宣发膜原法对关节炎大鼠和小鼠免疫功能的影响
作者：吕爱平，徐世杰，吴 萍，李 艳，滕静如，王少君
单位：中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700
关键词：宣发膜原；关节炎；体液免疫
中国中医基础医学杂志991210 摘 要：目的：探讨宣发膜原法对关节炎动物免疫功能的影响；方法：以Ⅱ型胶原免疫所致关节炎(CIA)作为动物模型，观察宣发膜原法对关节炎大体发病情况的影响，以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体、IgM型类风湿因子、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)的变化。结果：宣发膜原法能显著降低CIA的发病率，并能推迟其发病时间，使抗Ⅱ型胶原抗体IgG及其亚型下降，显著降低关节炎动物IFN-r水平而使IL-10的产生增加，尚可提高关节炎小鼠血清IgM型类风湿因子水平。结论：宣发膜原法主要抑制机体对Ⅱ型胶原的体液免疫反应，同时具有免疫调节作用。
, 百拇医药 中图分类号：242 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-04
类风湿性关节炎属中医痹证范畴。痹证的发病学理论人们普遍遵循《素问.痹论》所提出的：“风寒湿三气杂致合而为痹”，杂致是先后不一而致，即时间上侵入有先后之别。因而痹证发病当有伏邪存在。痹证的病位，正如《灵枢.周痹》而言：“……不在脏，而外未发于皮”，不在内，不在表，即在半表半里之间，当属于膜原。因此，我们认为邪伏膜原是痹证的病机之一。据于上述病机，我们以Ⅱ型胶原免疫所致的具有人类风湿性关节炎(RA)诸多特征的关节炎作为动物模型，探讨宣发膜原法对关节炎大鼠的免疫功能影响。
材料与方法
1 动物
4周龄雄性DBA小鼠和6周龄DA大鼠，分别来自中国医学科学院动物中心和瑞典隆德大学。
, 百拇医药
2 Ⅱ型胶原
根据文献，从大鼠软骨肉瘤组织中获得[1]。
3 免疫方法
提适量Ⅱ型胶原，溶于0.1M乙酸中，与等量的不全完弗氏佐剂(DIFCO产品)不充分乳化，按100μgⅡ型胶原/只小鼠(150μgⅡ型胶原/只大鼠)，于尾根部皮下注射。
4 药物组成及给药方法
药用常山、槟榔、青蒿、草果、黄芪、赤芍、防风、知母、甘草，采用水煎醇沉法，制成干粉后备用。同时用蒸馏水稀释至合适浓度，过滤后，小鼠于免疫当天腹腔注射0.5ml(含2克生药/ml)药液。对照组动物则于免疫当天腹腔注射给予等量蒸馏水。大鼠灌胃给药1ml(含1克生药/ml)。给药Ⅰ组(OI)动物于免疫后当天、第3d、第7d给予上述药液，免疫后第9d、第11d给予等量蒸馏水。给药Ⅱ组(OⅡ)动物于免疫后第7d、第9d、第11d给予上述药液，免疫后当天和第3d给予等量蒸馏水，对照组动物则于免疫后当天、第3d、第7d、第11d、第13d给予等量蒸馏水。
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5 检测指标
5.1 关节炎指数
按以下标准对动物关节炎程度记分：红肿涉及一个指关节计1分，肿胀涉及两个指关节计2分，红肿涉及三个或三个以上指关节或是整个关节计3分。每只动物四肢合计最高分为12分。免疫后第10d起开始记分，每两天记录一次。
5.2 抗Ⅱ型胶原抗体测定
ELISA法。生物素标记的第二抗体抗小鼠IgG、IgM为Jackson产品，抗IgC1、IgC2a、IgC2b为Southbinding产品。所测样品为动物免疫后第18d、第32d及第42d的血清。所测样品均双孔重复对比，三个梯度稀释以确保结果准确。抗Ⅱ型胶原抗本IgM按最高OD值一半时稀释倍数的对数值(滴度)来计算。其他抗体用相同型(实验室自制)单克隆抗体作为标准品计算含量。
, 百拇医药 5.3 IgM型类风湿因子的测定
ELISA法，即用单克隆抗Ⅱ型胶原抗体包被酶标板，按前述加样后用生物素标抗小鼠IgM作为第二抗体进行检测。
5.4 γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)的测定(ELISA法)
免疫30d后，取腋下、颈部淋巴结，制成单细胞悬液，在24孔板上按10万/孔细胞与失活型胶原(10ug/ml)培养，4d后收集每个动物培养淋巴细胞上清液，待测。用抗IFN-γ抗体(单克隆，Jackson产品)，包被ELISA板用于测定IFN-γ，用抗IL-10抗体(Southbinding产品)包被ELISA板用于测定IL-10。第二抗体分别用生物素标抗小鼠IFN-γ抗体(Jackson产品)和生物素标抗小鼠IL-10IgM(自制)。测定时均用二孔三梯度稀释法，并重复双孔误差不得超过10%，以保证数据可靠。
, 百拇医药
6 统计学检验
StudentT法和卡方检验。
结果
1 对关节炎发病率的影响(见表1、2)
表1 对大鼠关节炎发病率的影响 组 别
动物数
第16d发病率
第30d发病率
对照组
10
80.00%
100.00%
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OⅠ
12
72.70%
36.40%*
OⅡ
9
67.00%
11.00%*
注：*与对照组比较：P<0.01。
表1结果提示，免疫后16d，给药组只是轻度降低关节炎发病率，但随着疾病的发展，至免疫后30d，对照组动物按其本身规律，发病率达100%，而给药组的发病率降低明显，并明显低于免疫后16d的发病率，可以认为是部分动物关节炎在后阶段消失或被治愈的结果。
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表2 小鼠关节炎发病率和关节炎指数的影响(M±s) 组 别
例数
起病时间
发病率
发病关节炎指数*
对照组
10
30±5.8
40%
4.5±1.2
药物组
20
, http://www.100md.com
39±2.1#
25%#
1.0±0.5#
注：*指免疫后45d关节炎指数;#与对照组比较：P<0.01。
2 对发病关节炎程度(关节炎指数)的影响(见表3)
表3 对大鼠关节炎指数的影响#(M±s) 组 别
免疫后第16d
免疫后第30d
对照组
3.70±1.00
, http://www.100md.com
5.60±1.90
OⅠ
4.80±1.30
6.25±2.10
OⅡ
2.50±1.70
4.00±2.20
注：#只计算发病大鼠关节炎指数。
从表3可以看出，动物一旦发病，关节炎严重程度类似，各给药组与对照组比较，未见明显差异。
3 对Ⅱ型胶原免疫动物型胶原抗体的影响(见表4、5、6)
从表4可以看出，给药组动物抗Ⅱ型胶原IgG含量均有不同程度的降低，其IgG亚型IgG1、IgG2a、IgG2b也有不同程度的降低，仔细分析代表Th1/Th2反应的抗体，即IgG2a+2b/IgG1比值，发现给药组动物该比值明显降低，提示给药组动物有从Th1为主的反应转为Th2反应为主的趋势。
, 百拇医药
从表5可以看出，给药组抗Ⅱ型胶原抗体IgG和IgG2a显著下降，提示宣发膜原法具有免疫抑制作用，但仔细分析代表Th/Th2型免疫反应的IgG2a+2b/IgG1比值来看，对照组为2.56±0.29，而给药组为1.09±0.22，两组比较，差别有显著意义(P<0.01)，提示宣发膜原法在免疫抑制的同时，具有免疫调节作用，即能使关节炎动物以Th1型为主的免疫反应转为Th2型免疫反应，从而达到阻止Ⅱ型胶原免疫对关节的破坏作用。
表4 对Ⅱ型胶原免疫大鼠抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
, http://www.100md.com
IgG2a+2b/IgG1
对照组
10
134.3±96.6
33.9±12.2
79.3±55.6
15.5±11.0
2.8±2.71
OⅠ
12
17.35±23.2*
22.3±44.3
, 百拇医药
30.8±43.1*
3.16±3.7*
1.5±1.72
OⅡ
9
13.98±11.2*
11.14± 9.4*
17.6± 7.51*
2.29± 2.9*
1.8±1.23
, 百拇医药
注：*与对照组比较：P<0.01。表5 对免疫小鼠21d后血清抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgM
对照组
10
441±239.2
40.6±11.8
76.2±19.8
, 百拇医药
31.6±17.6
0.45±0.014
给药组
20
191±11.65*
40.9±8.55
19.3±11.2*
21.5±10.7
0.45±0.253
注：*与对照组比较：P<0.01。表6 对免疫小鼠46d后血清抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
, http://www.100md.com 例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgM
对照组
10
604±320.9
100.6±54.3
51.6±40.9
25.7±14.4
0.694±0.108
, 百拇医药
给药组
20
372±209.1*
47.52±31.6
22.6±15.3
12.79±4.3
0.601±0.413
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表6可以看出，给药组抗Ⅱ型胶原抗体水平下降，提示宣发膜原法具有免疫抑制作用。
4 对免疫小鼠46d后血清IgM型类风湿因子的影响(见表7)
, 百拇医药
表7 对免疫小鼠46d后血清IgM型类风湿因子的影响(M±s) 组 别
例数
IgM
对照组
10
0.546±0.1374
给药组
20
1.423±0.2012*
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表7可以看出，给药组动物血清IgM型类风湿因子滴度远高于对照组。
, 百拇医药
5 对免疫小鼠21d后淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-10的影响(见表8)
表8 对免疫小鼠21d后淋巴细胞分泌INF-γ和IL-10的影响(M±s) 组 别
例数
TFN-γ
IL-10
对照组
10
0.609±0.182
0.234±0.201
给药组
20
, 百拇医药
0.079±0.012*
0.478±0.279*
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表8可以看出，给药组动物淋巴结细胞产生IFN-γ能力明显下降，而产生IL-10的能力显著上升。
讨论
类风湿性关节炎属中医痹证范畴。痹证的发病学理论人们普遍遵循《素问.痹论》的提法，“风寒湿三气杂致，合而为痹”。其中的杂致，鲜有人详究，相实杂表，不一也，杂致即先后不一而致。也就是说，风寒湿之邪，在时间上侵人有先后之别，而三者相合才能致使人体发生痹证。因此先期所致者伏而不发，符合中医学关于感而即发者为新感，感为不即发为伏邪的发病学理论。而《灵枢.贼风》为所论，恰好作为最好的注脚。其曰“此皆尚有所伤于湿气，藏于血脉之中，分肉之间，久留而不去。……其开而遇风寒，则血气凝结，与故邪相袭，则为寒痹。”其中之湿气，被称为故邪，即后世之伏邪。
, 百拇医药
邪伏之所，就此言我们认为当属膜原。膜原之说始于《内经》，发扬于明吴又可，后代有阐发。我们认为，人体中的膜样组织大都可归入中医膜原的概念之下。而膜原在中医学中属半表半里之位，而痹症的病位，如《灵枢.周痹》言“此内不在脏，而外未发于表”，不在内，不在表，则在半表半里之间。而结合现代医学RA病发，首先侵犯滑膜，而滑膜称为人体中的膜样组织相当膜原的范畴。因此，我们确定伏邪发于膜原为中医学有关RA的发病学理论，选用黄芪赤风汤合达原饮。
痹证范围很广，我们以目前较常用的Ⅱ型胶原免疫所致大鼠关节炎作为动物模型，同其具有与人RA有相似的遗传性特征，和相似的病理变化[2]，选用了易感DBA小鼠制作动物模型，观察了宣发膜原法对关节炎小鼠的影响。结果表明，宣发膜原法能推迟关节炎的发病时间。降低Ⅱ型胶原所致关节炎的发病率。
从抗Ⅱ型胶原抗体来看，宣发膜原法主要抑制机体对Ⅱ型胶原的体液免疫反应，使抗Ⅱ型胶原抗体IgG及其亚型下降。由于IgG2a和IgG2b均属于Th1型反应的抗体亚型，而IgG1则属于Th2型反应的抗体亚型，而类风湿关节炎属于Th1型免疫反应，因此IgG2a+2b/IgG1能一定程度上反映Th1和Th2型反应水平。我们的结果表明，宣发膜原法能使伏表Th1/Th2型反应的IgG亚型IgG2a+IgG2b/IgG1比较下降，一定程度上说明宣发膜原法同时具有免疫调节作用，即将该关节炎以Th1型反应为主的T细胞反应转为Th2为主的免疫反应，从而有效地控制Ⅱ型胶原免疫对关节的破坏作用。
, 百拇医药
为了探讨宣发膜原法作用的可能环节，我们观察了其对关炎小鼠淋巴细胞IFN-γ、IL-10的影响。已经知道，IFN-γ是Th1反应的代表性细胞因子，直接参与关节软骨等组织的损伤[3]，而IL-10是Th2反应的一种细胞因子，能缓解关节炎病情，早期给予IL-10能降低Ⅱ型胶原所致关节炎发病率[4]。我们的结果表明，宣发膜原发能显著降低关节炎小鼠IFN-γ水平，但使IL-10的产生增加。
类风湿因子是一种对自身IgGFc段产生的抗体，其意义本身多是说明具有自身免疫的存在，其在发病中的作用一直是不十分清楚[5]。有人认为，类风湿因子能与抗体形成免疫复合物，沉积局部，激活补体系统，破坏组织。也有人认为，类风湿因子或许能中和自身抗体，起到阻止自身免疫作用。应该看到，自身IgG分子能产生许多克隆的抗自身IgG抗体，因而有一大类风湿因子产生。可以认为，他们肯定会有不同的作用。我们的结果表明，宣发膜原发能提高关节炎大鼠血清IgM型类风湿因子水平。由于我们所指的是抗自身抗Ⅱ型胶原抗体IgG的IgM型类风湿因子，受到诸如抗Ⅱ型胶原抗体IgG的特性、IgM的特异性结合点是该IgG的Fc段还是Fab段的许多因素影响，因而其作用机理有待进于一步阐明。
, 百拇医药
作者简介：吕爱平(1963-)，男，中国中医研究院基础理论研究所研究员，博士生导师，从事于中医痹证基础及应用基础研究。
参考文献
[1] Holmdahl,R et al.Immunogenetics of type Ⅱ collagen autoimmunity and susceptibility to collagen arthritis.Immunology,1988,65:305.
[2] Trentham,DE.Collagen arthritis as a relevant model for rheumatoid arthrit is.Evidence pro and con.Arthritis Rheum,1982,25;911.
[3] Weiner HL et al.Oral tolerance:immunologic mechanisms and treatment of an imal and human organ-specific autoimmune diseases by oral administration of autoant igens.Annu Rev immunol,1994,12:809.
, 百拇医药
[4] Kasama T et al.Interleukin 10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type Ⅱ collagen induced arthritis.J Clin Invest,1995,95 :2868.
[5] Vaughan,JH.Pathgenetic concepts and origins of rheumatoid factor in rhe umatoid arthritis.Arthritis Rheum,1993,36:1-6.
(收稿日期 1999—06—12 修回日期 1999—08—12), 百拇医药
单位：中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700
关键词：宣发膜原；关节炎；体液免疫
中国中医基础医学杂志991210 摘 要：目的：探讨宣发膜原法对关节炎动物免疫功能的影响；方法：以Ⅱ型胶原免疫所致关节炎(CIA)作为动物模型，观察宣发膜原法对关节炎大体发病情况的影响，以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体、IgM型类风湿因子、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)的变化。结果：宣发膜原法能显著降低CIA的发病率，并能推迟其发病时间，使抗Ⅱ型胶原抗体IgG及其亚型下降，显著降低关节炎动物IFN-r水平而使IL-10的产生增加，尚可提高关节炎小鼠血清IgM型类风湿因子水平。结论：宣发膜原法主要抑制机体对Ⅱ型胶原的体液免疫反应，同时具有免疫调节作用。
, 百拇医药 中图分类号：242 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-04
类风湿性关节炎属中医痹证范畴。痹证的发病学理论人们普遍遵循《素问.痹论》所提出的：“风寒湿三气杂致合而为痹”，杂致是先后不一而致，即时间上侵入有先后之别。因而痹证发病当有伏邪存在。痹证的病位，正如《灵枢.周痹》而言：“……不在脏，而外未发于皮”，不在内，不在表，即在半表半里之间，当属于膜原。因此，我们认为邪伏膜原是痹证的病机之一。据于上述病机，我们以Ⅱ型胶原免疫所致的具有人类风湿性关节炎(RA)诸多特征的关节炎作为动物模型，探讨宣发膜原法对关节炎大鼠的免疫功能影响。
材料与方法
1 动物
4周龄雄性DBA小鼠和6周龄DA大鼠，分别来自中国医学科学院动物中心和瑞典隆德大学。
, 百拇医药
2 Ⅱ型胶原
根据文献，从大鼠软骨肉瘤组织中获得[1]。
3 免疫方法
提适量Ⅱ型胶原，溶于0.1M乙酸中，与等量的不全完弗氏佐剂(DIFCO产品)不充分乳化，按100μgⅡ型胶原/只小鼠(150μgⅡ型胶原/只大鼠)，于尾根部皮下注射。
4 药物组成及给药方法
药用常山、槟榔、青蒿、草果、黄芪、赤芍、防风、知母、甘草，采用水煎醇沉法，制成干粉后备用。同时用蒸馏水稀释至合适浓度，过滤后，小鼠于免疫当天腹腔注射0.5ml(含2克生药/ml)药液。对照组动物则于免疫当天腹腔注射给予等量蒸馏水。大鼠灌胃给药1ml(含1克生药/ml)。给药Ⅰ组(OI)动物于免疫后当天、第3d、第7d给予上述药液，免疫后第9d、第11d给予等量蒸馏水。给药Ⅱ组(OⅡ)动物于免疫后第7d、第9d、第11d给予上述药液，免疫后当天和第3d给予等量蒸馏水，对照组动物则于免疫后当天、第3d、第7d、第11d、第13d给予等量蒸馏水。
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5 检测指标
5.1 关节炎指数
按以下标准对动物关节炎程度记分：红肿涉及一个指关节计1分，肿胀涉及两个指关节计2分，红肿涉及三个或三个以上指关节或是整个关节计3分。每只动物四肢合计最高分为12分。免疫后第10d起开始记分，每两天记录一次。
5.2 抗Ⅱ型胶原抗体测定
ELISA法。生物素标记的第二抗体抗小鼠IgG、IgM为Jackson产品，抗IgC1、IgC2a、IgC2b为Southbinding产品。所测样品为动物免疫后第18d、第32d及第42d的血清。所测样品均双孔重复对比，三个梯度稀释以确保结果准确。抗Ⅱ型胶原抗本IgM按最高OD值一半时稀释倍数的对数值(滴度)来计算。其他抗体用相同型(实验室自制)单克隆抗体作为标准品计算含量。
, 百拇医药 5.3 IgM型类风湿因子的测定
ELISA法，即用单克隆抗Ⅱ型胶原抗体包被酶标板，按前述加样后用生物素标抗小鼠IgM作为第二抗体进行检测。
5.4 γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)的测定(ELISA法)
免疫30d后，取腋下、颈部淋巴结，制成单细胞悬液，在24孔板上按10万/孔细胞与失活型胶原(10ug/ml)培养，4d后收集每个动物培养淋巴细胞上清液，待测。用抗IFN-γ抗体(单克隆，Jackson产品)，包被ELISA板用于测定IFN-γ，用抗IL-10抗体(Southbinding产品)包被ELISA板用于测定IL-10。第二抗体分别用生物素标抗小鼠IFN-γ抗体(Jackson产品)和生物素标抗小鼠IL-10IgM(自制)。测定时均用二孔三梯度稀释法，并重复双孔误差不得超过10%，以保证数据可靠。
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6 统计学检验
StudentT法和卡方检验。
结果
1 对关节炎发病率的影响(见表1、2)
表1 对大鼠关节炎发病率的影响 组 别
动物数
第16d发病率
第30d发病率
对照组
10
80.00%
100.00%
, http://www.100md.com
OⅠ
12
72.70%
36.40%*
OⅡ
9
67.00%
11.00%*
注：*与对照组比较：P<0.01。
表1结果提示，免疫后16d，给药组只是轻度降低关节炎发病率，但随着疾病的发展，至免疫后30d，对照组动物按其本身规律，发病率达100%，而给药组的发病率降低明显，并明显低于免疫后16d的发病率，可以认为是部分动物关节炎在后阶段消失或被治愈的结果。
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表2 小鼠关节炎发病率和关节炎指数的影响(M±s) 组 别
例数
起病时间
发病率
发病关节炎指数*
对照组
10
30±5.8
40%
4.5±1.2
药物组
20
, http://www.100md.com
39±2.1#
25%#
1.0±0.5#
注：*指免疫后45d关节炎指数;#与对照组比较：P<0.01。
2 对发病关节炎程度(关节炎指数)的影响(见表3)
表3 对大鼠关节炎指数的影响#(M±s) 组 别
免疫后第16d
免疫后第30d
对照组
3.70±1.00
, http://www.100md.com
5.60±1.90
OⅠ
4.80±1.30
6.25±2.10
OⅡ
2.50±1.70
4.00±2.20
注：#只计算发病大鼠关节炎指数。
从表3可以看出，动物一旦发病，关节炎严重程度类似，各给药组与对照组比较，未见明显差异。
3 对Ⅱ型胶原免疫动物型胶原抗体的影响(见表4、5、6)
从表4可以看出，给药组动物抗Ⅱ型胶原IgG含量均有不同程度的降低，其IgG亚型IgG1、IgG2a、IgG2b也有不同程度的降低，仔细分析代表Th1/Th2反应的抗体，即IgG2a+2b/IgG1比值，发现给药组动物该比值明显降低，提示给药组动物有从Th1为主的反应转为Th2反应为主的趋势。
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从表5可以看出，给药组抗Ⅱ型胶原抗体IgG和IgG2a显著下降，提示宣发膜原法具有免疫抑制作用，但仔细分析代表Th/Th2型免疫反应的IgG2a+2b/IgG1比值来看，对照组为2.56±0.29，而给药组为1.09±0.22，两组比较，差别有显著意义(P<0.01)，提示宣发膜原法在免疫抑制的同时，具有免疫调节作用，即能使关节炎动物以Th1型为主的免疫反应转为Th2型免疫反应，从而达到阻止Ⅱ型胶原免疫对关节的破坏作用。
表4 对Ⅱ型胶原免疫大鼠抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
, http://www.100md.com
IgG2a+2b/IgG1
对照组
10
134.3±96.6
33.9±12.2
79.3±55.6
15.5±11.0
2.8±2.71
OⅠ
12
17.35±23.2*
22.3±44.3
, 百拇医药
30.8±43.1*
3.16±3.7*
1.5±1.72
OⅡ
9
13.98±11.2*
11.14± 9.4*
17.6± 7.51*
2.29± 2.9*
1.8±1.23
, 百拇医药
注：*与对照组比较：P<0.01。表5 对免疫小鼠21d后血清抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgM
对照组
10
441±239.2
40.6±11.8
76.2±19.8
, 百拇医药
31.6±17.6
0.45±0.014
给药组
20
191±11.65*
40.9±8.55
19.3±11.2*
21.5±10.7
0.45±0.253
注：*与对照组比较：P<0.01。表6 对免疫小鼠46d后血清抗Ⅱ型胶原抗体的影响(M±s) 组 别
, http://www.100md.com 例数
IgG
IgG1
IgG2a
IgG2b
IgM
对照组
10
604±320.9
100.6±54.3
51.6±40.9
25.7±14.4
0.694±0.108
, 百拇医药
给药组
20
372±209.1*
47.52±31.6
22.6±15.3
12.79±4.3
0.601±0.413
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表6可以看出，给药组抗Ⅱ型胶原抗体水平下降，提示宣发膜原法具有免疫抑制作用。
4 对免疫小鼠46d后血清IgM型类风湿因子的影响(见表7)
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表7 对免疫小鼠46d后血清IgM型类风湿因子的影响(M±s) 组 别
例数
IgM
对照组
10
0.546±0.1374
给药组
20
1.423±0.2012*
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表7可以看出，给药组动物血清IgM型类风湿因子滴度远高于对照组。
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5 对免疫小鼠21d后淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-10的影响(见表8)
表8 对免疫小鼠21d后淋巴细胞分泌INF-γ和IL-10的影响(M±s) 组 别
例数
TFN-γ
IL-10
对照组
10
0.609±0.182
0.234±0.201
给药组
20
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0.079±0.012*
0.478±0.279*
注：*与对照组比较：P<0.01。
从表8可以看出，给药组动物淋巴结细胞产生IFN-γ能力明显下降，而产生IL-10的能力显著上升。
讨论
类风湿性关节炎属中医痹证范畴。痹证的发病学理论人们普遍遵循《素问.痹论》的提法，“风寒湿三气杂致，合而为痹”。其中的杂致，鲜有人详究，相实杂表，不一也，杂致即先后不一而致。也就是说，风寒湿之邪，在时间上侵人有先后之别，而三者相合才能致使人体发生痹证。因此先期所致者伏而不发，符合中医学关于感而即发者为新感，感为不即发为伏邪的发病学理论。而《灵枢.贼风》为所论，恰好作为最好的注脚。其曰“此皆尚有所伤于湿气，藏于血脉之中，分肉之间，久留而不去。……其开而遇风寒，则血气凝结，与故邪相袭，则为寒痹。”其中之湿气，被称为故邪，即后世之伏邪。
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邪伏之所，就此言我们认为当属膜原。膜原之说始于《内经》，发扬于明吴又可，后代有阐发。我们认为，人体中的膜样组织大都可归入中医膜原的概念之下。而膜原在中医学中属半表半里之位，而痹症的病位，如《灵枢.周痹》言“此内不在脏，而外未发于表”，不在内，不在表，则在半表半里之间。而结合现代医学RA病发，首先侵犯滑膜，而滑膜称为人体中的膜样组织相当膜原的范畴。因此，我们确定伏邪发于膜原为中医学有关RA的发病学理论，选用黄芪赤风汤合达原饮。
痹证范围很广，我们以目前较常用的Ⅱ型胶原免疫所致大鼠关节炎作为动物模型，同其具有与人RA有相似的遗传性特征，和相似的病理变化[2]，选用了易感DBA小鼠制作动物模型，观察了宣发膜原法对关节炎小鼠的影响。结果表明，宣发膜原法能推迟关节炎的发病时间。降低Ⅱ型胶原所致关节炎的发病率。
从抗Ⅱ型胶原抗体来看，宣发膜原法主要抑制机体对Ⅱ型胶原的体液免疫反应，使抗Ⅱ型胶原抗体IgG及其亚型下降。由于IgG2a和IgG2b均属于Th1型反应的抗体亚型，而IgG1则属于Th2型反应的抗体亚型，而类风湿关节炎属于Th1型免疫反应，因此IgG2a+2b/IgG1能一定程度上反映Th1和Th2型反应水平。我们的结果表明，宣发膜原法能使伏表Th1/Th2型反应的IgG亚型IgG2a+IgG2b/IgG1比较下降，一定程度上说明宣发膜原法同时具有免疫调节作用，即将该关节炎以Th1型反应为主的T细胞反应转为Th2为主的免疫反应，从而有效地控制Ⅱ型胶原免疫对关节的破坏作用。
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为了探讨宣发膜原法作用的可能环节，我们观察了其对关炎小鼠淋巴细胞IFN-γ、IL-10的影响。已经知道，IFN-γ是Th1反应的代表性细胞因子，直接参与关节软骨等组织的损伤[3]，而IL-10是Th2反应的一种细胞因子，能缓解关节炎病情，早期给予IL-10能降低Ⅱ型胶原所致关节炎发病率[4]。我们的结果表明，宣发膜原发能显著降低关节炎小鼠IFN-γ水平，但使IL-10的产生增加。
类风湿因子是一种对自身IgGFc段产生的抗体，其意义本身多是说明具有自身免疫的存在，其在发病中的作用一直是不十分清楚[5]。有人认为，类风湿因子能与抗体形成免疫复合物，沉积局部，激活补体系统，破坏组织。也有人认为，类风湿因子或许能中和自身抗体，起到阻止自身免疫作用。应该看到，自身IgG分子能产生许多克隆的抗自身IgG抗体，因而有一大类风湿因子产生。可以认为，他们肯定会有不同的作用。我们的结果表明，宣发膜原发能提高关节炎大鼠血清IgM型类风湿因子水平。由于我们所指的是抗自身抗Ⅱ型胶原抗体IgG的IgM型类风湿因子，受到诸如抗Ⅱ型胶原抗体IgG的特性、IgM的特异性结合点是该IgG的Fc段还是Fab段的许多因素影响，因而其作用机理有待进于一步阐明。
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作者简介：吕爱平(1963-)，男，中国中医研究院基础理论研究所研究员，博士生导师，从事于中医痹证基础及应用基础研究。
参考文献
[1] Holmdahl,R et al.Immunogenetics of type Ⅱ collagen autoimmunity and susceptibility to collagen arthritis.Immunology,1988,65:305.
[2] Trentham,DE.Collagen arthritis as a relevant model for rheumatoid arthrit is.Evidence pro and con.Arthritis Rheum,1982,25;911.
[3] Weiner HL et al.Oral tolerance:immunologic mechanisms and treatment of an imal and human organ-specific autoimmune diseases by oral administration of autoant igens.Annu Rev immunol,1994,12:809.
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[4] Kasama T et al.Interleukin 10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type Ⅱ collagen induced arthritis.J Clin Invest,1995,95 :2868.
[5] Vaughan,JH.Pathgenetic concepts and origins of rheumatoid factor in rhe umatoid arthritis.Arthritis Rheum,1993,36:1-6.
(收稿日期 1999—06—12 修回日期 1999—08—12), 百拇医药