，有研究认为真皮鞘细胞是毛乳细胞的储备细胞[2]。本文用酶消化法、组织块法分别对真皮鞘成纤维细胞进行培养，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 头皮标本的采集和处理
全层头皮(死后6 h内)取自肾移植尸体。存放于D-Hank's液中，在净化工作台中剃除头发，75%酒精擦2遍，D-Hank's液反复冲洗3遍，每次3～5 min，去除皮下筋膜后剪成0.3～0.5 cm宽的皮条，从真皮与皮下组织交界处剪开。
, 百拇医药
1.2 真皮鞘成纤维细胞的培养
1.2.1 酶消化法
把上述皮下组织部分置入0.5%(PBS配制)的分离酶(Sigma产品)中，4℃消化18 h。D-Hank's液冲洗2遍，用镊子挤出毛囊的上皮部分，置入0.2%(DMEM配制)胶原酶D(DMEM、胶原酶均为Sigma产品)消化，37直至真皮鞘消化成游离细胞，而毛乳头尚未开始消化时为止，约需6～8h。用D-Hank's液2000 r/min离心3次，每次3min，然后加入DMEM，低速离心200～300 r/min、3min，取上清计数，按1×105/瓶，接种到25 ml培养瓶中进行真皮鞘成纤维细胞的培养。
1.2.2 组织块培养法
参照Katsuoka法[3]，略加改进。取部分上述分离的皮下组织，将毛囊从皮下组织中拔出，在解剖显微镜下机械分离出毛囊的上皮部分和真皮鞘，用7号针头(将针尖变成90°)将真皮鞘下部侧面切一小口，轻轻挤出毛乳头，从蒂部切断，把去毛乳头的真皮鞘剪成粟粒大小的组织块，或把整个真皮鞘直接涂布在25 ml培养瓶(鼠尾胶原处理过)上进行真皮鞘成纤维细胞的培养。
, 百拇医药
1.3 细胞传代及计数
真皮鞘成纤维细胞融合后，用0.25%胰酶消化传代、计数、并将其接种到24孔板中，隔日计数，共7个时相点，绘成生长曲线。
2 结果
2.1 酶消化法
胶原酶消化后的真皮鞘成纤维细胞，12 h后大部分细胞即贴壁，长出细胞突起，无明显的停滞期即进入指数生长阶段。
2.2 组织块法
组织块培养法细胞生长缓慢，有明显的停滞期，约需10 d左右，细胞才开始从组织块中长出，随着生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第18天左右细胞进入指数生长阶段。
2.3 真皮鞘成纤维细胞的特征
, 百拇医药
真皮鞘成纤维细胞成以梭形为主，当细胞密度较低时呈聚集性生长的特征，一般有2个胞质突起，少数可有3～4个胞质突起，胞体狭长、胞浆较少，随后细胞向四周呈放射状生长，融合后呈平行排列，传代在10代内细胞形态变化不明显。
2.4 生长曲线
根据各时相点测得的细胞数绘成生长曲线图，见图1。
图1 真皮鞘成纤维细胞生长曲线图
3 讨论
毛囊各种细胞成分的培养是进行毛囊细胞生物学研究的基础，我们用酶消化法和组织块法对真皮鞘成纤细胞的培养均获成功，酶消化法具有细胞生长速度快、培养时间短、工作量相对较小等优点，但容易有成纤维细胞污染，实验中我们发现，该法培养的真皮鞘成纤维细胞中，带3～4个胞质突起的细胞较组织块法多，是否为头皮成纤维细胞污染尚需进一步鉴定。组织块法培养的真皮鞘成纤维细胞虽然速度较慢，但其生长的细胞形态、大小比较一致，与Katsuoka等[3]报告的基本一致。
, 百拇医药
真皮鞘成纤维细胞在胚胎发育、形态学和生物学行为特征上与毛囊的毛乳头细胞是紧密相关的，它们都具有聚集生长的特征，胞体相对较头皮成纤维细胞者大，胞质突起较少，一般只有2个。免疫组化发现这2种细胞均有α-平滑肌肌动蛋白表达，而其它成纤维细胞则没有[4]，真皮鞘成纤维细胞和毛乳头细胞的这些特征很可能与其功能相关，有研究发现真皮鞘成纤维细胞在合适的条件下，可被诱导形成毛乳头，进而诱导毛囊形成，揭示真皮鞘成纤维细胞在毛囊细胞生物中起着重要作用[2]。
作者简介：钟白玉，男，1958.09.25生，四川省邻水县人，主管技师，主要从事皮肤病理方面的研究，发表论文11篇。电话：(023)68754114-73108
参考文献
[1] Reynolds A J, Jaoda C A. Hair follicle reconstruction in vitro[J]. J Dermatol Sci,1994,7(Suppl):84-97.
, 百拇医药
[2] Messenger A G. The control of hair growth: An overview[J].J Invest Dermatol,1993,101(1 Suppl):4s-9s.
[3] Katsuoka K, Schell H, Hornstein O P, et al. Comparative morphological and growth kinetics studies of human hair bulb papilla cells and root sheath fibroblasts in vitro[J]. Arch Dermtol Res,1986,279(1):20-25.
[4] Jahoda C A, Regnolds A J, Chaponnier C, et al. Smooth muscle α-actin is a marker for hair follicle demis in vitro and in ivtro[J]. J Cell Sci,1991,99(Pt 3):627-636.
收稿日期：1999-05-01；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038
关键词：真皮鞘成纤维细胞；组织块培养法
第三军医大学学报991222
提要 目的：为了解真皮鞘成纤维细胞的生物学特征。方法：采用酶消化法、组织块法分别进行毛囊真皮鞘成纤维细胞培养。结果：2种方法均获成功。培养的真皮鞘成纤维细胞具有聚集生长的特征，胞体较大，一般有2个突起；酶消化培养法操作简便、省时，但容易混有其它成纤维细胞；组织块法培养的细胞虽然培养速度较慢，但纯度较高。结论：组织块法是进行毛囊真皮鞘成纤维细胞研究较理想的培养方法。
中图法分类号 R322.99;R329.2 文献标识码 B
, http://www.100md.com 文章编号：1000-5404(1999)12-0935-02
Culture of fibroblasts in dermal sheath hair follicle
脱发在临床上十分常见，一些难治性脱发如早秃目前尚无有效的治疗方法。一些研究显示毛乳头细胞在诱导毛囊再生和毛发生长周期的调控中起重要作用，已有报告毛乳头细胞在体内条件下可诱导出完整的毛囊，并且长出毛干[1]。真皮鞘是围绕毛囊最外层的真皮源性组织，有研究认为真皮鞘细胞是毛乳细胞的储备细胞[2]。本文用酶消化法、组织块法分别对真皮鞘成纤维细胞进行培养，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 头皮标本的采集和处理
全层头皮(死后6 h内)取自肾移植尸体。存放于D-Hank's液中，在净化工作台中剃除头发，75%酒精擦2遍，D-Hank's液反复冲洗3遍，每次3～5 min，去除皮下筋膜后剪成0.3～0.5 cm宽的皮条，从真皮与皮下组织交界处剪开。
, 百拇医药
1.2 真皮鞘成纤维细胞的培养
1.2.1 酶消化法
把上述皮下组织部分置入0.5%(PBS配制)的分离酶(Sigma产品)中，4℃消化18 h。D-Hank's液冲洗2遍，用镊子挤出毛囊的上皮部分，置入0.2%(DMEM配制)胶原酶D(DMEM、胶原酶均为Sigma产品)消化，37直至真皮鞘消化成游离细胞，而毛乳头尚未开始消化时为止，约需6～8h。用D-Hank's液2000 r/min离心3次，每次3min，然后加入DMEM，低速离心200～300 r/min、3min，取上清计数，按1×105/瓶，接种到25 ml培养瓶中进行真皮鞘成纤维细胞的培养。
1.2.2 组织块培养法
参照Katsuoka法[3]，略加改进。取部分上述分离的皮下组织，将毛囊从皮下组织中拔出，在解剖显微镜下机械分离出毛囊的上皮部分和真皮鞘，用7号针头(将针尖变成90°)将真皮鞘下部侧面切一小口，轻轻挤出毛乳头，从蒂部切断，把去毛乳头的真皮鞘剪成粟粒大小的组织块，或把整个真皮鞘直接涂布在25 ml培养瓶(鼠尾胶原处理过)上进行真皮鞘成纤维细胞的培养。
, 百拇医药
1.3 细胞传代及计数
真皮鞘成纤维细胞融合后，用0.25%胰酶消化传代、计数、并将其接种到24孔板中，隔日计数，共7个时相点，绘成生长曲线。
2 结果
2.1 酶消化法
胶原酶消化后的真皮鞘成纤维细胞，12 h后大部分细胞即贴壁，长出细胞突起，无明显的停滞期即进入指数生长阶段。
2.2 组织块法
组织块培养法细胞生长缓慢，有明显的停滞期，约需10 d左右，细胞才开始从组织块中长出，随着生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第18天左右细胞进入指数生长阶段。
2.3 真皮鞘成纤维细胞的特征
, 百拇医药
真皮鞘成纤维细胞成以梭形为主，当细胞密度较低时呈聚集性生长的特征，一般有2个胞质突起，少数可有3～4个胞质突起，胞体狭长、胞浆较少，随后细胞向四周呈放射状生长，融合后呈平行排列，传代在10代内细胞形态变化不明显。
2.4 生长曲线
根据各时相点测得的细胞数绘成生长曲线图，见图1。
图1 真皮鞘成纤维细胞生长曲线图
3 讨论
毛囊各种细胞成分的培养是进行毛囊细胞生物学研究的基础，我们用酶消化法和组织块法对真皮鞘成纤细胞的培养均获成功，酶消化法具有细胞生长速度快、培养时间短、工作量相对较小等优点，但容易有成纤维细胞污染，实验中我们发现，该法培养的真皮鞘成纤维细胞中，带3～4个胞质突起的细胞较组织块法多，是否为头皮成纤维细胞污染尚需进一步鉴定。组织块法培养的真皮鞘成纤维细胞虽然速度较慢，但其生长的细胞形态、大小比较一致，与Katsuoka等[3]报告的基本一致。
, 百拇医药
真皮鞘成纤维细胞在胚胎发育、形态学和生物学行为特征上与毛囊的毛乳头细胞是紧密相关的，它们都具有聚集生长的特征，胞体相对较头皮成纤维细胞者大，胞质突起较少，一般只有2个。免疫组化发现这2种细胞均有α-平滑肌肌动蛋白表达，而其它成纤维细胞则没有[4]，真皮鞘成纤维细胞和毛乳头细胞的这些特征很可能与其功能相关，有研究发现真皮鞘成纤维细胞在合适的条件下，可被诱导形成毛乳头，进而诱导毛囊形成，揭示真皮鞘成纤维细胞在毛囊细胞生物中起着重要作用[2]。
作者简介：钟白玉，男，1958.09.25生，四川省邻水县人，主管技师，主要从事皮肤病理方面的研究，发表论文11篇。电话：(023)68754114-73108
参考文献
[1] Reynolds A J, Jaoda C A. Hair follicle reconstruction in vitro[J]. J Dermatol Sci,1994,7(Suppl):84-97.
, 百拇医药
[2] Messenger A G. The control of hair growth: An overview[J].J Invest Dermatol,1993,101(1 Suppl):4s-9s.
[3] Katsuoka K, Schell H, Hornstein O P, et al. Comparative morphological and growth kinetics studies of human hair bulb papilla cells and root sheath fibroblasts in vitro[J]. Arch Dermtol Res,1986,279(1):20-25.
[4] Jahoda C A, Regnolds A J, Chaponnier C, et al. Smooth muscle α-actin is a marker for hair follicle demis in vitro and in ivtro[J]. J Cell Sci,1991,99(Pt 3):627-636.
收稿日期：1999-05-01；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com