复圣散对高脂大鼠脑缺血再灌后的脑保护作用
作者：雷 燕 黄启福 王永炎
单位：雷 燕 中国中医研究院西苑医院心内科，北京 100091；黄启福 北京中医药大学脑病研究室，北京 100029；王永炎 中国中医研究院，北京 100700
关键词：复圣散；血管性痴呆大鼠；肿瘤坏死因子；氧自由基；毒损脑络
中国中医基础医学杂志991208 摘 要：目的：研究中医毒损脑络学说与现代医学反复脑缺血后累积性损伤的相互关系，探讨肿瘤坏死因子α(ΤΝF-a)和氧自由基等“毒邪”在血管性痴呆(VD)发病中的意义以及中药复圣散对所谓“毒邪”的干预作用。方法：实验分VD模型组、正常对照组、复圣散预防和治疗等4组；采用食饵性高脂大鼠加反复脑缺血再灌注手术复制VD动物模型，以放免法测定血和脑内TNF-a含量，以化学发光法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性，以硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；同时对脑组织进行病理学检查。结果：与对照组相比，模型组大鼠脑缺血再灌后1d及7d血浆TNF-a含量分别升高49.6%和38.0%，脑内则分别升高49.3%和29.3%；而SOD活性明显降低，MDA含量显著升高(P<0.05～P<0.01)；经复圣散预防和治疗性给药后，TNF-a和MDA含量减少，SOD活性增高，与模型组相比有显著差异P<0.05～P<0.01)。结论：VD的形成与中医毒损脑络学说和现代医学反复脑缺血所致的累积性损害假说密切相关，扶正活血解毒法及组方复圣散可有效减轻缺血性脑损伤，其机理与该方降低脑内TNF-a和MDA的过量释放，提高体内抗脂质过氧化能力有关。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-04
目前认为，反复亚致死性短暂脑缺血导致易损神经元显著的累积性损害是造成血管性痴呆(VD)的重要原因，但机制未明。有学者指出，反复缺血后某些细胞活性物质通过不同途径在体内蓄积，发挥毒性作用，可能是其发生的重要因素之一[1]。本文采用食饵性高脂大鼠加反复脑缺血再灌手术复制VD动物模型，观察了拟痴呆大鼠循环中及脑内肿瘤坏死因子(TNF-a)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的动态变化，并结合海马形态学观察，探讨了细胞因子TNF-a与氧自由基系统在VD发病中的意义和中药复圣散对TNF-a、MDA等所谓“毒邪”的影响，报告如下。
材料与方法
1 药品、试剂和仪器
, http://www.100md.com
中药复圣散由人参、地龙和漏芦组成，方中地龙冻干粉由清华大学生物系研制并提供，余药由北京中医药大学制剂室经醇提制成。试验用TNF-a放免药盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供；MDA和SOD试剂盒购自北京邦定生物制品公司；其他均为北京化工厂的AR级试剂。主要仪器有上海产721型分光光度计和瑞典产LKB-1250发光仪。
2 实验动物及分组
健康雄性Wistar大鼠，体重200g～220g，由中国药物鉴定所动物中心提供，适应性喂养1周后，随机分为：①模型Ⅰ组。高脂饮食喂养加脑缺血再灌注手术，术后1d活杀；②假手术Ⅰ组。高脂饮食喂养和分离血管同模型Ⅰ组，但不进行缺血再灌注，术后1d活杀；③中药Ⅰ组，造模方法同模型Ⅰ组，术前7d预防性灌胃给药，药量为10g/kg日，术后1d活杀；④模型Ⅱ组，造模方法同模型Ⅰ组，术后7d活杀；⑤假手术Ⅱ组，术后7d活杀，余同假手术Ⅰ组；⑥中药Ⅱ组，造模方法同模型Ⅰ组，术前和术后各给药7d，于末次给药后2h活杀；⑦正常对照组，仅饲以普通饮食，不加任何处理，与其它组动物同期喂养。
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3 动物模型的制备
实验用鼠先以高脂饲料[2]喂养4周，经测定证实血脂异常增高后，进行脑缺血再灌造模。大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(0.4ml/100g)，颈部正中切口，分离左右颈总动脉并套以0号丝线扣，向上提起丝线扣以阻断双侧颈总动脉，缺血10min后放松丝线扣恢复灌流10min，反复3次，最后恢复血供，缝合皮肤，术后护理并继续高脂喂养。假手术组只游离双侧颈总动脉而不行缺血再灌手术。手术次日和术后7d，各组动物在麻醉下处死，分别取血和脑组织进行生化检测。
4 血浆和脑组织TNF-a含量测定
采用特异性放射免疫分析法。大鼠断头取血2ml，离心分离出血浆，加抑肽酶，置于-20℃备测；于冰盘上快速分离脑组织，称重后，按W/V1：5加入0.1mol醋酸，煮沸10min后，充分研磨制备脑匀浆液，3500rpm低温离心15min，取上清液，加抑肽酶-20℃保存待测。
, 百拇医药
5 脑组织SOD和MDA含量测定
取预冷的生理盐水按W/V1：9制备脑组织匀浆，3000rpm离心10min，取上清液以化学发光法测定SOD活力[3]；以硫代巴比妥酸法(TBA)[2]测定MDA含量，脑组织蛋白定量采用考马斯亮蓝法[4]。
6 脑组织病理学检查
每组取3只大鼠行脑病理学检查。麻醉下开胸，经左心插管至主动脉行活体灌流固定，灌流液采用预冷的4%多聚甲醛溶液(0.1MPB配制，PH7.4)，30min后断头取脑，置上述灌注液内4℃后固定12h，将鼠脑移入4℃20%蔗糖溶液中，待标本下沉后，取出在漏斗柄部作冠状切块，并置20%福尔马林液中充分固定，乙醇脱水、石蜡包埋后，制作5μm切片，每个脑块取2张脑片，分别进行HE染色和神经尼氏体染色，Olympus光镜下观察。
, http://www.100md.com 7 统计学处理
采用方差分析及q检验和相关分析。
结果
1 各组大鼠血浆和脑内TNF-a含量的变化
由表1可见，模型组大鼠血浆和脑匀浆中TNF-a含量在脑缺血再灌后1d及7d均明显高于正常对照组和同期假手术组，血浆值分别比正常对照组升高49.6%和38.0%，脑内则分别升高49.3%和29.3%，差异显著(P<0.05～P<0.01)；而且血浆与脑匀浆中TNF-a间存在明显相关性(γ=0.718，P<0.05)。复圣散预防及治疗组大鼠血浆和脑内TNF-a含量较同期模型组均有不同程度的降低(P<0.05～0.01)，尤以血浆中的变化更为明显。
2 各组大鼠脑内SOD与MDA水平的变化
, http://www.100md.com 模型组大鼠脑缺血再灌后1d及7d，SOD活性呈减低趋势，而MDA含量则明显增高，与正常对照组和同期假手术组相比，组间差异明显(P<0.05～P<0.01)。经复圣散预防及治疗性给药后，大鼠脑内MDA水平明显降低，同时SOD活性明显升高，与同期模型组比较有显著性差异(P<0.05～P<0.01)(见表1)。
表1 各组大鼠血浆及脑匀浆中TNF-α和脑内SOD、MDA含量比较(
±s) 组 别
鼠数
TNF-α(μg/L)
SOD
(μg/mg.pro)
MDA
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(nmol/mg.pro)
血 浆
脑组织
正常对照组
8
1.21±0.09
0.75±0.11
20.82±5.57
0.15±0.05
假手术Ⅰ组
8
1.33±0.17ΔΔ
, 百拇医药
0.83±0.14ΔΔ
11.92±4.08**Δ
0.36±0.28ΔΔ##
中药Ⅰ组
8
1.56±0.24**ΔΔ#
0.91±0.15ΔΔ
10.85±3.23**Δ
1.06±0.34**Δ
模型Ⅰ组
, 百拇医药
9
1.81±0.21**
1.12±0.17**
6.32±1.35**
1.57±0.91**
假手术Ⅱ组
8
1.30±0.14ΔΔ
0.81±0.14
18.32±4.39ΔΔ
, 百拇医药
0.23±0.15ΔΔ
中药Ⅱ组
8
1.46±0.17**Δ#
0.86±0.16
14.43±1.90**ΔΔ#
0.58±0.41**ΔΔ#
模型Ⅱ组
9
1.67±0.23**
0.97±0.16*
, 百拇医药
9.72±2.73**
1.00±0.36**
注：与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与同期模型组比较：ΔΡ<0.05，ΔΔP<0.01；与同期假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01。
3 各组大鼠海马CA1区形态学观察
光镜下，正常对照组与同期假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层排列整齐而致密，尼氏体丰富；模型组术后1d海马CA1区锥体细胞形态轻微改变，核染变深，少数细胞脱失，至术后7d锥体细胞排列紊乱而疏松，部分细胞脱失，胞核浓染，尼氏体明显减少；而中药预防组术后1d海马CA1区锥体细胞排列尚齐整，未见明显的形态学改变；用药7d后神经元排列基本规则，细胞轻度脱失，部分胞染变深，尼氏体较丰富。提示复圣散对海马CA1区神经元的缺血性损伤有保护作用。
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讨论
1 复圣散对拟痴呆大鼠血浆及脑中TNF-a含量的影响
TNF-a是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由激活的单核-巨噬细胞所分泌，致敏的淋巴细胞、血管内皮细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞及神经元等也能产生该因子。TNF-a的生物学活性具有双重性，适当的TNF-a可调节机体的免疫功能，增强对入侵病原体的抵抗力，对维持机体内稳态及抵制各种致病因子具有重要意义，而过量的TNF-a则可导致多种病理改变。大量研究表明，体内几乎所有细胞都有TNF-a受体分布，TNF-a与其受体结合后可介导多种损伤，主要是直接造成血管内皮细胞损伤，增加血管通透性[5]；激活血小板激活因子，诱导凝血酶活性，并抑制血栓调节蛋白在内皮细胞的表达及其抗血栓机制，导致局部病理性凝血。同时，增加内皮粘附因子ICAM-1的表达[6]和中性粒细胞表面粘附蛋白CD11/CD18的活性[7]，促使微循环的毛细血管被激活了的多形核白细胞和血小板堵塞，组织严重缺血；而且激活多形核白细胞及其他炎性细胞释放大量损伤性介质，如超氧阴离子、过氧化氢、游离羟基及各种蛋白分解酶，加重脑组织血管的损伤。新近研究发现，缺血可引起海马神经元TNF-a基因表达[8]，并造成海马缺血及神经元坏死，因而TNF-a是一种普遍存在于多种疾病中的病理性介质。
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本研究发现，反复脑缺血再灌后第1d及7d，模型组大鼠血浆和脑内TNF-a含量均明显高于正常对照组和同期假手术组，其原因可能与脑缺血缺氧等刺激TNF-mRNA表达和释放TNF-a，以及胶质细胞坏死，溢出TNF-a有关，提示反复、短暂的脑缺血损伤后机体免疫功能有一定改变，细胞因子TNF-a产生增多，并可能介导脑缺血再灌后的某些病理过程。中药复圣散预防和治疗性给药后大鼠TNF-a含量比同期模型组均有不同程度的减少，表明复圣散可有效降低体内TNF-a浓度，从而减轻TNF-a的损害作用。
2 复圣散对拟痴呆大鼠脑内SOD和MDA含量的影响
脑缺血再灌注损伤是多种因素参与的复杂病理过程，而氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是其重要因素之一。许多实验均证实(9)，大鼠脑缺血再灌流的急性期可产生大量的自由基，使MDA含量升高，并消耗SOD而使其活性下降，而且自由基的大量产生是迟发性神经元损害的主要原因。一方面由于反复脑缺血再灌，使缺血组织不断得到大量新的氧供，结果大大激活黄嘌呤氧化酶，产生大量超氧阴离子自由基，并广泛攻击富含不饱和脂肪酸双键的神经元膜和微血管，引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应和微循环障碍，致使大量神经元损害[10]。另一方面又使缺血期间因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基转化得以延续，造成新的恶性循环。此时，体内抗氧化剂被自由基大量消耗，而反应所产生的自由基又超过了体内清除能力，缺血组织中自由基急速蓄积，必然进一步攻击其他细胞的生物膜结构，造成更多的细胞坏死，半暗带区进一步恶化，梗塞范围迅速扩展。
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本研究结果表明，复圣散能明显提高大鼠脑缺血再灌后自由基清除剂SOD的活力，同时显著降低脂质过氧化产物MDA水平，提示复圣散具有自由基清除剂样作用，能够提高机体的抗氧化能力，减少脑缺血再灌流时自由基的生成和阻断其连锁反应，从而达到保护缺血脑组织免遭自由基损害的作用。
3 复圣散对拟痴呆大鼠海马CA1区神经元的保护作用
海马是与学习、记忆等高级神经活动有关的重要核团和参与空间定位的重要中枢。近年研究揭示，海马特别是海马中的CA1段是对缺血性损伤最敏感的脑区之一，也是出现病理改变最晚的部位[11]。这种在CA1段缓慢发生的、不可逆的神经元坏死称为迟发性神经元坏死(DND)。鉴于海马结构的这种选择性缺血易损伤性及其与学习、记忆的密切相关性，目前认为，海马缺血性损害可能是血管性痴呆的病理形态学基础之一[11]。有资料证实[12]，大鼠脑缺血长期再灌存活后可导致海马CA1区的DNA，而海马CA1区受损的动物，可出现明显的记忆障碍，这表明脑缺血致海马CA1区DND是引起缺血性痴呆的重要原因之一。
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本实验形态学观察表明，反复短暂的脑缺血再灌不但可以造成海马CA1区神经元损伤，而且随着再灌流期延长，还可引起海马进一步的继发性损害，提示海马缺血再灌后病理改变呈渐进性。经复圣散预防和治疗性给药后，大鼠海马CA1区的病变程度减轻，表明复圣散具有减轻缺血性脑损伤、保护脑神经元及延缓或防治痴呆的作用，推测其机理可能与复圣散抑制TNF-a超量释放和拮抗脂质过氧化反应等作用有关。
基于以上实验结果，可以认为高脂大鼠反复脑缺血后，毒性氧自由基和病理性介质TNF-a在体内蓄积，并发挥其毒性作用，参与或介导了缺血性脑损伤，可能是反复性脑缺血累积性损害的重要机制之一。这一认识与中医“毒损脑络”学说颇有相通之处[13]。该学说认为，中风后，由于气血不利，痰瘀内滞，日久可蕴积化毒，包括瘀毒、热毒、痰毒等，浊毒之气杂于脑络，脑乏清阳之助，气血无以渗灌，窍络神机失统，继而导致痴呆病变。此处所谓“浊毒”，泛指对机体生理功能有不良影响的有害物质，相当于脑缺血性损伤过程中诸多的病理产物，如兴奋性神经毒、钙超载、酸中毒、毒性氧自由基、炎性介质和促凝血物质的过量释放等等。这些因素均可在体内化毒为害，最终导致神经元的破坏，与现代医学的“累积性损伤”有密切联系。鉴于对中医学“毒损脑络”和现代医学“累积性损伤”的共同认识，因而在防治VD时我们主张要重视驱逐体内的“毒”邪，减少其产生和蓄积，通过疏通脑络，畅流气血，以透达毒邪，恢复气血渗灌功能，维持机体内环境的稳定，这不仅是防病和治病的着眼点，也是提高临床疗效的关键所在。因而在复圣散组方上，重用人参以大补元气，安神益智；伍以地龙活血通络，化瘀行滞；漏芦清热解毒，利湿祛瘀，君一臣二，共奏补元气、化痰瘀、降浊毒的作用，以达扶正祛邪、醒神增智之目的。复圣散的上述脑保护作用部分说明了益气、活血、解毒方药的作用机理，揭示该方可能对于VD的治疗具有潜在的临床应用价值。
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参考文献
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, 百拇医药
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[13] 雷燕，黄启福，王永炎.论瘀毒阴络是络病形成的病理基础.北京中医药大学学报，1999，22(2)：8-10.
(收稿日期 1999—06—01 修回日期 1999—08—19), 百拇医药
单位：雷 燕 中国中医研究院西苑医院心内科，北京 100091；黄启福 北京中医药大学脑病研究室，北京 100029；王永炎 中国中医研究院，北京 100700
关键词：复圣散；血管性痴呆大鼠；肿瘤坏死因子；氧自由基；毒损脑络
中国中医基础医学杂志991208 摘 要：目的：研究中医毒损脑络学说与现代医学反复脑缺血后累积性损伤的相互关系，探讨肿瘤坏死因子α(ΤΝF-a)和氧自由基等“毒邪”在血管性痴呆(VD)发病中的意义以及中药复圣散对所谓“毒邪”的干预作用。方法：实验分VD模型组、正常对照组、复圣散预防和治疗等4组；采用食饵性高脂大鼠加反复脑缺血再灌注手术复制VD动物模型，以放免法测定血和脑内TNF-a含量，以化学发光法测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性，以硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；同时对脑组织进行病理学检查。结果：与对照组相比，模型组大鼠脑缺血再灌后1d及7d血浆TNF-a含量分别升高49.6%和38.0%，脑内则分别升高49.3%和29.3%；而SOD活性明显降低，MDA含量显著升高(P<0.05～P<0.01)；经复圣散预防和治疗性给药后，TNF-a和MDA含量减少，SOD活性增高，与模型组相比有显著差异P<0.05～P<0.01)。结论：VD的形成与中医毒损脑络学说和现代医学反复脑缺血所致的累积性损害假说密切相关，扶正活血解毒法及组方复圣散可有效减轻缺血性脑损伤，其机理与该方降低脑内TNF-a和MDA的过量释放，提高体内抗脂质过氧化能力有关。
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中图分类号：R285.5 文献标识码：B
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-04
目前认为，反复亚致死性短暂脑缺血导致易损神经元显著的累积性损害是造成血管性痴呆(VD)的重要原因，但机制未明。有学者指出，反复缺血后某些细胞活性物质通过不同途径在体内蓄积，发挥毒性作用，可能是其发生的重要因素之一[1]。本文采用食饵性高脂大鼠加反复脑缺血再灌手术复制VD动物模型，观察了拟痴呆大鼠循环中及脑内肿瘤坏死因子(TNF-a)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的动态变化，并结合海马形态学观察，探讨了细胞因子TNF-a与氧自由基系统在VD发病中的意义和中药复圣散对TNF-a、MDA等所谓“毒邪”的影响，报告如下。
材料与方法
1 药品、试剂和仪器
, http://www.100md.com
中药复圣散由人参、地龙和漏芦组成，方中地龙冻干粉由清华大学生物系研制并提供，余药由北京中医药大学制剂室经醇提制成。试验用TNF-a放免药盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供；MDA和SOD试剂盒购自北京邦定生物制品公司；其他均为北京化工厂的AR级试剂。主要仪器有上海产721型分光光度计和瑞典产LKB-1250发光仪。
2 实验动物及分组
健康雄性Wistar大鼠，体重200g～220g，由中国药物鉴定所动物中心提供，适应性喂养1周后，随机分为：①模型Ⅰ组。高脂饮食喂养加脑缺血再灌注手术，术后1d活杀；②假手术Ⅰ组。高脂饮食喂养和分离血管同模型Ⅰ组，但不进行缺血再灌注，术后1d活杀；③中药Ⅰ组，造模方法同模型Ⅰ组，术前7d预防性灌胃给药，药量为10g/kg日，术后1d活杀；④模型Ⅱ组，造模方法同模型Ⅰ组，术后7d活杀；⑤假手术Ⅱ组，术后7d活杀，余同假手术Ⅰ组；⑥中药Ⅱ组，造模方法同模型Ⅰ组，术前和术后各给药7d，于末次给药后2h活杀；⑦正常对照组，仅饲以普通饮食，不加任何处理，与其它组动物同期喂养。
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3 动物模型的制备
实验用鼠先以高脂饲料[2]喂养4周，经测定证实血脂异常增高后，进行脑缺血再灌造模。大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(0.4ml/100g)，颈部正中切口，分离左右颈总动脉并套以0号丝线扣，向上提起丝线扣以阻断双侧颈总动脉，缺血10min后放松丝线扣恢复灌流10min，反复3次，最后恢复血供，缝合皮肤，术后护理并继续高脂喂养。假手术组只游离双侧颈总动脉而不行缺血再灌手术。手术次日和术后7d，各组动物在麻醉下处死，分别取血和脑组织进行生化检测。
4 血浆和脑组织TNF-a含量测定
采用特异性放射免疫分析法。大鼠断头取血2ml，离心分离出血浆，加抑肽酶，置于-20℃备测；于冰盘上快速分离脑组织，称重后，按W/V1：5加入0.1mol醋酸，煮沸10min后，充分研磨制备脑匀浆液，3500rpm低温离心15min，取上清液，加抑肽酶-20℃保存待测。
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5 脑组织SOD和MDA含量测定
取预冷的生理盐水按W/V1：9制备脑组织匀浆，3000rpm离心10min，取上清液以化学发光法测定SOD活力[3]；以硫代巴比妥酸法(TBA)[2]测定MDA含量，脑组织蛋白定量采用考马斯亮蓝法[4]。
6 脑组织病理学检查
每组取3只大鼠行脑病理学检查。麻醉下开胸，经左心插管至主动脉行活体灌流固定，灌流液采用预冷的4%多聚甲醛溶液(0.1MPB配制，PH7.4)，30min后断头取脑，置上述灌注液内4℃后固定12h，将鼠脑移入4℃20%蔗糖溶液中，待标本下沉后，取出在漏斗柄部作冠状切块，并置20%福尔马林液中充分固定，乙醇脱水、石蜡包埋后，制作5μm切片，每个脑块取2张脑片，分别进行HE染色和神经尼氏体染色，Olympus光镜下观察。
, http://www.100md.com 7 统计学处理
采用方差分析及q检验和相关分析。
结果
1 各组大鼠血浆和脑内TNF-a含量的变化
由表1可见，模型组大鼠血浆和脑匀浆中TNF-a含量在脑缺血再灌后1d及7d均明显高于正常对照组和同期假手术组，血浆值分别比正常对照组升高49.6%和38.0%，脑内则分别升高49.3%和29.3%，差异显著(P<0.05～P<0.01)；而且血浆与脑匀浆中TNF-a间存在明显相关性(γ=0.718，P<0.05)。复圣散预防及治疗组大鼠血浆和脑内TNF-a含量较同期模型组均有不同程度的降低(P<0.05～0.01)，尤以血浆中的变化更为明显。
2 各组大鼠脑内SOD与MDA水平的变化
, http://www.100md.com 模型组大鼠脑缺血再灌后1d及7d，SOD活性呈减低趋势，而MDA含量则明显增高，与正常对照组和同期假手术组相比，组间差异明显(P<0.05～P<0.01)。经复圣散预防及治疗性给药后，大鼠脑内MDA水平明显降低，同时SOD活性明显升高，与同期模型组比较有显著性差异(P<0.05～P<0.01)(见表1)。
表1 各组大鼠血浆及脑匀浆中TNF-α和脑内SOD、MDA含量比较(
±s) 组 别鼠数
TNF-α(μg/L)
SOD
(μg/mg.pro)
MDA
, 百拇医药
(nmol/mg.pro)
血 浆
脑组织
正常对照组
8
1.21±0.09
0.75±0.11
20.82±5.57
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假手术Ⅰ组
8
1.33±0.17ΔΔ
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11.92±4.08**Δ
0.36±0.28ΔΔ##
中药Ⅰ组
8
1.56±0.24**ΔΔ#
0.91±0.15ΔΔ
10.85±3.23**Δ
1.06±0.34**Δ
模型Ⅰ组
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9
1.81±0.21**
1.12±0.17**
6.32±1.35**
1.57±0.91**
假手术Ⅱ组
8
1.30±0.14ΔΔ
0.81±0.14
18.32±4.39ΔΔ
, 百拇医药
0.23±0.15ΔΔ
中药Ⅱ组
8
1.46±0.17**Δ#
0.86±0.16
14.43±1.90**ΔΔ#
0.58±0.41**ΔΔ#
模型Ⅱ组
9
1.67±0.23**
0.97±0.16*
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9.72±2.73**
1.00±0.36**
注：与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与同期模型组比较：ΔΡ<0.05，ΔΔP<0.01；与同期假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01。
3 各组大鼠海马CA1区形态学观察
光镜下，正常对照组与同期假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层排列整齐而致密，尼氏体丰富；模型组术后1d海马CA1区锥体细胞形态轻微改变，核染变深，少数细胞脱失，至术后7d锥体细胞排列紊乱而疏松，部分细胞脱失，胞核浓染，尼氏体明显减少；而中药预防组术后1d海马CA1区锥体细胞排列尚齐整，未见明显的形态学改变；用药7d后神经元排列基本规则，细胞轻度脱失，部分胞染变深，尼氏体较丰富。提示复圣散对海马CA1区神经元的缺血性损伤有保护作用。
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讨论
1 复圣散对拟痴呆大鼠血浆及脑中TNF-a含量的影响
TNF-a是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由激活的单核-巨噬细胞所分泌，致敏的淋巴细胞、血管内皮细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞及神经元等也能产生该因子。TNF-a的生物学活性具有双重性，适当的TNF-a可调节机体的免疫功能，增强对入侵病原体的抵抗力，对维持机体内稳态及抵制各种致病因子具有重要意义，而过量的TNF-a则可导致多种病理改变。大量研究表明，体内几乎所有细胞都有TNF-a受体分布，TNF-a与其受体结合后可介导多种损伤，主要是直接造成血管内皮细胞损伤，增加血管通透性[5]；激活血小板激活因子，诱导凝血酶活性，并抑制血栓调节蛋白在内皮细胞的表达及其抗血栓机制，导致局部病理性凝血。同时，增加内皮粘附因子ICAM-1的表达[6]和中性粒细胞表面粘附蛋白CD11/CD18的活性[7]，促使微循环的毛细血管被激活了的多形核白细胞和血小板堵塞，组织严重缺血；而且激活多形核白细胞及其他炎性细胞释放大量损伤性介质，如超氧阴离子、过氧化氢、游离羟基及各种蛋白分解酶，加重脑组织血管的损伤。新近研究发现，缺血可引起海马神经元TNF-a基因表达[8]，并造成海马缺血及神经元坏死，因而TNF-a是一种普遍存在于多种疾病中的病理性介质。
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本研究发现，反复脑缺血再灌后第1d及7d，模型组大鼠血浆和脑内TNF-a含量均明显高于正常对照组和同期假手术组，其原因可能与脑缺血缺氧等刺激TNF-mRNA表达和释放TNF-a，以及胶质细胞坏死，溢出TNF-a有关，提示反复、短暂的脑缺血损伤后机体免疫功能有一定改变，细胞因子TNF-a产生增多，并可能介导脑缺血再灌后的某些病理过程。中药复圣散预防和治疗性给药后大鼠TNF-a含量比同期模型组均有不同程度的减少，表明复圣散可有效降低体内TNF-a浓度，从而减轻TNF-a的损害作用。
2 复圣散对拟痴呆大鼠脑内SOD和MDA含量的影响
脑缺血再灌注损伤是多种因素参与的复杂病理过程，而氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是其重要因素之一。许多实验均证实(9)，大鼠脑缺血再灌流的急性期可产生大量的自由基，使MDA含量升高，并消耗SOD而使其活性下降，而且自由基的大量产生是迟发性神经元损害的主要原因。一方面由于反复脑缺血再灌，使缺血组织不断得到大量新的氧供，结果大大激活黄嘌呤氧化酶，产生大量超氧阴离子自由基，并广泛攻击富含不饱和脂肪酸双键的神经元膜和微血管，引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应和微循环障碍，致使大量神经元损害[10]。另一方面又使缺血期间因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基转化得以延续，造成新的恶性循环。此时，体内抗氧化剂被自由基大量消耗，而反应所产生的自由基又超过了体内清除能力，缺血组织中自由基急速蓄积，必然进一步攻击其他细胞的生物膜结构，造成更多的细胞坏死，半暗带区进一步恶化，梗塞范围迅速扩展。
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本研究结果表明，复圣散能明显提高大鼠脑缺血再灌后自由基清除剂SOD的活力，同时显著降低脂质过氧化产物MDA水平，提示复圣散具有自由基清除剂样作用，能够提高机体的抗氧化能力，减少脑缺血再灌流时自由基的生成和阻断其连锁反应，从而达到保护缺血脑组织免遭自由基损害的作用。
3 复圣散对拟痴呆大鼠海马CA1区神经元的保护作用
海马是与学习、记忆等高级神经活动有关的重要核团和参与空间定位的重要中枢。近年研究揭示，海马特别是海马中的CA1段是对缺血性损伤最敏感的脑区之一，也是出现病理改变最晚的部位[11]。这种在CA1段缓慢发生的、不可逆的神经元坏死称为迟发性神经元坏死(DND)。鉴于海马结构的这种选择性缺血易损伤性及其与学习、记忆的密切相关性，目前认为，海马缺血性损害可能是血管性痴呆的病理形态学基础之一[11]。有资料证实[12]，大鼠脑缺血长期再灌存活后可导致海马CA1区的DNA，而海马CA1区受损的动物，可出现明显的记忆障碍，这表明脑缺血致海马CA1区DND是引起缺血性痴呆的重要原因之一。
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本实验形态学观察表明，反复短暂的脑缺血再灌不但可以造成海马CA1区神经元损伤，而且随着再灌流期延长，还可引起海马进一步的继发性损害，提示海马缺血再灌后病理改变呈渐进性。经复圣散预防和治疗性给药后，大鼠海马CA1区的病变程度减轻，表明复圣散具有减轻缺血性脑损伤、保护脑神经元及延缓或防治痴呆的作用，推测其机理可能与复圣散抑制TNF-a超量释放和拮抗脂质过氧化反应等作用有关。
基于以上实验结果，可以认为高脂大鼠反复脑缺血后，毒性氧自由基和病理性介质TNF-a在体内蓄积，并发挥其毒性作用，参与或介导了缺血性脑损伤，可能是反复性脑缺血累积性损害的重要机制之一。这一认识与中医“毒损脑络”学说颇有相通之处[13]。该学说认为，中风后，由于气血不利，痰瘀内滞，日久可蕴积化毒，包括瘀毒、热毒、痰毒等，浊毒之气杂于脑络，脑乏清阳之助，气血无以渗灌，窍络神机失统，继而导致痴呆病变。此处所谓“浊毒”，泛指对机体生理功能有不良影响的有害物质，相当于脑缺血性损伤过程中诸多的病理产物，如兴奋性神经毒、钙超载、酸中毒、毒性氧自由基、炎性介质和促凝血物质的过量释放等等。这些因素均可在体内化毒为害，最终导致神经元的破坏，与现代医学的“累积性损伤”有密切联系。鉴于对中医学“毒损脑络”和现代医学“累积性损伤”的共同认识，因而在防治VD时我们主张要重视驱逐体内的“毒”邪，减少其产生和蓄积，通过疏通脑络，畅流气血，以透达毒邪，恢复气血渗灌功能，维持机体内环境的稳定，这不仅是防病和治病的着眼点，也是提高临床疗效的关键所在。因而在复圣散组方上，重用人参以大补元气，安神益智；伍以地龙活血通络，化瘀行滞；漏芦清热解毒，利湿祛瘀，君一臣二，共奏补元气、化痰瘀、降浊毒的作用，以达扶正祛邪、醒神增智之目的。复圣散的上述脑保护作用部分说明了益气、活血、解毒方药的作用机理，揭示该方可能对于VD的治疗具有潜在的临床应用价值。
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(收稿日期 1999—06—01 修回日期 1999—08—19), 百拇医药