非甲-非庚型肝炎患者血清中输血传播病毒的检测
作者：蔡晓莉 谭奕洲 唐漾波
单位：广州市第八人民医院肝炎研究所(510060)
关键词：输血传播病毒；半巢式聚合酶链反应；非甲-非庚型肝炎
广东医学991220 【摘要】 目的 了解非甲-非庚型肝炎患者血清中输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)的感染情况及临床特点。方法 用半巢式聚合酶链反应方法检测20例非甲-非庚型肝炎患者血清中TTV-DNA，特异性引物位于TTV基因组的ORF1保守区。结果 20例非甲-非庚型肝炎患者中，有5例存在TTV感染。TTV感染者病程有轻有重，表现为急性无黄疸性肝炎、急性黄疸性肝炎及轻度慢性肝炎。结论 非甲-非庚型肝炎的患者中存在TTV的感染，并可能是致病原因。临床表现为急性或轻度慢性肝炎。TTV除血传播外，可能存在肠道传播。
输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)是1997年底才被发现与肝炎相关的新病毒，现已知TTV是一个3.7 kb无包膜的单股DNA病毒，含有ORF1与ORF2两个开放读码框，分别编码770与202个氨基酸[1，2]，暂命名为TTV。为了解非甲-非庚型肝炎患者TTV的感染情况及临床特点，我们对20例非甲-非庚型肝炎的血清进行了TTV-DNA的检测，并对其临床及流行病学特点进行了分析。
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1 资料与方法
1.1 研究对象 本组患者均为我院1998年9月～1999年4月期间的住院及门诊患者。
1.2 检测方法 抗HAV-IgM、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用ELISA方法，HBV-DNA、HCV-RNA、HEV-RNA及HGV-RNA的检测分别采用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-巢式PCR方法。
1.3 TTV-DNA检测 引物位于TTV ORF1保守区，其序列为外正链5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAACAT-3′；外负链5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT-3′；内正链5′-GGCAACATGTTATGGATAGACTGG-3′；内负链同外负链。
1.4 提取TTV-DNA 血清100 μL溶于300 μL变性溶液中[3]，充分混匀后，冰浴15 min，依次加入水饱和酚500 μL、氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100 μL，混匀后静置5 min,12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液加入等量的异丙醇，-20℃过夜后12 000 r/min离心15 min，真空抽干，加入去核酸水38 μL，反复指弹使之溶解。
, 百拇医药
1.5 PCR反应 采用半巢式聚合酶链反应方法，在上述DNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对外引物及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第1次PCR循环，循环参数为94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，共35个循环，最后延伸5 min。于离心管中加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。
1.6 产物检测 取第2次PCR产物10 μL进行20%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 g/L)电泳，紫外检测仪观察结果，于356 bp处出现特异性荧光条带为阳性，否则为阴性，检测过程中采用已知TTV-DNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。
2 结果
2.1 PCR产物电泳结果 阳性标本扩增产物356 bp与预期大小一致。
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2.2 TTV-DNA检测结果 20例非甲-非庚型肝炎患者血清中检出5例TTV-DNA阳性，阳性率为25%。
3 讨论
目前，TTV的诊断主要依据PCR检测，而不同肝炎病毒在患者血清中的滴度水平差别很大，TTV在血清中滴度只有103左右[2]，低于HBV和HCV，为提高敏感性必须进行二次PCR。由于PCR方法的局限性，应建立ELISA，以证实机体对TTV感染的免疫应答情况，从而可以更加全面地了解TTV的临床和流行病学特征，有利于阐述TTV与肝炎的关系。
采用半巢式PCR法对广州地区20例非甲-非庚型肝炎患者血清进行TTV-DNA检测，结果5例阳性(25%)，表明广州地区存在TTV感染，本组非甲-非庚型肝炎患者中TTV感染率较高，但比深圳地区的检出率(48%)[4]要低，可能由于不同区段引物的检出率有所差异。
, 百拇医药
临床上5例TTV感染者都出现疲乏、纳差，2例出现腹胀，3例出现右上腹隐痛，2例触及肝脏，1例出现低热；其中2例表现为急性无黄疸性肝炎，症状较轻微；2例表现为急性黄疸性肝炎，症状较重，ALT 250 u/L以上，胆红素230 μmol/L以上；1例临床上表现为轻度慢性肝炎，表现TTV感染可单独引致肝炎，其临床症状有轻有重。多数报道TTV感染后，肝炎临床症状不十分明显或症状较轻。本文所研究对象多为有明显肝炎症状的住院患者，从而忽略了无症状或症状较轻微者，要最终证明TTV和肝炎的关系，仍需大量的基础和临床研究。
5例TTV感染者中，2例有术中输血史，2例经常在外面饮食，其中1例经常吃生海鲜，表明TTV可经多种途径传播。骆抗先等[5]对武汉某职校单项转氨酶升高的患者进行调查分析，在血清和粪便中均扩增出与TTV有高度同源性的片段。因此，TTV除经血制品传播外，可能还经肠道途径传播，故有必要将TTV的检测列为献血员及饮食从业人员筛查项目。
, 百拇医药 参考文献
1 Nishizaqa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase leves in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophy Res Commun, 1997, 241:92
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and charaterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1
3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by aciguanidinium thiocyanate-pgenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156
4 马为民，周伯平，王火生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167
5 骆抗先，章 廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病毒学的初步研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：161, 百拇医药
单位：广州市第八人民医院肝炎研究所(510060)
关键词：输血传播病毒；半巢式聚合酶链反应；非甲-非庚型肝炎
广东医学991220 【摘要】 目的 了解非甲-非庚型肝炎患者血清中输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)的感染情况及临床特点。方法 用半巢式聚合酶链反应方法检测20例非甲-非庚型肝炎患者血清中TTV-DNA，特异性引物位于TTV基因组的ORF1保守区。结果 20例非甲-非庚型肝炎患者中，有5例存在TTV感染。TTV感染者病程有轻有重，表现为急性无黄疸性肝炎、急性黄疸性肝炎及轻度慢性肝炎。结论 非甲-非庚型肝炎的患者中存在TTV的感染，并可能是致病原因。临床表现为急性或轻度慢性肝炎。TTV除血传播外，可能存在肠道传播。
输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)是1997年底才被发现与肝炎相关的新病毒，现已知TTV是一个3.7 kb无包膜的单股DNA病毒，含有ORF1与ORF2两个开放读码框，分别编码770与202个氨基酸[1，2]，暂命名为TTV。为了解非甲-非庚型肝炎患者TTV的感染情况及临床特点，我们对20例非甲-非庚型肝炎的血清进行了TTV-DNA的检测，并对其临床及流行病学特点进行了分析。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 研究对象 本组患者均为我院1998年9月～1999年4月期间的住院及门诊患者。
1.2 检测方法 抗HAV-IgM、HBsAg、抗-HCV、HDAg、抗-HDV、抗-HEV均采用ELISA方法，HBV-DNA、HCV-RNA、HEV-RNA及HGV-RNA的检测分别采用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-巢式PCR方法。
1.3 TTV-DNA检测 引物位于TTV ORF1保守区，其序列为外正链5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAACAT-3′；外负链5′-CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT-3′；内正链5′-GGCAACATGTTATGGATAGACTGG-3′；内负链同外负链。
1.4 提取TTV-DNA 血清100 μL溶于300 μL变性溶液中[3]，充分混匀后，冰浴15 min，依次加入水饱和酚500 μL、氯仿与异戊醇混合液(24∶1)100 μL，混匀后静置5 min,12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液加入等量的异丙醇，-20℃过夜后12 000 r/min离心15 min，真空抽干，加入去核酸水38 μL，反复指弹使之溶解。
, 百拇医药
1.5 PCR反应 采用半巢式聚合酶链反应方法，在上述DNA提取管内加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对外引物及Taq DNA聚合酶，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第1次PCR循环，循环参数为94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，共35个循环，最后延伸5 min。于离心管中加入10×PCR缓冲液、4×10 mmol/L dNTP、一对内引物、Taq DNA聚合酶及第1次PCR产物，混匀，石蜡油封顶，预变性94℃ 3 min，进行第2次PCR循环，循环参数同第1次PCR。
1.6 产物检测 取第2次PCR产物10 μL进行20%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 g/L)电泳，紫外检测仪观察结果，于356 bp处出现特异性荧光条带为阳性，否则为阴性，检测过程中采用已知TTV-DNA阴性和阳性血清作为阴阳性对照。
2 结果
2.1 PCR产物电泳结果 阳性标本扩增产物356 bp与预期大小一致。
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2.2 TTV-DNA检测结果 20例非甲-非庚型肝炎患者血清中检出5例TTV-DNA阳性，阳性率为25%。
3 讨论
目前，TTV的诊断主要依据PCR检测，而不同肝炎病毒在患者血清中的滴度水平差别很大，TTV在血清中滴度只有103左右[2]，低于HBV和HCV，为提高敏感性必须进行二次PCR。由于PCR方法的局限性，应建立ELISA，以证实机体对TTV感染的免疫应答情况，从而可以更加全面地了解TTV的临床和流行病学特征，有利于阐述TTV与肝炎的关系。
采用半巢式PCR法对广州地区20例非甲-非庚型肝炎患者血清进行TTV-DNA检测，结果5例阳性(25%)，表明广州地区存在TTV感染，本组非甲-非庚型肝炎患者中TTV感染率较高，但比深圳地区的检出率(48%)[4]要低，可能由于不同区段引物的检出率有所差异。
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临床上5例TTV感染者都出现疲乏、纳差，2例出现腹胀，3例出现右上腹隐痛，2例触及肝脏，1例出现低热；其中2例表现为急性无黄疸性肝炎，症状较轻微；2例表现为急性黄疸性肝炎，症状较重，ALT 250 u/L以上，胆红素230 μmol/L以上；1例临床上表现为轻度慢性肝炎，表现TTV感染可单独引致肝炎，其临床症状有轻有重。多数报道TTV感染后，肝炎临床症状不十分明显或症状较轻。本文所研究对象多为有明显肝炎症状的住院患者，从而忽略了无症状或症状较轻微者，要最终证明TTV和肝炎的关系，仍需大量的基础和临床研究。
5例TTV感染者中，2例有术中输血史，2例经常在外面饮食，其中1例经常吃生海鲜，表明TTV可经多种途径传播。骆抗先等[5]对武汉某职校单项转氨酶升高的患者进行调查分析，在血清和粪便中均扩增出与TTV有高度同源性的片段。因此，TTV除经血制品传播外，可能还经肠道途径传播，故有必要将TTV的检测列为献血员及饮食从业人员筛查项目。
, 百拇医药 参考文献
1 Nishizaqa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase leves in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophy Res Commun, 1997, 241:92
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and charaterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1
3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by aciguanidinium thiocyanate-pgenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1987, 162:156
4 马为民，周伯平，王火生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167
5 骆抗先，章 廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病毒学的初步研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：161, 百拇医药