凋亡基因在肿瘤耐药中的作用
作者：刘建夏 钱海鑫 左剑玲
单位：刘建夏(215006 苏州医学院附属第一医院外科)； 钱海鑫(215006 苏州医学院附属第一医院外科)； 左剑玲(215006 苏州医学院附属第一医院外科)
关键词：CD95；凋亡；耐药性
江苏医药000112 摘 要：目的 观察凋亡基因CD95/CD95L在肿瘤细胞耐药机制中的作用。方法 用DOX和CH-11作用于人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和耐药株RPMI8226/DOX40，观察肿瘤细胞的凋亡基因的表达和死亡情况。结果 敏感株细胞CD95的表达高于耐药株，耐药株细胞获得对DOX耐药的同时，也获得对CD95L的耐受。结论 CD95/CD95L系统涉及肿瘤耐药性的产生。
The Role of Apoptosis gene in Drug-Resistant Cell Lines
, 百拇医药
LIU Jianxia，QIAN Haixin，ZUO Jinanling.
(The First Hospital of Suzhou Medical College.Suzhou Jiangsu 215006)
Abstract：Objective To evaluate the effect of apoptosis gene CD95/CD95L in drug-resistant cell lines. Methods RPMI8226 and RPMI8226/DOX40 cells were treated with Dox and CH-11.Expression of CD95/CD95L and apoptosis were observed after treatment. Results CH-11 induced apoptosis in RPMI8226.But it has not such effects in RPMI8226/DOX cells. Conclusion CD95/CD95L system is involved in the mechanism of drug-resistance.
, 百拇医药
Key Words：CD95 Apoptosis MDR▲
肿瘤细胞接触一种药物后，对多种天然的结构与作用原理迥异的一系列药物发生交叉抗药性，称为多药耐药性(MDR)，它和MRP.Mdr1.TOPOⅡ及GSH等基因的表达有关[1]，近年来随着研究的深入，发现耐药的发生与肿瘤细胞的凋亡(Apoptosis)[2，3]有关。
CD95/CD95L系统是调控凋亡的关键基因，已有报道认为药物杀伤癌细胞与凋亡有关。我们推测：CD95/CD95L可能参与了肿瘤对化疗药物的耐受机制。在实验中，我们发现治疗剂量的化疗药物能引起多发性骨髓瘤细胞CD95的改变，启动肿瘤细胞发生PCD，而肿瘤细胞获得对DOX耐受的同时，也获得对CD95L的耐受。
材料与方法
一、细胞株和试剂
, 百拇医药
人多发性骨髓瘤细胞敏感株RPMI8226和耐药株RPMI8226/DOX40来自美国Type Culture Collection(Dr.JF.Rossi赠)。细胞生长在RPMI1640培养基，含10%小牛血清。耐药株细胞培养基中加入DOX(终浓度10-7mmol/L)。
Doxorubicin(Farmitalia，Milano，Italy)；CD95L单克隆抗体(Pharmingen公司USA)；对照组IgGl，IgG2a，IgM，Fas单抗ZB4(IgGl)和CH-11(IgM)(Immunotech公司，France)；P-gP单抗(MRK-16)(Valbiotech公司France)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)；MTT试剂(Sigma公司USA)；FACScan(Becton Dickinson Heidelbeng，Germany)。
二、凋亡的检测
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FACScan：细胞用PBS洗二遍，加70%冷酒精(4℃)，过夜，离心去上清加PI(60μg/ml)500μl，于室温30分钟后FCM仪检测凋亡峰下面积。
MTT法：96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液(5×104/孔)和100μl试验药物，各浓度设3个复孔。37℃、5%CO2培养72小时，离心去上清，加入MTT试剂200μl/孔(0.5mg/ml)，37℃孵育4小时后，去上清，加入DMSO200μl/孔。振荡溶解甲膦后，用MR5000型酶标仪，于570nm波长测OD值。
三、抗原表达
细胞处理后，用1%小牛血清的PBS洗二遍，加入一抗，4℃孵育30分钟。用PBS洗二遍后，加入标记FITC或PE的二抗，4℃孵育30分钟。FACScan测定阳性峰下面积。测定细胞内抗原表达，Triton-100在膜上打孔后，如上法检测。
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四、Western Blotting
细胞经处理后，取3×106细胞，加入裂解液500μl(Triton-100，300mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl pH7.6；1mmol/LPMSF)0℃。30分钟后离心(12000g，4℃，2′)，取上清，测蛋白含量，用10%PAGE分离蛋白，步骤见ECL Western Blotting Protocol(Amer-sham)。
结果
一、CD95和CD95L在肿瘤细胞表达
按方法中所示，对照组加鼠抗人IgGl，RPMI8226敏感株CD95的阳性率为58.14%。而RPMI8226/DOX40细胞仅为10.55%(图1)。用FACScan方法，均未测出CD95L在RPMI8226和RPMI8226/DOX40细胞和细胞浆内的表达。
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二、耐药细胞株抗凋亡作用
将RPMI8226细胞和RPMI8226/DOX40细胞分别培养在无血清培养基中48小时，用PI掺入法和台盼蓝法计算细胞凋亡。台盼蓝法结果：PPMI8226死亡率为25%，RPMI8226/DOX40死亡率为5%。PI法结果：RPMI8226细胞凋亡率为10.33%RPMI8226/DOX40凋亡率为1.13%。
观察CD95单克隆抗体CH-11对肿瘤细胞的杀伤作用。用MTT法测定死亡率，PI掺入法测细胞凋亡。MTT法显示：RPMI8226细胞死亡率和CH-11的浓度成正比，当CH-11达500ng/ml时，RPMI8226细胞死亡率达40%。而RPMI8226/DOX40细胞死亡率仅10%(见图2)。PI法显示：CH-11浓度150ng/ml时，RPMI8226细胞凋亡率为23%，而RPMI8226/DOX40细胞凋亡率为12%。
三、CD95的蛋白表达
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Western Blotting测定蛋白质的表达是一种较敏感的方法。RPMI8226细胞在用DOX处理前后，其CD95的表达均明显高于RPMI8226/DOX40细胞，同时发现，DOX能诱导CD95蛋白的表达增加。
图1 CD95抗原在RPMI8226细胞膜的表达，虚线为对照组。
a：RPMI8226敏感株细胞；b：RPMI8226/DOX40细胞。
图2 RPMI8226和RPMI8226/DOX40细胞与CH-11作用16小时，用MTT法测定细胞凋亡
讨论
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CD95是45KD的Ⅰ型膜蛋白，属于TNF受体家族成员，CD95配体(CD95L)是37KD的Ⅱ型膜蛋白，属于TNF和CD40配体家族成员[4]。CD95和CD95L抗原广泛表达于许多组织细胞和被激活的细胞表面[5，6]。当它们相互作用后，引发了靶细胞的程序性死亡(PCD)。凋亡作为一种调节机理广泛地存在体内，当这种调节失衡时，就会导致组织细胞功能丧失或组织过度增生。如肝癌细胞CD95表达缺失，肝癌细胞增生；桥本氏病，CD95高表达，导致甲状腺组织受损。
首先我们发现，RPMI8226细胞和其相应的耐药株RPMI8226/DOX40细胞，表面CD95抗原的表达不同，耐药株细胞表面CD95表达低于敏感株。TerryH[8]用RT-PCR的方法，比较RPMI8226细胞和其相应的低、中、高度耐药株RPMI8226/DOX1，DOX6和DOX40的CD95mRNA，其中RPMI8226/DOX6和RPMI8226/DOX40中CD95明显低于RPMI8226细胞，因此耐药细胞表面和CD95L结合的机会也低于敏感株，为耐药株生存提供了有利的条件。
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DOX对肿瘤细胞的作用如何呢?根据DOX在病人体内血药浓度为0.001μg/ml～0.02μg/ml，我们选用DOX浓度为0.001μg/ml～0.05μg/ml。Friesen认为，当药物浓度在1～10μg/ml时，细胞死亡时不伴有典型的DNA节段性断裂的现象[7]，也就是说非凋亡所致。用Western Blotting方法发现：DOX能诱导敏感株细胞CD95基因的表达增加，耐药株细胞则相反，经DOX处理后CD95的表达无任何变化。Friesen等[7]报道了阿霉素(DOX)能触发CEM和Jurkat细胞CD95LmRNA的增加，引发肿瘤细胞的凋亡。当CD95单抗CH-11和RPMI8226作用测定其死亡率(MTT法)，发现CH-11引起细胞的死亡和其浓度成正比，耐药细胞拮抗CH-11的杀伤作用。所以CH-11和细胞表面CD95抗原的结合，触发细胞凋亡。CD95/CD95L系统已公认是调节细胞程序性死亡的关键因素，Friesen和Martina[9]均认为DOX等化疗药物引起细胞死亡是通过CD95/CD95L途径，用抑制性CD95单抗F(ab′)-anti-ApoI能阻断DOX所引起的细胞凋亡。我们认为对DOX耐药的细胞，可以通过改变CD95/CD95L来拮抗DOX所致的凋亡。■
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参考文献：
[1]Ueda K.The mdrI gene responsible for multi-drug resistance，codes for Pglycoprotein.Biochem Biophys Res Commun，1986，141：956
[2]Diane H，Hans D,Randolph J,et al.The role of CD40 and its Ligand in the regulation of the immune response.Immunological Reviews，1994，138：23
[3]Robert J.Tumor cell survival and resistance to therapy.Current Opinion in Hematology，1996，3：279
, 百拇医药
[4]Hans J.Tumor necrosis factor ligand superfamily involvement in the pathology of malignant lymphomas.Blood，1995，12：3378
[5]Nishimura Y,Ishii A,Kobayashi Y et al.Expression and function of mouse Fas antigen on immature and mature T cells.J Immunol，1995，154：4395
[6]Kagi D，Vignaux Y,Ledermann B,et al.Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell mediated cytotoxicity.Science，1994，265：528(Wash DC)
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[7]Friesen C,Ingrid H,Peter H,et al.Involvement of the CD95 receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cell.Nature Medicine，1996，5：547
[8]Terry H,Mary C.Selection for drug resistance results in resistance to Fas-mediated apoptosis.Blood，1997，6：1854
[9]Martina M,Susanne S,Hubert H,et al.Drug-induced apoptosis in hepatoma cells is mediated by the CD95 receptor/liganel system and involves activation of wild-type p53.J Clin Invest，1997，3：403.
收稿日期：1999-03-02
修稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com
单位：刘建夏(215006 苏州医学院附属第一医院外科)； 钱海鑫(215006 苏州医学院附属第一医院外科)； 左剑玲(215006 苏州医学院附属第一医院外科)
关键词：CD95；凋亡；耐药性
江苏医药000112 摘 要：目的 观察凋亡基因CD95/CD95L在肿瘤细胞耐药机制中的作用。方法 用DOX和CH-11作用于人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和耐药株RPMI8226/DOX40，观察肿瘤细胞的凋亡基因的表达和死亡情况。结果 敏感株细胞CD95的表达高于耐药株，耐药株细胞获得对DOX耐药的同时，也获得对CD95L的耐受。结论 CD95/CD95L系统涉及肿瘤耐药性的产生。
The Role of Apoptosis gene in Drug-Resistant Cell Lines
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LIU Jianxia，QIAN Haixin，ZUO Jinanling.
(The First Hospital of Suzhou Medical College.Suzhou Jiangsu 215006)
Abstract：Objective To evaluate the effect of apoptosis gene CD95/CD95L in drug-resistant cell lines. Methods RPMI8226 and RPMI8226/DOX40 cells were treated with Dox and CH-11.Expression of CD95/CD95L and apoptosis were observed after treatment. Results CH-11 induced apoptosis in RPMI8226.But it has not such effects in RPMI8226/DOX cells. Conclusion CD95/CD95L system is involved in the mechanism of drug-resistance.
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Key Words：CD95 Apoptosis MDR▲
肿瘤细胞接触一种药物后，对多种天然的结构与作用原理迥异的一系列药物发生交叉抗药性，称为多药耐药性(MDR)，它和MRP.Mdr1.TOPOⅡ及GSH等基因的表达有关[1]，近年来随着研究的深入，发现耐药的发生与肿瘤细胞的凋亡(Apoptosis)[2，3]有关。
CD95/CD95L系统是调控凋亡的关键基因，已有报道认为药物杀伤癌细胞与凋亡有关。我们推测：CD95/CD95L可能参与了肿瘤对化疗药物的耐受机制。在实验中，我们发现治疗剂量的化疗药物能引起多发性骨髓瘤细胞CD95的改变，启动肿瘤细胞发生PCD，而肿瘤细胞获得对DOX耐受的同时，也获得对CD95L的耐受。
材料与方法
一、细胞株和试剂
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人多发性骨髓瘤细胞敏感株RPMI8226和耐药株RPMI8226/DOX40来自美国Type Culture Collection(Dr.JF.Rossi赠)。细胞生长在RPMI1640培养基，含10%小牛血清。耐药株细胞培养基中加入DOX(终浓度10-7mmol/L)。
Doxorubicin(Farmitalia，Milano，Italy)；CD95L单克隆抗体(Pharmingen公司USA)；对照组IgGl，IgG2a，IgM，Fas单抗ZB4(IgGl)和CH-11(IgM)(Immunotech公司，France)；P-gP单抗(MRK-16)(Valbiotech公司France)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)；MTT试剂(Sigma公司USA)；FACScan(Becton Dickinson Heidelbeng，Germany)。
二、凋亡的检测
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FACScan：细胞用PBS洗二遍，加70%冷酒精(4℃)，过夜，离心去上清加PI(60μg/ml)500μl，于室温30分钟后FCM仪检测凋亡峰下面积。
MTT法：96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液(5×104/孔)和100μl试验药物，各浓度设3个复孔。37℃、5%CO2培养72小时，离心去上清，加入MTT试剂200μl/孔(0.5mg/ml)，37℃孵育4小时后，去上清，加入DMSO200μl/孔。振荡溶解甲膦后，用MR5000型酶标仪，于570nm波长测OD值。
三、抗原表达
细胞处理后，用1%小牛血清的PBS洗二遍，加入一抗，4℃孵育30分钟。用PBS洗二遍后，加入标记FITC或PE的二抗，4℃孵育30分钟。FACScan测定阳性峰下面积。测定细胞内抗原表达，Triton-100在膜上打孔后，如上法检测。
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四、Western Blotting
细胞经处理后，取3×106细胞，加入裂解液500μl(Triton-100，300mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl pH7.6；1mmol/LPMSF)0℃。30分钟后离心(12000g，4℃，2′)，取上清，测蛋白含量，用10%PAGE分离蛋白，步骤见ECL Western Blotting Protocol(Amer-sham)。
结果
一、CD95和CD95L在肿瘤细胞表达
按方法中所示，对照组加鼠抗人IgGl，RPMI8226敏感株CD95的阳性率为58.14%。而RPMI8226/DOX40细胞仅为10.55%(图1)。用FACScan方法，均未测出CD95L在RPMI8226和RPMI8226/DOX40细胞和细胞浆内的表达。
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二、耐药细胞株抗凋亡作用
将RPMI8226细胞和RPMI8226/DOX40细胞分别培养在无血清培养基中48小时，用PI掺入法和台盼蓝法计算细胞凋亡。台盼蓝法结果：PPMI8226死亡率为25%，RPMI8226/DOX40死亡率为5%。PI法结果：RPMI8226细胞凋亡率为10.33%RPMI8226/DOX40凋亡率为1.13%。
观察CD95单克隆抗体CH-11对肿瘤细胞的杀伤作用。用MTT法测定死亡率，PI掺入法测细胞凋亡。MTT法显示：RPMI8226细胞死亡率和CH-11的浓度成正比，当CH-11达500ng/ml时，RPMI8226细胞死亡率达40%。而RPMI8226/DOX40细胞死亡率仅10%(见图2)。PI法显示：CH-11浓度150ng/ml时，RPMI8226细胞凋亡率为23%，而RPMI8226/DOX40细胞凋亡率为12%。
三、CD95的蛋白表达
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Western Blotting测定蛋白质的表达是一种较敏感的方法。RPMI8226细胞在用DOX处理前后，其CD95的表达均明显高于RPMI8226/DOX40细胞，同时发现，DOX能诱导CD95蛋白的表达增加。
图1 CD95抗原在RPMI8226细胞膜的表达，虚线为对照组。
a：RPMI8226敏感株细胞；b：RPMI8226/DOX40细胞。
图2 RPMI8226和RPMI8226/DOX40细胞与CH-11作用16小时，用MTT法测定细胞凋亡
讨论
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CD95是45KD的Ⅰ型膜蛋白，属于TNF受体家族成员，CD95配体(CD95L)是37KD的Ⅱ型膜蛋白，属于TNF和CD40配体家族成员[4]。CD95和CD95L抗原广泛表达于许多组织细胞和被激活的细胞表面[5，6]。当它们相互作用后，引发了靶细胞的程序性死亡(PCD)。凋亡作为一种调节机理广泛地存在体内，当这种调节失衡时，就会导致组织细胞功能丧失或组织过度增生。如肝癌细胞CD95表达缺失，肝癌细胞增生；桥本氏病，CD95高表达，导致甲状腺组织受损。
首先我们发现，RPMI8226细胞和其相应的耐药株RPMI8226/DOX40细胞，表面CD95抗原的表达不同，耐药株细胞表面CD95表达低于敏感株。TerryH[8]用RT-PCR的方法，比较RPMI8226细胞和其相应的低、中、高度耐药株RPMI8226/DOX1，DOX6和DOX40的CD95mRNA，其中RPMI8226/DOX6和RPMI8226/DOX40中CD95明显低于RPMI8226细胞，因此耐药细胞表面和CD95L结合的机会也低于敏感株，为耐药株生存提供了有利的条件。
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DOX对肿瘤细胞的作用如何呢?根据DOX在病人体内血药浓度为0.001μg/ml～0.02μg/ml，我们选用DOX浓度为0.001μg/ml～0.05μg/ml。Friesen认为，当药物浓度在1～10μg/ml时，细胞死亡时不伴有典型的DNA节段性断裂的现象[7]，也就是说非凋亡所致。用Western Blotting方法发现：DOX能诱导敏感株细胞CD95基因的表达增加，耐药株细胞则相反，经DOX处理后CD95的表达无任何变化。Friesen等[7]报道了阿霉素(DOX)能触发CEM和Jurkat细胞CD95LmRNA的增加，引发肿瘤细胞的凋亡。当CD95单抗CH-11和RPMI8226作用测定其死亡率(MTT法)，发现CH-11引起细胞的死亡和其浓度成正比，耐药细胞拮抗CH-11的杀伤作用。所以CH-11和细胞表面CD95抗原的结合，触发细胞凋亡。CD95/CD95L系统已公认是调节细胞程序性死亡的关键因素，Friesen和Martina[9]均认为DOX等化疗药物引起细胞死亡是通过CD95/CD95L途径，用抑制性CD95单抗F(ab′)-anti-ApoI能阻断DOX所引起的细胞凋亡。我们认为对DOX耐药的细胞，可以通过改变CD95/CD95L来拮抗DOX所致的凋亡。■
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参考文献：
[1]Ueda K.The mdrI gene responsible for multi-drug resistance，codes for Pglycoprotein.Biochem Biophys Res Commun，1986，141：956
[2]Diane H，Hans D,Randolph J,et al.The role of CD40 and its Ligand in the regulation of the immune response.Immunological Reviews，1994，138：23
[3]Robert J.Tumor cell survival and resistance to therapy.Current Opinion in Hematology，1996，3：279
, 百拇医药
[4]Hans J.Tumor necrosis factor ligand superfamily involvement in the pathology of malignant lymphomas.Blood，1995，12：3378
[5]Nishimura Y,Ishii A,Kobayashi Y et al.Expression and function of mouse Fas antigen on immature and mature T cells.J Immunol，1995，154：4395
[6]Kagi D，Vignaux Y,Ledermann B,et al.Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell mediated cytotoxicity.Science，1994，265：528(Wash DC)
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[7]Friesen C,Ingrid H,Peter H,et al.Involvement of the CD95 receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cell.Nature Medicine，1996，5：547
[8]Terry H,Mary C.Selection for drug resistance results in resistance to Fas-mediated apoptosis.Blood，1997，6：1854
[9]Martina M,Susanne S,Hubert H,et al.Drug-induced apoptosis in hepatoma cells is mediated by the CD95 receptor/liganel system and involves activation of wild-type p53.J Clin Invest，1997，3：403.
收稿日期：1999-03-02
修稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com