甲状腺素对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞表达IL-3 mRNA的影响
作者：章梅 夏天 靳风烁 颜真 吴少华 张仲海
单位：章 梅 夏 天 吴少华 张仲海 (中国人民解放军第四军医大学西京医院中医科 陕西省西安市 710033)； 颜 真 (中国人民解放军第四军医大学生物技术中心)； 靳风烁 (中国人民解放军第三军医大学大坪医院泌外科)
关键词：甲状腺素；脾虚；白细胞介素-3；核糖核酸，信使
世界华人消化杂志991231 Subject headings thyroxine; spleen asthenia; interleukin-3 mRNA
中国图书馆分类号 R256.3
白介素3(IL-3)是一种多功能造血干细胞刺激因子，因而具有调节体内造血功能的作用[1].甲状腺素可通过神经内分泌免疫调节环路改善造血功能.为探讨甲状腺素对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3表达的影响，我们在ConA刺激的脾细胞和胸腺细胞中加入甲状腺素，用斑点杂交法检测其对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3 mRNA的影响.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c 6周龄～8周龄纯系♂小鼠，体质量19g±3g，由本校动物中心提供.甲状腺素T3，使用T3放免药盒标准品，上海原子能研究所生产；RPMI 1640培养液，美国Gibco；新生牛血清，杭州四季青制品厂，分装-20℃冻存；ConA美国Sigma；IL-3基因探针，靳风烁博士惠赠；总RNA提取试剂盒Promaga.
1.2 方法 将24只BALB/c小鼠随机分为3组，每组8只.①正常组(controls)：皮下注射生理盐水0.2mL/d，同时灌服蒸馏水0.25mL/d；②脾虚组(MMSA)：皮下注射利舍平(利血平)0.3mg/(kg.d)，并灌服蒸馏水0.25mL/d；③四君子汤治疗组(MTSD)：皮下注射利舍平0.3mg/(kg.d)，并灌服四君子汤煎液0.25mL/d(含生药1g)，于d6始，脾虚组小鼠出现食少，少动诸症状，于d12脾虚组小鼠稀便，少动，食少，体重减轻等脾虚诸症明显加重，而治疗组及正常组均无此表现.脾细胞悬液制备按常规方法进行[2].细胞悬于加15g/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，浓度为8×109/L，用进口24孔培养板培养，每孔加相应细胞悬液100μL，ConA 50μL，甲状腺素50μL.每孔终体积为200μL(同时设不加甲状腺素的阴性对照孔，每个样品均设3个复孔)，在37℃ 50mL/L CO2，饱和湿度条件下静止培养20h.细胞总RNA提取按试剂盒说明进行，分别收集各孔细胞，PBS 5mL洗涤2次；加1mL变性液裂解细胞；加0.1体积2mol/L NaAc(pH4.0)及等体积酚-氯仿-异戊醇抽提；冰浴15min，10000r/min，4℃离心20min；上层水相加等体积异丙醇，-20℃过夜；10000r/min，4℃离心20min；加0.5mL变性液溶解RNA，加0.5mL异丙醇1h沉淀RNA；10000r/min，40℃离心15min，沉淀洗涤，抽干，保存于100μL TE液中(-20℃).取样本RNA 10μL，加1kg/L甲酰胺20μL，370g/L甲醛7μL，2×SSC 2μL，68℃作用15min，然后用裂隙式点样器在20×SSC处理过的硝酸纤维素膜上点样，自然干燥后于80℃烘烤2h，按Dig试剂盒法进行预杂交、杂交、洗膜，显色，24h观察结果.杂交结果用HPVectra PC微机图象处理系统进行光密度扫描，用曝光斑点的平均A值(OD值)X面积代表脾细胞IL-3 mRNA的相对含量.
, 百拇医药
2 结果
脾虚组脾淋巴细胞生成IL-3 mRNA较正常组明显低下，四君子汤治疗组较脾虚组明显升高，与正常组无显著差异(P>0.05，表1).在甲状腺素作用下，3组IL-3 mRNA表达水平相近，无显著差别，但加入T3后，相对增加的表达水平则脾虚组明显大于正常组和四君子汤治疗组(P<0.05，表2).
表1 三组小鼠淋巴细胞生成IL-3 mRNA比较 (n=8，
±s) 组别
IL-3 mRNA
脾
胸腺
对照组
, 百拇医药
36.81±5.32
0.941±0.003
MMSA
26.83±4.17bd
0.402±0.003bd
MTSD
35.96±3.29
0.944±0.002
bP<0.01，vs对照；dP<0.01，vs MTSD.
表2 甲状腺素对三组小鼠淋巴细胞生成IL-3 mRNA作用比较 (n=8,±s) 组别
, 百拇医药
IL-3mRNA
相对增加的表达水平
脾
胸腺
脾
胸腺
对照组
52.28±4.17
1.763±0.087
15.54±2.13
0.742±0.013
MMSA
, 百拇医药 53.16±3.94
1.772±0.065
26.83±4.25b
1.253±0.24b
MTSD
54.45±4.92
1.779±0.058
19.18±4.16a
0.974±0.021a
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照.
, 百拇医药
3 讨论
白介素3主要由丝裂原或抗原刺激后的T淋巴细胞产生[1]，它参与调节多功能造血干细胞和各系祖细胞的分化、增殖，因而具有调节造血的功能[3]T细胞受抗原或有丝分裂刺激后产生的多种因子中，IL-3与造血的关系最为密切.IL-3是一种糖蛋白质，又称多功能造血干细胞刺激因子.它作用于骨髓衍化的多功能造血干细胞各系祖细胞，刺激其增殖，分化[4]，影响淋巴细胞的生长和活化[5]，作用于成熟粒细胞促进其功能活性[6]，促进造血干细胞的自我更新[7].本实验结果表明，脾虚时脾细胞或胸腺细胞IL-3 mRNA的表达低于正常组，四君子汤治疗组和正常组则无明显差异，说明脾虚时机体的造血功能是低下的，而健脾(四君子汤治疗后)可明显提高脾细胞和胸腺细胞IL-3 mRNA的表达，说明脾与造血功能有密切关系.进一步研究表明，在培养的小鼠脾或胸腺细胞中加入T3，即在甲状腺素作用下，3组IL-3 mRNA相对增加的表达水平则脾虚组明显大于正常组和四君子汤治疗组(P<0.01)，进一步证明甲状腺作为一种内分泌激素通过神经内分泌免疫调节环路改善低下的造血功能，使之达到平衡状态.甲状腺素的作用与机体的状态有关，对不同造血状态的机体，甲状腺素能发挥相应的调节作用.同时研究表明四君子汤治疗组和正常组的脾或胸腺淋巴细胞在加入甲状腺素后的IL-3 mRNA的表达具有显著差异(P<0.05)，结果说明四君子汤亦参与造血功能的调节，表明其对淋巴细胞IL-3 mRNA表达有一定促进作用，四君子汤是通过健脾增加脾的运化功能而调节造血功能的.
, 百拇医药
我们的研究结果表明，脾虚与机体的造血功能有密切关系，脾虚时存在T淋巴细胞IL-3 mRNA表达下降，而甲状腺素可改善T淋巴细胞IL-3 mRNA的表达，改善造血功能，通过神经内分泌免疫调节环路共同组成的反馈环路，使机体维持于自稳态，与中医脾主运化，化气生血即脾生血的理论认识相符合，有助于从神经内分泌免疫调节网络和分子水平的角度加深对脾本质的认识.
通讯作者 章梅
参考文献
1 Nicola NA，Vadas M.Hemopoietic colony-stimulating factors.Immunol Today，1984;5:76
2 Sideras P，Susanne BL，Severinson E.Partial biochemical characterization of lgG inducing factor.Eur J Immunol，1985;15:593
, 百拇医药
3 Yokotao T，Lee F，Rennick D.Isolation and characterization of a mouse cDNA clone that express mast cell growth factor activity in monkey cells.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:1070
4 Messner HA，Kamo Y，Jama IN. Growth of human hemopoietic colonies in response to recombiant gibbon IL.Proc Natl Acad Sci USA，1987;84:6765
5 Rothenberg ME，Nwen WF，Silberstein DS.Human eosinophils have prolonged survival，enhanced functional properties.J Clin Invest，1988;81:1986
6 Kobayashi M，Van Leemwen BH，Elsburg S.IL-3 is more effective than other colony stimulating factors derived colony-forming cell in vivo.Blood，1989;73:1836
7 Valent P，Schmidt G，Besemer J.IL-3 is a differentiation factor for human basophils.Blood，1989;73:1763
收稿日期 1998-11-20, http://www.100md.com
单位：章 梅 夏 天 吴少华 张仲海 (中国人民解放军第四军医大学西京医院中医科 陕西省西安市 710033)； 颜 真 (中国人民解放军第四军医大学生物技术中心)； 靳风烁 (中国人民解放军第三军医大学大坪医院泌外科)
关键词：甲状腺素；脾虚；白细胞介素-3；核糖核酸，信使
世界华人消化杂志991231 Subject headings thyroxine; spleen asthenia; interleukin-3 mRNA
中国图书馆分类号 R256.3
白介素3(IL-3)是一种多功能造血干细胞刺激因子，因而具有调节体内造血功能的作用[1].甲状腺素可通过神经内分泌免疫调节环路改善造血功能.为探讨甲状腺素对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3表达的影响，我们在ConA刺激的脾细胞和胸腺细胞中加入甲状腺素，用斑点杂交法检测其对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3 mRNA的影响.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c 6周龄～8周龄纯系♂小鼠，体质量19g±3g，由本校动物中心提供.甲状腺素T3，使用T3放免药盒标准品，上海原子能研究所生产；RPMI 1640培养液，美国Gibco；新生牛血清，杭州四季青制品厂，分装-20℃冻存；ConA美国Sigma；IL-3基因探针，靳风烁博士惠赠；总RNA提取试剂盒Promaga.
1.2 方法 将24只BALB/c小鼠随机分为3组，每组8只.①正常组(controls)：皮下注射生理盐水0.2mL/d，同时灌服蒸馏水0.25mL/d；②脾虚组(MMSA)：皮下注射利舍平(利血平)0.3mg/(kg.d)，并灌服蒸馏水0.25mL/d；③四君子汤治疗组(MTSD)：皮下注射利舍平0.3mg/(kg.d)，并灌服四君子汤煎液0.25mL/d(含生药1g)，于d6始，脾虚组小鼠出现食少，少动诸症状，于d12脾虚组小鼠稀便，少动，食少，体重减轻等脾虚诸症明显加重，而治疗组及正常组均无此表现.脾细胞悬液制备按常规方法进行[2].细胞悬于加15g/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，浓度为8×109/L，用进口24孔培养板培养，每孔加相应细胞悬液100μL，ConA 50μL，甲状腺素50μL.每孔终体积为200μL(同时设不加甲状腺素的阴性对照孔，每个样品均设3个复孔)，在37℃ 50mL/L CO2，饱和湿度条件下静止培养20h.细胞总RNA提取按试剂盒说明进行，分别收集各孔细胞，PBS 5mL洗涤2次；加1mL变性液裂解细胞；加0.1体积2mol/L NaAc(pH4.0)及等体积酚-氯仿-异戊醇抽提；冰浴15min，10000r/min，4℃离心20min；上层水相加等体积异丙醇，-20℃过夜；10000r/min，4℃离心20min；加0.5mL变性液溶解RNA，加0.5mL异丙醇1h沉淀RNA；10000r/min，40℃离心15min，沉淀洗涤，抽干，保存于100μL TE液中(-20℃).取样本RNA 10μL，加1kg/L甲酰胺20μL，370g/L甲醛7μL，2×SSC 2μL，68℃作用15min，然后用裂隙式点样器在20×SSC处理过的硝酸纤维素膜上点样，自然干燥后于80℃烘烤2h，按Dig试剂盒法进行预杂交、杂交、洗膜，显色，24h观察结果.杂交结果用HPVectra PC微机图象处理系统进行光密度扫描，用曝光斑点的平均A值(OD值)X面积代表脾细胞IL-3 mRNA的相对含量.
, 百拇医药
2 结果
脾虚组脾淋巴细胞生成IL-3 mRNA较正常组明显低下，四君子汤治疗组较脾虚组明显升高，与正常组无显著差异(P>0.05，表1).在甲状腺素作用下，3组IL-3 mRNA表达水平相近，无显著差别，但加入T3后，相对增加的表达水平则脾虚组明显大于正常组和四君子汤治疗组(P<0.05，表2).
表1 三组小鼠淋巴细胞生成IL-3 mRNA比较 (n=8，
±s) 组别IL-3 mRNA
脾
胸腺
对照组
, 百拇医药
36.81±5.32
0.941±0.003
MMSA
26.83±4.17bd
0.402±0.003bd
MTSD
35.96±3.29
0.944±0.002
bP<0.01，vs对照；dP<0.01，vs MTSD.
表2 甲状腺素对三组小鼠淋巴细胞生成IL-3 mRNA作用比较 (n=8,
±s) 组别, 百拇医药
IL-3mRNA
相对增加的表达水平
脾
胸腺
脾
胸腺
对照组
52.28±4.17
1.763±0.087
15.54±2.13
0.742±0.013
MMSA
, 百拇医药 53.16±3.94
1.772±0.065
26.83±4.25b
1.253±0.24b
MTSD
54.45±4.92
1.779±0.058
19.18±4.16a
0.974±0.021a
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照.
, 百拇医药
3 讨论
白介素3主要由丝裂原或抗原刺激后的T淋巴细胞产生[1]，它参与调节多功能造血干细胞和各系祖细胞的分化、增殖，因而具有调节造血的功能[3]T细胞受抗原或有丝分裂刺激后产生的多种因子中，IL-3与造血的关系最为密切.IL-3是一种糖蛋白质，又称多功能造血干细胞刺激因子.它作用于骨髓衍化的多功能造血干细胞各系祖细胞，刺激其增殖，分化[4]，影响淋巴细胞的生长和活化[5]，作用于成熟粒细胞促进其功能活性[6]，促进造血干细胞的自我更新[7].本实验结果表明，脾虚时脾细胞或胸腺细胞IL-3 mRNA的表达低于正常组，四君子汤治疗组和正常组则无明显差异，说明脾虚时机体的造血功能是低下的，而健脾(四君子汤治疗后)可明显提高脾细胞和胸腺细胞IL-3 mRNA的表达，说明脾与造血功能有密切关系.进一步研究表明，在培养的小鼠脾或胸腺细胞中加入T3，即在甲状腺素作用下，3组IL-3 mRNA相对增加的表达水平则脾虚组明显大于正常组和四君子汤治疗组(P<0.01)，进一步证明甲状腺作为一种内分泌激素通过神经内分泌免疫调节环路改善低下的造血功能，使之达到平衡状态.甲状腺素的作用与机体的状态有关，对不同造血状态的机体，甲状腺素能发挥相应的调节作用.同时研究表明四君子汤治疗组和正常组的脾或胸腺淋巴细胞在加入甲状腺素后的IL-3 mRNA的表达具有显著差异(P<0.05)，结果说明四君子汤亦参与造血功能的调节，表明其对淋巴细胞IL-3 mRNA表达有一定促进作用，四君子汤是通过健脾增加脾的运化功能而调节造血功能的.
, 百拇医药
我们的研究结果表明，脾虚与机体的造血功能有密切关系，脾虚时存在T淋巴细胞IL-3 mRNA表达下降，而甲状腺素可改善T淋巴细胞IL-3 mRNA的表达，改善造血功能，通过神经内分泌免疫调节环路共同组成的反馈环路，使机体维持于自稳态，与中医脾主运化，化气生血即脾生血的理论认识相符合，有助于从神经内分泌免疫调节网络和分子水平的角度加深对脾本质的认识.
通讯作者 章梅
参考文献
1 Nicola NA，Vadas M.Hemopoietic colony-stimulating factors.Immunol Today，1984;5:76
2 Sideras P，Susanne BL，Severinson E.Partial biochemical characterization of lgG inducing factor.Eur J Immunol，1985;15:593
, 百拇医药
3 Yokotao T，Lee F，Rennick D.Isolation and characterization of a mouse cDNA clone that express mast cell growth factor activity in monkey cells.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:1070
4 Messner HA，Kamo Y，Jama IN. Growth of human hemopoietic colonies in response to recombiant gibbon IL.Proc Natl Acad Sci USA，1987;84:6765
5 Rothenberg ME，Nwen WF，Silberstein DS.Human eosinophils have prolonged survival，enhanced functional properties.J Clin Invest，1988;81:1986
6 Kobayashi M，Van Leemwen BH，Elsburg S.IL-3 is more effective than other colony stimulating factors derived colony-forming cell in vivo.Blood，1989;73:1836
7 Valent P，Schmidt G，Besemer J.IL-3 is a differentiation factor for human basophils.Blood，1989;73:1763
收稿日期 1998-11-20, http://www.100md.com