茵陈粗多肽的提取分离及小鼠肝保护作用
作者：胡一桥 谭仁祥 褚明艳 欧文星
单位：(胡一桥 谭仁祥)南京大学生物系(210039)；(褚明艳 欧文星)中国药科大学
关键词：茵陈蒿；多肽；肝保护作用
中草药991204 摘 要 茵陈为菊科植物茵陈蒿 Artemisia capillaris Thumb. 的地上部分。具有清湿热，退黄疸等多种药理作用。本文的目的为：提取及初步分离茵陈中的水溶性多肽，并对其部分肝脏生理活性进行研究。文中测定了小鼠注射茵陈多肽后对药物肝损伤的保护作用，参与鼠巨噬细胞对刚果红的吞噬作用。结果表明：茵陈多肽在小鼠具有显著的肝保护作用，并可以显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
茵陈为菊科植物菌陈蒿 Artemisia capillaris Thumb.的地上部分。具有清湿热，退黄疸等多种药理作用[1]。近年来对茵陈的化学成分及药理方面的研究很多，茵陈的一些新的药理作用也不断被证实， 如具有促进白细胞分裂，增加白细胞数目，提高T细胞的免疫活性，参与机体免疫调节和诱生干扰素等作用，还具有抗肿瘤以及降压作用[2～4]。但大多数的研究集中在脂溶性小分子方面。仅1985年日本 Kitasato 研究所报道茵陈蒿多肽有干扰素诱导功能[5]。因此，本文对茵陈的水溶性多肽进行了初步分离、提取，并对其肝保护作用，以及增强巨噬细胞吞噬作用进行了初步研究。
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1 材料
1.1 动物：小鼠(昆明种)。
1.2 药品：丙酮酸标准液、SGPT底物溶液、2，4-二硝基苯肼由铁医生化教研室提供。肝素由山东枣庄生化厂提供。Sephadex G-50、G-75、DEAE-Sephacel 购于中国科学院上海脑研究所。其余试剂为市售分析纯。
1.3 仪器：H66005超声机(无锡超声电子设备厂)；冷冻高速离心机(Sigma公司)；稳流稳压电泳仪(江苏省丹阳市无线电一厂)；7550UV-VIS 紫外分光光度仪(上海分析仪器厂)。
2 方法
2.1 茵陈粗多肽的提取与分离：
提取：取新鲜茵陈(采自江苏句容，南京大学生物系教授鉴定)地上部分；4 ℃条件下用水浸泡提取12 h，去渣取汁。15 ℃ 4 000 r/min离心15 min，分离出沉淀，留取上清液。将上述上清液用硫酸铵沉淀，静置5 h，3 000 r/min离心15 min，去上清液，取沉淀，室温减压干燥，称重。
, 百拇医药
分离：离子交换树脂脱色：称取DEAE-Sephacel 若干克，先用蒸馏水浸泡，待充分膨胀后进行酸碱处理，用系列浓度Na+的洗脱液进行洗脱，收集样品。将上述粗品用 pH 4.5的缓冲液溶解，用截留分子量3 000的中空纤维超滤，截去分子量小于3 000的小分子，所得的浓缩液冷冻干燥得到多肽粗品。
2.2 高效液相色谱法测定茵陈多肽分子量[6]：色谱柱：BIO-RAD凝胶柱(300 mm × 7.8 mm)， 流动相：0.05 mol/L NaH2PO4，0.5 mol/L Na2HPO4，15 mol/L NaCl，0.1 mol/L pH 6.8；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。取标准品(BIO-RAD公司随柱标准品)进样，确定标准品的保留时间。分子量的对数值对保留时间作图，得到标准曲线。样品进样，由保留时间在标准曲线上查得分子量。结果表明：主要为两个色带，其分子量为：6 000，9 000。
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2.3 小鼠肝保护作用[7，8]：取18～22 g雄性小鼠，随机分成4组，每组10只。分别为生理盐水组，茵陈多肽组(4 mg/mL)，茵陈蒿汤组[9](茵陈醇提取物6 mg/mL，栀子醇提取物3 mg/mL，大黄醇提取物2 mg/mL)，正常对照组。第一天上午，下午；次日上午除正常组外，各组给药1次(10 mg/kg体重，im)，末次给药后0.5 h，各鼠均 ip 扑热息痛200 mg/kg，24 h后取血清，根据标准曲线测定血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶。同时剖取肝脏作病理检查，根据病理切片观察组织学变化。
2.4 小鼠刚果红吞噬作用[10]：小鼠30只，雌雄兼用，随机分成3组，分别 im 生理盐水组，茵陈多肽组(4 mg/mL)，茵陈蒿汤组[9](茵陈醇提取物6 mg/mL，栀子醇提取物3 mg/mL，大黄醇提取物2 mg/mL)。连续给药5 d(10 mg/kg体重)，每天1次。于末次给药后1 h分别用经肝素处理过的毛细管从眼后静脉丛取血50 μL，立即放入5 mL蒸馏水中，使之完全溶血，作为对照管。随即从尾静脉定量注入10 mg/mL刚果红生理盐水溶液10 mL/kg体重。注射后2 min，同法取血50 μL，放入5 mL蒸馏水中溶血，作为试验管，在510 nm波长下比色。
, 百拇医药
3 结果
3.1 小鼠肝保护作用：茵陈多肽对小鼠肝血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶的作用，以及用生理盐水为对照组的统计结果见表1(采用SigmaPlot统计软件)。
茵陈多肽与茵陈蒿汤两组进行t-test统计，结果表明P<0.05，说明茵陈多肽的保肝作用优于茵陈蒿汤组。
小鼠肝脏切片结果表明：正常组包膜完整，无渗出，肝细胞排列整齐，无明显瘀血及变性坏死现象。生理盐水组有大量肝细胞浆疏松化，范围超过肝小叶范围的1/2，肝脏瘀血明显。茵陈多肽组包膜完整，无渗出，肝细胞弥漫性胞浆疏松化广泛，个别细胞气球样变，无明显瘀血、坏死现象。茵陈蒿汤组：包膜完整，无渗出，肝细胞浆疏松广泛，个别细胞出现脂肪性变，无明显瘀血、坏死现象。
表1 茵陈多肽对小鼠肝血清谷氨酸转
, http://www.100md.com 氨酶(SGPT)的作用(x±s) 组 别
鼠数
剂量
(mg/kg)
SGPT
(U/mL)
P值
F值
正常组
10
10
61.12±16.11
生理盐水
, http://www.100md.com
10
10
128.50±47.33
茵陈多肽
10
10
42.56±13.56
<0.001
18
茵陈蒿汤
10
10
58.19±18.82
, 百拇医药
<0.001
18
3.2 小鼠刚果红吞噬作用：各组小鼠定量注射刚果红后，30 s时每毫升血中刚果红浓度，以及与生理盐水对照组的统计结果见表2(采用SigmaPlot统计软件)。表2 茵陈多肽对小鼠刚果红吞噬作用(
±s) 组 别
鼠数
剂量
(mg/kg)
刚果红水平
(μg/mL)
P值
, 百拇医药
F值
生理盐水
10
10
7.04±1.27
茵陈多肽
10
10
3.73±1.95
<0.001
18
茵陈蒿汤
10
, 百拇医药
10
4.00±1.37
<0.001
18
茵陈多肽与茵陈蒿汤两组间进行t-test统计，结果表明P>0.05，说明茵陈多肽与茵陈蒿汤两组间，增强巨噬细胞吞噬作用无显著性差异。
4 讨论
扑热息痛致小鼠肝损伤的中毒剂量和观察指标较明确，且其代谢途径又与四氯化碳、乙硫氨酸、D-半乳糖等有所不同，是一种常用的研究药物代谢、药物相互作用和筛选抗肝炎药的急性肝损伤模型。小鼠肝保护实验统计学分析表明：与生理盐水对照组相比，茵陈多肽组和茵陈蒿汤组均有显著的抗药物肝损伤作用(P<0.001)，而且茵陈多肽比茵陈蒿汤具有更强的抗肝损伤作用(P<0.001)。以往的文献报道抗肝损伤的主要成分为一些小分子物质如氯原酸等[11，但通过实验我们发现茵陈中的大分子同样对肝损伤有保护作用，甚至更强。
, 百拇医药
吞噬作用是巨噬细胞的主要生物学特征，它在机体的非特异性和特殊性异性免疫反应中，在第Ⅳ类变态反应的炎症过程中，以及在肿瘤免疫中都具有重要的作用，因而日益受到人们的重视。根据实验及统计结果可以看出，茵陈多肽，茵陈蒿汤都可以显著增强巨噬细胞的吞噬能力，提高机体免疫力。作用与对照组相比在统计学上有显著差异。茵陈多肽与茵陈蒿汤的作用在统计学上无显著差异。
参考文献
1 阴健，等.中药现代研究与临床应用.北京：中医古籍出版社，1995：484
2 褚明艳，等.中草药，1998 29：516
3 洪振丰，等.福建中医药，1991，22(2)：50
4 Wu T S，et al. Phytochemistry, 1998,47(8):1645
, 百拇医药
5 Kitasato Institute, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 82 18,622
6 师治贤，等.生物大分子的液相色谱分离和制备.北京：科学出版社，1996：262
7 徐秀兰，等.生物化学实验指导.北京：中国医药科技出版社，1994：24
8 陈重阳，等.中国药理学通报, 1988，4(2)：124
9 赵新先.中药注射剂.北京：人民卫生出版社，1998：365
10 严宣左，等.北京中医学院学报，1980，(1)：40
11 胡润生，等.药学学报，1965，12(5)：289
收稿日期：1999-07-20, 百拇医药
单位：(胡一桥 谭仁祥)南京大学生物系(210039)；(褚明艳 欧文星)中国药科大学
关键词：茵陈蒿；多肽；肝保护作用
中草药991204 摘 要 茵陈为菊科植物茵陈蒿 Artemisia capillaris Thumb. 的地上部分。具有清湿热，退黄疸等多种药理作用。本文的目的为：提取及初步分离茵陈中的水溶性多肽，并对其部分肝脏生理活性进行研究。文中测定了小鼠注射茵陈多肽后对药物肝损伤的保护作用，参与鼠巨噬细胞对刚果红的吞噬作用。结果表明：茵陈多肽在小鼠具有显著的肝保护作用，并可以显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
茵陈为菊科植物菌陈蒿 Artemisia capillaris Thumb.的地上部分。具有清湿热，退黄疸等多种药理作用[1]。近年来对茵陈的化学成分及药理方面的研究很多，茵陈的一些新的药理作用也不断被证实， 如具有促进白细胞分裂，增加白细胞数目，提高T细胞的免疫活性，参与机体免疫调节和诱生干扰素等作用，还具有抗肿瘤以及降压作用[2～4]。但大多数的研究集中在脂溶性小分子方面。仅1985年日本 Kitasato 研究所报道茵陈蒿多肽有干扰素诱导功能[5]。因此，本文对茵陈的水溶性多肽进行了初步分离、提取，并对其肝保护作用，以及增强巨噬细胞吞噬作用进行了初步研究。
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1 材料
1.1 动物：小鼠(昆明种)。
1.2 药品：丙酮酸标准液、SGPT底物溶液、2，4-二硝基苯肼由铁医生化教研室提供。肝素由山东枣庄生化厂提供。Sephadex G-50、G-75、DEAE-Sephacel 购于中国科学院上海脑研究所。其余试剂为市售分析纯。
1.3 仪器：H66005超声机(无锡超声电子设备厂)；冷冻高速离心机(Sigma公司)；稳流稳压电泳仪(江苏省丹阳市无线电一厂)；7550UV-VIS 紫外分光光度仪(上海分析仪器厂)。
2 方法
2.1 茵陈粗多肽的提取与分离：
提取：取新鲜茵陈(采自江苏句容，南京大学生物系教授鉴定)地上部分；4 ℃条件下用水浸泡提取12 h，去渣取汁。15 ℃ 4 000 r/min离心15 min，分离出沉淀，留取上清液。将上述上清液用硫酸铵沉淀，静置5 h，3 000 r/min离心15 min，去上清液，取沉淀，室温减压干燥，称重。
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分离：离子交换树脂脱色：称取DEAE-Sephacel 若干克，先用蒸馏水浸泡，待充分膨胀后进行酸碱处理，用系列浓度Na+的洗脱液进行洗脱，收集样品。将上述粗品用 pH 4.5的缓冲液溶解，用截留分子量3 000的中空纤维超滤，截去分子量小于3 000的小分子，所得的浓缩液冷冻干燥得到多肽粗品。
2.2 高效液相色谱法测定茵陈多肽分子量[6]：色谱柱：BIO-RAD凝胶柱(300 mm × 7.8 mm)， 流动相：0.05 mol/L NaH2PO4，0.5 mol/L Na2HPO4，15 mol/L NaCl，0.1 mol/L pH 6.8；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。取标准品(BIO-RAD公司随柱标准品)进样，确定标准品的保留时间。分子量的对数值对保留时间作图，得到标准曲线。样品进样，由保留时间在标准曲线上查得分子量。结果表明：主要为两个色带，其分子量为：6 000，9 000。
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2.3 小鼠肝保护作用[7，8]：取18～22 g雄性小鼠，随机分成4组，每组10只。分别为生理盐水组，茵陈多肽组(4 mg/mL)，茵陈蒿汤组[9](茵陈醇提取物6 mg/mL，栀子醇提取物3 mg/mL，大黄醇提取物2 mg/mL)，正常对照组。第一天上午，下午；次日上午除正常组外，各组给药1次(10 mg/kg体重，im)，末次给药后0.5 h，各鼠均 ip 扑热息痛200 mg/kg，24 h后取血清，根据标准曲线测定血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶。同时剖取肝脏作病理检查，根据病理切片观察组织学变化。
2.4 小鼠刚果红吞噬作用[10]：小鼠30只，雌雄兼用，随机分成3组，分别 im 生理盐水组，茵陈多肽组(4 mg/mL)，茵陈蒿汤组[9](茵陈醇提取物6 mg/mL，栀子醇提取物3 mg/mL，大黄醇提取物2 mg/mL)。连续给药5 d(10 mg/kg体重)，每天1次。于末次给药后1 h分别用经肝素处理过的毛细管从眼后静脉丛取血50 μL，立即放入5 mL蒸馏水中，使之完全溶血，作为对照管。随即从尾静脉定量注入10 mg/mL刚果红生理盐水溶液10 mL/kg体重。注射后2 min，同法取血50 μL，放入5 mL蒸馏水中溶血，作为试验管，在510 nm波长下比色。
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3 结果
3.1 小鼠肝保护作用：茵陈多肽对小鼠肝血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶的作用，以及用生理盐水为对照组的统计结果见表1(采用SigmaPlot统计软件)。
茵陈多肽与茵陈蒿汤两组进行t-test统计，结果表明P<0.05，说明茵陈多肽的保肝作用优于茵陈蒿汤组。
小鼠肝脏切片结果表明：正常组包膜完整，无渗出，肝细胞排列整齐，无明显瘀血及变性坏死现象。生理盐水组有大量肝细胞浆疏松化，范围超过肝小叶范围的1/2，肝脏瘀血明显。茵陈多肽组包膜完整，无渗出，肝细胞弥漫性胞浆疏松化广泛，个别细胞气球样变，无明显瘀血、坏死现象。茵陈蒿汤组：包膜完整，无渗出，肝细胞浆疏松广泛，个别细胞出现脂肪性变，无明显瘀血、坏死现象。
表1 茵陈多肽对小鼠肝血清谷氨酸转
, http://www.100md.com 氨酶(SGPT)的作用(x±s) 组 别
鼠数
剂量
(mg/kg)
SGPT
(U/mL)
P值
F值
正常组
10
10
61.12±16.11
生理盐水
, http://www.100md.com
10
10
128.50±47.33
茵陈多肽
10
10
42.56±13.56
<0.001
18
茵陈蒿汤
10
10
58.19±18.82
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<0.001
18
3.2 小鼠刚果红吞噬作用：各组小鼠定量注射刚果红后，30 s时每毫升血中刚果红浓度，以及与生理盐水对照组的统计结果见表2(采用SigmaPlot统计软件)。表2 茵陈多肽对小鼠刚果红吞噬作用(
±s) 组 别鼠数
剂量
(mg/kg)
刚果红水平
(μg/mL)
P值
, 百拇医药
F值
生理盐水
10
10
7.04±1.27
茵陈多肽
10
10
3.73±1.95
<0.001
18
茵陈蒿汤
10
, 百拇医药
10
4.00±1.37
<0.001
18
茵陈多肽与茵陈蒿汤两组间进行t-test统计，结果表明P>0.05，说明茵陈多肽与茵陈蒿汤两组间，增强巨噬细胞吞噬作用无显著性差异。
4 讨论
扑热息痛致小鼠肝损伤的中毒剂量和观察指标较明确，且其代谢途径又与四氯化碳、乙硫氨酸、D-半乳糖等有所不同，是一种常用的研究药物代谢、药物相互作用和筛选抗肝炎药的急性肝损伤模型。小鼠肝保护实验统计学分析表明：与生理盐水对照组相比，茵陈多肽组和茵陈蒿汤组均有显著的抗药物肝损伤作用(P<0.001)，而且茵陈多肽比茵陈蒿汤具有更强的抗肝损伤作用(P<0.001)。以往的文献报道抗肝损伤的主要成分为一些小分子物质如氯原酸等[11，但通过实验我们发现茵陈中的大分子同样对肝损伤有保护作用，甚至更强。
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吞噬作用是巨噬细胞的主要生物学特征，它在机体的非特异性和特殊性异性免疫反应中，在第Ⅳ类变态反应的炎症过程中，以及在肿瘤免疫中都具有重要的作用，因而日益受到人们的重视。根据实验及统计结果可以看出，茵陈多肽，茵陈蒿汤都可以显著增强巨噬细胞的吞噬能力，提高机体免疫力。作用与对照组相比在统计学上有显著差异。茵陈多肽与茵陈蒿汤的作用在统计学上无显著差异。
参考文献
1 阴健，等.中药现代研究与临床应用.北京：中医古籍出版社，1995：484
2 褚明艳，等.中草药，1998 29：516
3 洪振丰，等.福建中医药，1991，22(2)：50
4 Wu T S，et al. Phytochemistry, 1998,47(8):1645
, 百拇医药
5 Kitasato Institute, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 82 18,622
6 师治贤，等.生物大分子的液相色谱分离和制备.北京：科学出版社，1996：262
7 徐秀兰，等.生物化学实验指导.北京：中国医药科技出版社，1994：24
8 陈重阳，等.中国药理学通报, 1988，4(2)：124
9 赵新先.中药注射剂.北京：人民卫生出版社，1998：365
10 严宣左，等.北京中医学院学报，1980，(1)：40
11 胡润生，等.药学学报，1965，12(5)：289
收稿日期：1999-07-20, 百拇医药