肿瘤复发、转移动物模型的建立及鲜动物药蛇毒制剂疗效的初步观察
作者：刘玉琴 李建生 赵雪梅 顾 蓓 薛克勋 高 进
单位：刘玉琴 赵雪梅 顾 蓓 薛克勋 高 进 中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院，北京 100005；李建生 北京鲜动物药研制中心，北京)
关键词：鲜动物药；蛇毒；小鼠子宫颈癌；转移；肿瘤复发
中国中医基础医学杂志991213 摘 要：目的：建立实验性手术切除原发瘤后局部肿瘤复发及转移模型，在建立模型基础上，将鲜动物药蛇毒制剂进行抑制肿瘤复发及转移的探索。方法：用小鼠子宫颈癌(U14)移植瘤，移植于小鼠爪垫皮下，在不同时间切除原发瘤，找到复发转移高最高的时间。在以上基础确定以第10d为切除合适时间；在移植肿瘤第10d切除原发瘤后，进行不同剂量蛇毒制剂治疗的探索。结果：原发瘤切除时间以8～12d为转移率最佳时间，故确定为第10d切除原发瘤为好，不同蛇毒剂量组实验证明，以高剂量组200mg/kg体重，中剂量组100mg/kg体重，抑制转移率相似，但中剂量组对肺转移抑制率最高。结论：建立了一个动物肿瘤复发转移的模型，为进一步研究肿瘤复发和转移的抑制打下了基础。
, 百拇医药
中图分类号：R282.74 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-03
金龙胶囊是鲜动物药，是在大量临床实践的基础上，研制成功的有扶正(增强免疫功能)祛邪(抑制肿瘤生长)的作用，降低化疗药物毒副反应的作用。实验研究表明，有一定抗转移作用[1]。蛇毒是金龙胶囊的主要成分之一，在实际工作中，往往是肿瘤患者在西医医院里经过了常规的手术、放疗，化疗后，仍有残留肿瘤细胞，并有复发可能的患者，才借助于中医药治疗。所以本文的目的，是建立模拟临床的肿瘤有复发可能的动物肿瘤模型，以此模型为对象，观察蛇毒制剂(以银环蛇、五步蛇等的蛇毒)对肿瘤复发转移抑制作用的探讨。
材料与方法
1 瘤源及动物
实验所用瘤株是小鼠子宫颈癌U14[2]，由本室自建的瘤株在液氮内保存备用，所有宿主动物为近交系615小鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所(二级实验动物——动字京第9202M19号)。
, http://www.100md.com
2 肿瘤复发转移动物模型的建立
以1×105个U14瘤细胞接种于615小鼠左侧后肢爪垫皮下，共接种小鼠15只，不同时间切除原发瘤，每次5只，切除后留动物存活继续观察至肿瘤移植后23d，全部处死，取局部淋巴结、肺及切除的原发瘤固定，石蜡包埋切片，HE染色，观察肿瘤转移复发的情况。确定原发瘤已切除，而又能引起复发转移的动物模型。
3 蛇毒干粉呈黄色结晶状，易潮解，每次临用时用生理盐水配成混悬液使用，为鲜动物药，由北京鲜动物药研制中心研制及提供。
4 蛇毒制剂急性毒性实验
选用昆明系小鼠，将蛇毒干粉以蒸馏水配制20mg/ml的悬液，用时摇匀。
4只小鼠按蛇毒100mg/kg体重剂量灌胃，连续用药3d，观察动物7～14d，另用3只小鼠以200mg/kg体重的剂量灌胃，连续给药3d观察同上。
, 百拇医药
5 蛇毒制剂对肿瘤复发转移的影响
利用前述实验所确定的动物模型，以小鼠子宫颈癌(U14)腹水瘤细胞5×105/只移植于615小鼠左侧爪垫皮下，共72只小鼠。肿瘤移植后10d，切除原发瘤，然后随机分为6组，进行实验。
Ⅰ组：高剂量蛇毒组：蛇毒用量200mg/kg体重。于截肢后每天灌胃1次，共13只小鼠。
Ⅱ组：中剂量蛇毒组：蛇毒用量100mg/kg体重。于截肢后每天灌胃1次，共13只小鼠。
Ⅲ组：化疗组：用环磷酰胺(CTX)做阳性对照，共10只小鼠。
CTX用量40mg/kg体重，截肢后开始给药，隔日腹腔内注射(ip)1次给药。
Ⅳ组：增效组：5mg/kg体重CTX，隔日ip用药与每日中剂量蛇毒同时用，共11只鼠。
, 百拇医药
Ⅴ组：低剂量化疗组：用CTX5mg/kg体重隔日ip用药，共7只小鼠。
Ⅵ组：对照组：用生理盐水(N.S)等体积灌胃，共9只小鼠。
所有动物于接种肿瘤后26d处死，取肺，双侧腹股沟和窝淋巴结Bouin液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，观察肿瘤复发转移情况。
6
本公式按瘤重抑制率计算公式制定[3]。
结果与讨论
1 蛇毒制剂急性毒性实验结果
4只小鼠给予蛇毒100mg/kg体重连续口服3d，观察7d～14d，小鼠未见任何不良反应。3只口服200mg/kg体重小鼠，观察7d～14d也均未见任何不良反应。表明该蛇毒在临床病人用量的100～200倍的情况下，未查见急性毒副作用。
, 百拇医药
2 肿瘤复发转移模型的建立
不同时间切除原发瘤，23d时各组动物复发转移情况(见表1)。
表1 原发瘤切除时间与肿瘤复发转移的关系 切除时间(d)
淋巴结转移(%)
肺转移
5
20%(1/5)
20%(1/5)
8
25(%)(1/4)*
75%(3/4)
, 百拇医药
12
20%(1/5)
40%(2/5)
注：*本组5只小鼠中途死亡1只，到23d时只有4只。 由表1可见，局部淋巴结转移较稳定(维持在20～25%)，未见随原发瘤带瘤时间延长而增加。而肺转移随原发瘤带瘤时间延长至8d时，转移可达75%，而12d时又有所下降。根据以上结果，我们认为8d～10d切除原发瘤，可获得较高复发转移率，适于肿瘤复发转移防治的研究。至于为什么12d切除原发瘤，复发转移率会有所下降，可能与宿主在此阶段体内免疫力较强，对残存肿瘤细胞杀伤作用较强有关，其机理有待进一步研究。
3 蛇毒对肿瘤复发转移的影响
全部小鼠10d时切除原发瘤，按以上材料方法中介绍分组实验，于接种瘤细胞后26d时即手术后16d全部处死。由于本模型为双向转移模型[3]，故将淋巴结和肺转移情况分别计算，其结果见表2。
, 百拇医药
从表2可见，10d切除原发瘤，对照组88.9%的动物可因残存在体内的肿瘤细胞复发而形成肺及淋巴结转移。环磷酰胺治疗可杀死大多数的残存肿瘤细胞，大大降低肿瘤在体内的复发转移率仅为20%，抑制转移率为77.6%。低剂量化疗组也明显降低了残存瘤细胞的总转移率为42.8%总抑制转移率为51.9%。高剂量蛇毒制剂治疗可以降低残存肿瘤细胞的在体内复发转移率(转移抑制率可达30.9%)。中剂量蛇毒治疗抑制肺转移率更高，可达65.5%，但总转移率与高剂量组相同。低剂量化疗与中剂量蛇毒联合应用，肺转移复发率为45.5%，抑制肺转移率为49%，但总转移抑制率为28.5，不如分别应用疗效好。但两者联合应用对肺的复发转移抑制作用与单独使用疗效相似，抑制转移率为49%。中、高剂量蛇毒制剂对淋巴结的复发转移也有抑制作用，但不如化疗组效果好。本实验结果显示，建立了一个可用的肿瘤复发模型，利用该模型探索了蛇毒制剂对实验性手术切除原发瘤后，对转移的抑制作用，有明显的效果，对今后鲜动物药的抑制肿瘤复发及转移提供了有用的基础资料。
表2 各组肺及淋巴结转移分布表 分 组
, 百拇医药
动物数
淋巴结转移
%
抑制转移率
%
肺转移
%
抑制转移率
%
总转移率
抑制转移率
%
对照组
, 百拇医药
9
88.9(8/9)
88.9(8/9)
88.9(8/9)
化疗组
10
20 (2/10)
77.6
10 (1/10)
88.8
20 (2/10)
77.6
, http://www.100md.com 高剂量蛇毒组
13
61.5(8/13)
30.9
53.8(7/13)
39.5
61.5(8/13)
30.9
中剂量蛇毒组
13
61.5(8/13)
30.9
30.7(4/13)
, 百拇医药
65.5
61.5(8/13)
30.9
增效组
11
63.6(7/11)
28.5
45.4(5/11)
49
63.6(7/11)
28.5
低剂量化疗组
, 百拇医药 7
42.8(3/7)
51.9
28.5(2/7)
68
42.8(3/7)
51.9
参考文献
[1] 薛克勋，高进，李建生，等.“扶Ⅱ号”抑制癌细胞转移的研究.中国实验方剂学杂志，1996，2(2)：37-40.
[2] 潘启超，胥彬主编.肿瘤药理学及化学治疗.广东：广东高等教育出版社，1989，432-437.
[3] 薛克勋，高岩，高进.小鼠子宫颈癌U14移植到近交系小鼠后生长特征和转移规律的研究.中华病理学杂志，1987，16(4)：140-143.
(收稿日期 1999—07—01 修回日期 1999—08—17)
, 百拇医药
单位：刘玉琴 赵雪梅 顾 蓓 薛克勋 高 进 中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院，北京 100005；李建生 北京鲜动物药研制中心，北京)
关键词：鲜动物药；蛇毒；小鼠子宫颈癌；转移；肿瘤复发
中国中医基础医学杂志991213 摘 要：目的：建立实验性手术切除原发瘤后局部肿瘤复发及转移模型，在建立模型基础上，将鲜动物药蛇毒制剂进行抑制肿瘤复发及转移的探索。方法：用小鼠子宫颈癌(U14)移植瘤，移植于小鼠爪垫皮下，在不同时间切除原发瘤，找到复发转移高最高的时间。在以上基础确定以第10d为切除合适时间；在移植肿瘤第10d切除原发瘤后，进行不同剂量蛇毒制剂治疗的探索。结果：原发瘤切除时间以8～12d为转移率最佳时间，故确定为第10d切除原发瘤为好，不同蛇毒剂量组实验证明，以高剂量组200mg/kg体重，中剂量组100mg/kg体重，抑制转移率相似，但中剂量组对肺转移抑制率最高。结论：建立了一个动物肿瘤复发转移的模型，为进一步研究肿瘤复发和转移的抑制打下了基础。
, 百拇医药
中图分类号：R282.74 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-03
金龙胶囊是鲜动物药，是在大量临床实践的基础上，研制成功的有扶正(增强免疫功能)祛邪(抑制肿瘤生长)的作用，降低化疗药物毒副反应的作用。实验研究表明，有一定抗转移作用[1]。蛇毒是金龙胶囊的主要成分之一，在实际工作中，往往是肿瘤患者在西医医院里经过了常规的手术、放疗，化疗后，仍有残留肿瘤细胞，并有复发可能的患者，才借助于中医药治疗。所以本文的目的，是建立模拟临床的肿瘤有复发可能的动物肿瘤模型，以此模型为对象，观察蛇毒制剂(以银环蛇、五步蛇等的蛇毒)对肿瘤复发转移抑制作用的探讨。
材料与方法
1 瘤源及动物
实验所用瘤株是小鼠子宫颈癌U14[2]，由本室自建的瘤株在液氮内保存备用，所有宿主动物为近交系615小鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所(二级实验动物——动字京第9202M19号)。
, http://www.100md.com
2 肿瘤复发转移动物模型的建立
以1×105个U14瘤细胞接种于615小鼠左侧后肢爪垫皮下，共接种小鼠15只，不同时间切除原发瘤，每次5只，切除后留动物存活继续观察至肿瘤移植后23d，全部处死，取局部淋巴结、肺及切除的原发瘤固定，石蜡包埋切片，HE染色，观察肿瘤转移复发的情况。确定原发瘤已切除，而又能引起复发转移的动物模型。
3 蛇毒干粉呈黄色结晶状，易潮解，每次临用时用生理盐水配成混悬液使用，为鲜动物药，由北京鲜动物药研制中心研制及提供。
4 蛇毒制剂急性毒性实验
选用昆明系小鼠，将蛇毒干粉以蒸馏水配制20mg/ml的悬液，用时摇匀。
4只小鼠按蛇毒100mg/kg体重剂量灌胃，连续用药3d，观察动物7～14d，另用3只小鼠以200mg/kg体重的剂量灌胃，连续给药3d观察同上。
, 百拇医药
5 蛇毒制剂对肿瘤复发转移的影响
利用前述实验所确定的动物模型，以小鼠子宫颈癌(U14)腹水瘤细胞5×105/只移植于615小鼠左侧爪垫皮下，共72只小鼠。肿瘤移植后10d，切除原发瘤，然后随机分为6组，进行实验。
Ⅰ组：高剂量蛇毒组：蛇毒用量200mg/kg体重。于截肢后每天灌胃1次，共13只小鼠。
Ⅱ组：中剂量蛇毒组：蛇毒用量100mg/kg体重。于截肢后每天灌胃1次，共13只小鼠。
Ⅲ组：化疗组：用环磷酰胺(CTX)做阳性对照，共10只小鼠。
CTX用量40mg/kg体重，截肢后开始给药，隔日腹腔内注射(ip)1次给药。
Ⅳ组：增效组：5mg/kg体重CTX，隔日ip用药与每日中剂量蛇毒同时用，共11只鼠。
, 百拇医药
Ⅴ组：低剂量化疗组：用CTX5mg/kg体重隔日ip用药，共7只小鼠。
Ⅵ组：对照组：用生理盐水(N.S)等体积灌胃，共9只小鼠。
所有动物于接种肿瘤后26d处死，取肺，双侧腹股沟和窝淋巴结Bouin液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，观察肿瘤复发转移情况。
6
本公式按瘤重抑制率计算公式制定[3]。
结果与讨论
1 蛇毒制剂急性毒性实验结果
4只小鼠给予蛇毒100mg/kg体重连续口服3d，观察7d～14d，小鼠未见任何不良反应。3只口服200mg/kg体重小鼠，观察7d～14d也均未见任何不良反应。表明该蛇毒在临床病人用量的100～200倍的情况下，未查见急性毒副作用。
, 百拇医药
2 肿瘤复发转移模型的建立
不同时间切除原发瘤，23d时各组动物复发转移情况(见表1)。
表1 原发瘤切除时间与肿瘤复发转移的关系 切除时间(d)
淋巴结转移(%)
肺转移
5
20%(1/5)
20%(1/5)
8
25(%)(1/4)*
75%(3/4)
, 百拇医药
12
20%(1/5)
40%(2/5)
注：*本组5只小鼠中途死亡1只，到23d时只有4只。 由表1可见，局部淋巴结转移较稳定(维持在20～25%)，未见随原发瘤带瘤时间延长而增加。而肺转移随原发瘤带瘤时间延长至8d时，转移可达75%，而12d时又有所下降。根据以上结果，我们认为8d～10d切除原发瘤，可获得较高复发转移率，适于肿瘤复发转移防治的研究。至于为什么12d切除原发瘤，复发转移率会有所下降，可能与宿主在此阶段体内免疫力较强，对残存肿瘤细胞杀伤作用较强有关，其机理有待进一步研究。
3 蛇毒对肿瘤复发转移的影响
全部小鼠10d时切除原发瘤，按以上材料方法中介绍分组实验，于接种瘤细胞后26d时即手术后16d全部处死。由于本模型为双向转移模型[3]，故将淋巴结和肺转移情况分别计算，其结果见表2。
, 百拇医药
从表2可见，10d切除原发瘤，对照组88.9%的动物可因残存在体内的肿瘤细胞复发而形成肺及淋巴结转移。环磷酰胺治疗可杀死大多数的残存肿瘤细胞，大大降低肿瘤在体内的复发转移率仅为20%，抑制转移率为77.6%。低剂量化疗组也明显降低了残存瘤细胞的总转移率为42.8%总抑制转移率为51.9%。高剂量蛇毒制剂治疗可以降低残存肿瘤细胞的在体内复发转移率(转移抑制率可达30.9%)。中剂量蛇毒治疗抑制肺转移率更高，可达65.5%，但总转移率与高剂量组相同。低剂量化疗与中剂量蛇毒联合应用，肺转移复发率为45.5%，抑制肺转移率为49%，但总转移抑制率为28.5，不如分别应用疗效好。但两者联合应用对肺的复发转移抑制作用与单独使用疗效相似，抑制转移率为49%。中、高剂量蛇毒制剂对淋巴结的复发转移也有抑制作用，但不如化疗组效果好。本实验结果显示，建立了一个可用的肿瘤复发模型，利用该模型探索了蛇毒制剂对实验性手术切除原发瘤后，对转移的抑制作用，有明显的效果，对今后鲜动物药的抑制肿瘤复发及转移提供了有用的基础资料。
表2 各组肺及淋巴结转移分布表 分 组
, 百拇医药
动物数
淋巴结转移
%
抑制转移率
%
肺转移
%
抑制转移率
%
总转移率
抑制转移率
%
对照组
, 百拇医药
9
88.9(8/9)
88.9(8/9)
88.9(8/9)
化疗组
10
20 (2/10)
77.6
10 (1/10)
88.8
20 (2/10)
77.6
, http://www.100md.com 高剂量蛇毒组
13
61.5(8/13)
30.9
53.8(7/13)
39.5
61.5(8/13)
30.9
中剂量蛇毒组
13
61.5(8/13)
30.9
30.7(4/13)
, 百拇医药
65.5
61.5(8/13)
30.9
增效组
11
63.6(7/11)
28.5
45.4(5/11)
49
63.6(7/11)
28.5
低剂量化疗组
, 百拇医药 7
42.8(3/7)
51.9
28.5(2/7)
68
42.8(3/7)
51.9
参考文献
[1] 薛克勋，高进，李建生，等.“扶Ⅱ号”抑制癌细胞转移的研究.中国实验方剂学杂志，1996，2(2)：37-40.
[2] 潘启超，胥彬主编.肿瘤药理学及化学治疗.广东：广东高等教育出版社，1989，432-437.
[3] 薛克勋，高岩，高进.小鼠子宫颈癌U14移植到近交系小鼠后生长特征和转移规律的研究.中华病理学杂志，1987，16(4)：140-143.
(收稿日期 1999—07—01 修回日期 1999—08—17)
, 百拇医药