不同树龄的银杏叶在不同生长季节中银杏总黄酮和总内酯的含量变化
作者：仲英 唐文照 丁杏苞 左春旭
单位：山东省医学科学院药物研究所(济南 250062)
关键词：
中草药991212 银杏叶为银杏科植物银杏 Gonkgo biloba L. 的干燥绿叶。银杏叶主要含黄酮和内酯类有效成分。前人研究[1～10]结果表明，银杏叶有效成分的含量与不同生长季节的树龄紧密相关。为了弄清本地产银杏叶有效成分含量与季节变化的关系，我们用高效液相色谱法做了不同树龄的银杏叶在不同月份的总黄酮和总内酯的含量测定，结果4月分总黄酮含量最高，9月份后总黄酮含量有所降低，11月份黄酮含量最低。总内脂含量以5月份为最高，8月份开始含量显著下降，11月份含量最低。此结果为适时采收银杏叶合理开发利用，提供依据。
1 仪器与材料
, http://www.100md.com 1.1 仪器：美国 Waters Alliance 高效液相色谱仪；PDA99b 检测器；410示差检测器；Millipore MILLIQ-2 超纯水制备仪；Resolve C18(8 mm×100 mm)径向加压色谱柱。
1.2 材料：槲皮素、山柰素、异鼠李素、银杏内酯 C 标准品由中国药品生物制品检定所提供；白果内酯、银杏内酯 A，B 由 Sigma 公司提供。
1.3 银杏样品：于1997年4～11月的15日采自济南山东医科大学校园内30余年生与10余年生银杏树上的银杏叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：流动相(测定黄酮)：甲醇-50%磷酸溶液(48∶52)；流速：1 mL/min；检测波长368 nm；进样量10 μL，外标法计算含量。
, 百拇医药
流动相(测定内酯)：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；示差检测；柱温35 ℃；进样量10 μL；外标法计算含量。
2.2 样品制备
2.2.1 银杏总黄酮样品制备：取银杏叶 1 g，精密称定，加70%甲醇溶液 100 mL，称重。加热回流 3 h，放冷加70%甲醇至原重量，过滤。精密量取续滤液 40 mL，加浓盐酸 8 mL，加热回流 30 min，迅速冷却，用甲醇定量转入 50 mL 容量瓶并稀释至刻度，用 0.4 μm 的滤膜过滤，作为黄酮供试品溶液。
2.2.2 银杏总内酯样品制备：取银杏叶 3 g，精密称定，加70%甲醇溶液 300 mL，称重。加热回流 3 h，冷却，加70%甲醇至原重，过滤。取续滤液 250 mL，减压回收甲醇至无醇味，剩余溶液冷却，加2%盐酸4滴，以乙酸乙酯萃取4次(50，40，40，40 mL)，合并萃取液，回收溶剂至干。残渣以70%丙酮 10 mL 溶解，上氧化铝小柱(板层用氧化铝，中性，200～300目，2 g，柱直径10 mm)，用 75 mL 丙酮洗脱，洗脱液回收至干，残余物以甲醇溶解至 5 mL 容量瓶中，并稀释至刻度。用 0.4 μm 的滤膜过滤，作为内酯供试品溶液。
, 百拇医药
2.3 对照品溶液的制备
2.3.1 黄酮对照品溶液的制备：配制槲皮素 0.1 mg/mL、山柰素 0.1 mg/mL、异鼠李素 0.06 mg/mL 的储备液，临用前精密量取各 1 mL，混匀，作为黄酮对照品液。
2.3.2 内酯对照品溶液的制备：精密称取白果内酯、银杏内酯 A，B，C 的对照品，加甲醇制成每 1 mL 分别含2，1，1，1 mg 的混合溶液，作为内酯对照品溶液。
2.4 标准曲线制备：进样测定并算得各对照品的回归方程为槲皮素： Y=179861.75X-2666.3，r=0.9998，线性范围0.15～0.45 μg；山柰素 Y=219357.75X+9502.66，r=0.9994，线性范围0.15～0.45 μg；异鼠李素 Y=121920.75X-1488.66，r=0.9996，线性范围 0.10～0.40 μg；白果内酯 Y=735747.30X-8112.53，r=0.9993，线性范围 10～40 μg；银杏内酯 A Y=223514.75X-251.33，r=0.9996，线性范围 5～25 μg；银杏内酯 B Y=275020.00X+4811.66，r=0.9992，线性范围 5～25 μg；银杏内酯 C Y=221941.00X+221.66，r=0.9993，线性范围 5～25 μg。
, 百拇医药
2.5 精密度试验：试验结果 RSD 为：槲皮素 2.54%；山柰素 2.85%；异鼠李素 2.63%；白果内酯 1.93%；银杏内酯A 2.02%；银杏内酯 B 2.22%；银杏内酯 C 2.90%(n=6)。
2.6 回收试验：加样测定结果为：槲皮素 98.03%；山柰素 97.28%；异鼠李素 96.58%；白果内酯 99.23%；银杏内酯 A 96.43%；银杏内酯 B 96.82%；银杏内酯 C 97.35%(n=6)。
2.7 样品含量测定：分别精密吸取银杏黄酮对照品和供试品溶液、银杏内酯对照品和供试品溶液各 10 μL，按色谱条件测定，外标法计算含量。黄酮分别计算3种黄酮苷元含量，按下式换算成总黄酮苷含量。总黄酮苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51。内酯含量为4种内酯含量之和。银杏黄酮、内酯对照品及不同树龄银杏叶在不同月份黄酮、内酯含量见表1。
, http://www.100md.com 表1 不同树龄银杏叶在不同月份黄酮、内酯含量(%) 月
份
4
5
6
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8
9
10
11
大树
小树
大树
, http://www.100md.com
小树
大树
小树
大树
小树
大树
小树
大树
小树
大树
小树
大树
小树
槲
, 百拇医药
皮
素
0.163
0.291
0.103
0.133
0.087
0.127
0.080
0.123
0.075
0.119
0.059
, http://www.100md.com
0.131
0.063
0.064
0.059
0.095
山
柰
素
0.183
0.314
0.071
0.133
0.065
, http://www.100md.com
0.131
0.071
0.127
0.064
0.127
0.055
0.089
0.047
0.123
0.055
0.083
异
鼠
, 百拇医药
李
素
0.063
0.103
0.019
0.039
0.035
0.043
0.031
0.047
0.030
0.036
0.019
, 百拇医药
0.024
0.019
0.056
0.008
0.036
总
黄
酮
1.026
1.777
0.484
0.765
0.469
, 百拇医药
0.755
0.456
0.745
0.424
0.707
0.334
0.612
0.324
0.609
0.306
0.537
总
内
, http://www.100md.com
酯
0.28
0.50
0.59
0.72
0.52
0.68
0.49
0.57
0.39
0.43
0.37
0.42
, 百拇医药
0.37
0.41
0.36
0.38
3 小结与讨论
综上所述，提高银杏叶浸膏与制剂质量的关键是银杏叶的质量，这与树龄、采收季节、产地有很大关系。另外，必须选择准确、稳定、可靠的检测方法，才能切实控制好银杏叶浸膏与制剂的质量，在解决了银杏叶质量与检测手段这两个关键问题后，再进行浸膏与制剂的生产工艺的研究，方能取得较满意的结果。
作者简介：仲英，副研究员，1982年毕业于山东中医药大学药学系，学士学位.多年来
主要从事天然药物化学及分析方面的研究和新药研制工作.主要研究的药物有
, 百拇医药
葛根、叶下珠、银杏叶、瓦松、柽柳、芦笋、山楂叶等，其中叶下珠、葛根、芦笋等方面的研究均获省部级科技进步奖.
参考文献
1 陈仲良.中国药学杂志，1996，31(6)：326
2 杨义方，等.国外医药-植物药分册，1995，10(4)：147
3 钟郁青，等.药学学报，1995，30(9)：694
4 虞杏英，等.药物分析杂志，1993，13(2)：85
5 池静端，等.药学学报，1997，32(8)：625
6 庄向平，等.中草药，1992，23(8)：122
7 陶巧凤，等.中成药，1993，15(12)：14
8 苑可武，等.中草药，1997，28(4)：211
9 Teris A, et al. Planta Med, 1992,58:413
10 Lobstein A, et al. Planta Med,1991，57：430
收稿日期：1998-11-05, 百拇医药
单位：山东省医学科学院药物研究所(济南 250062)
关键词：
中草药991212 银杏叶为银杏科植物银杏 Gonkgo biloba L. 的干燥绿叶。银杏叶主要含黄酮和内酯类有效成分。前人研究[1～10]结果表明，银杏叶有效成分的含量与不同生长季节的树龄紧密相关。为了弄清本地产银杏叶有效成分含量与季节变化的关系，我们用高效液相色谱法做了不同树龄的银杏叶在不同月份的总黄酮和总内酯的含量测定，结果4月分总黄酮含量最高，9月份后总黄酮含量有所降低，11月份黄酮含量最低。总内脂含量以5月份为最高，8月份开始含量显著下降，11月份含量最低。此结果为适时采收银杏叶合理开发利用，提供依据。
1 仪器与材料
, http://www.100md.com 1.1 仪器：美国 Waters Alliance 高效液相色谱仪；PDA99b 检测器；410示差检测器；Millipore MILLIQ-2 超纯水制备仪；Resolve C18(8 mm×100 mm)径向加压色谱柱。
1.2 材料：槲皮素、山柰素、异鼠李素、银杏内酯 C 标准品由中国药品生物制品检定所提供；白果内酯、银杏内酯 A，B 由 Sigma 公司提供。
1.3 银杏样品：于1997年4～11月的15日采自济南山东医科大学校园内30余年生与10余年生银杏树上的银杏叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：流动相(测定黄酮)：甲醇-50%磷酸溶液(48∶52)；流速：1 mL/min；检测波长368 nm；进样量10 μL，外标法计算含量。
, 百拇医药
流动相(测定内酯)：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；示差检测；柱温35 ℃；进样量10 μL；外标法计算含量。
2.2 样品制备
2.2.1 银杏总黄酮样品制备：取银杏叶 1 g，精密称定，加70%甲醇溶液 100 mL，称重。加热回流 3 h，放冷加70%甲醇至原重量，过滤。精密量取续滤液 40 mL，加浓盐酸 8 mL，加热回流 30 min，迅速冷却，用甲醇定量转入 50 mL 容量瓶并稀释至刻度，用 0.4 μm 的滤膜过滤，作为黄酮供试品溶液。
2.2.2 银杏总内酯样品制备：取银杏叶 3 g，精密称定，加70%甲醇溶液 300 mL，称重。加热回流 3 h，冷却，加70%甲醇至原重，过滤。取续滤液 250 mL，减压回收甲醇至无醇味，剩余溶液冷却，加2%盐酸4滴，以乙酸乙酯萃取4次(50，40，40，40 mL)，合并萃取液，回收溶剂至干。残渣以70%丙酮 10 mL 溶解，上氧化铝小柱(板层用氧化铝，中性，200～300目，2 g，柱直径10 mm)，用 75 mL 丙酮洗脱，洗脱液回收至干，残余物以甲醇溶解至 5 mL 容量瓶中，并稀释至刻度。用 0.4 μm 的滤膜过滤，作为内酯供试品溶液。
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2.3 对照品溶液的制备
2.3.1 黄酮对照品溶液的制备：配制槲皮素 0.1 mg/mL、山柰素 0.1 mg/mL、异鼠李素 0.06 mg/mL 的储备液，临用前精密量取各 1 mL，混匀，作为黄酮对照品液。
2.3.2 内酯对照品溶液的制备：精密称取白果内酯、银杏内酯 A，B，C 的对照品，加甲醇制成每 1 mL 分别含2，1，1，1 mg 的混合溶液，作为内酯对照品溶液。
2.4 标准曲线制备：进样测定并算得各对照品的回归方程为槲皮素： Y=179861.75X-2666.3，r=0.9998，线性范围0.15～0.45 μg；山柰素 Y=219357.75X+9502.66，r=0.9994，线性范围0.15～0.45 μg；异鼠李素 Y=121920.75X-1488.66，r=0.9996，线性范围 0.10～0.40 μg；白果内酯 Y=735747.30X-8112.53，r=0.9993，线性范围 10～40 μg；银杏内酯 A Y=223514.75X-251.33，r=0.9996，线性范围 5～25 μg；银杏内酯 B Y=275020.00X+4811.66，r=0.9992，线性范围 5～25 μg；银杏内酯 C Y=221941.00X+221.66，r=0.9993，线性范围 5～25 μg。
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2.5 精密度试验：试验结果 RSD 为：槲皮素 2.54%；山柰素 2.85%；异鼠李素 2.63%；白果内酯 1.93%；银杏内酯A 2.02%；银杏内酯 B 2.22%；银杏内酯 C 2.90%(n=6)。
2.6 回收试验：加样测定结果为：槲皮素 98.03%；山柰素 97.28%；异鼠李素 96.58%；白果内酯 99.23%；银杏内酯 A 96.43%；银杏内酯 B 96.82%；银杏内酯 C 97.35%(n=6)。
2.7 样品含量测定：分别精密吸取银杏黄酮对照品和供试品溶液、银杏内酯对照品和供试品溶液各 10 μL，按色谱条件测定，外标法计算含量。黄酮分别计算3种黄酮苷元含量，按下式换算成总黄酮苷含量。总黄酮苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51。内酯含量为4种内酯含量之和。银杏黄酮、内酯对照品及不同树龄银杏叶在不同月份黄酮、内酯含量见表1。
, http://www.100md.com 表1 不同树龄银杏叶在不同月份黄酮、内酯含量(%) 月
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大树
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槲
, 百拇医药
皮
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0.291
0.103
0.133
0.087
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0.059
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0.131
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素
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0.43
0.37
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0.37
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0.36
0.38
3 小结与讨论
综上所述，提高银杏叶浸膏与制剂质量的关键是银杏叶的质量，这与树龄、采收季节、产地有很大关系。另外，必须选择准确、稳定、可靠的检测方法，才能切实控制好银杏叶浸膏与制剂的质量，在解决了银杏叶质量与检测手段这两个关键问题后，再进行浸膏与制剂的生产工艺的研究，方能取得较满意的结果。
作者简介：仲英，副研究员，1982年毕业于山东中医药大学药学系，学士学位.多年来
主要从事天然药物化学及分析方面的研究和新药研制工作.主要研究的药物有
, 百拇医药
葛根、叶下珠、银杏叶、瓦松、柽柳、芦笋、山楂叶等，其中叶下珠、葛根、芦笋等方面的研究均获省部级科技进步奖.
参考文献
1 陈仲良.中国药学杂志，1996，31(6)：326
2 杨义方，等.国外医药-植物药分册，1995，10(4)：147
3 钟郁青，等.药学学报，1995，30(9)：694
4 虞杏英，等.药物分析杂志，1993，13(2)：85
5 池静端，等.药学学报，1997，32(8)：625
6 庄向平，等.中草药，1992，23(8)：122
7 陶巧凤，等.中成药，1993，15(12)：14
8 苑可武，等.中草药，1997，28(4)：211
9 Teris A, et al. Planta Med, 1992,58:413
10 Lobstein A, et al. Planta Med,1991，57：430
收稿日期：1998-11-05, 百拇医药