套式聚合酶链反应诊断沙眼衣原体感染性小婴儿肺炎
作者：吕剑平
单位：吕剑平(镇江医学院附属医院儿科 江苏 212001)
关键词：
医学新知杂志000119 近几年来，沙眼衣原体(CT)感染所致婴儿肺炎已逐步为人们所认识。运用聚合酶链反应直接法(单式PCR)检测CT的有关文献报道日益增多。我们于1997年1月～1997年9月对50例支气管肺炎患儿应用套式聚合酶链反应(套式PCR)方法检测CT并与对照组及单式PCR方法进行了对比，现报道如下。
1 对象和方法
1.1 对象 肺炎组为符合肺炎诊断标准[1]的患儿50例，其中男30例，女20例，年龄2周～3个月。对照组为同期住院的非感染性疾病患儿30例，其中男20例，女10例，年龄2周～3个月。
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1.2 方法
1.2.1 标本采集 在患儿入院2周内采集咽拭子标本。用干棉签紧贴咽峡部卷搽，然后置于含1 ml生理盐水的试管中振荡洗涤、挤干，标本立即送儿科实验室处理或置于4℃冰箱待查。
1.2.2 试剂盒来源 单式PCR试剂由上海复华生物技术中心提供，套式PCR由无锡克隆遗传技术研究所提供。
1.2.3 操作方法 使用美国PE公司生产的基因扩增仪。单、套式均完全按照说明书操作。单式PCR为一次扩增，套式PCR为二次扩增。其扩增产物分别取10μl与1μl溴酚蓝混匀，用2%的琼脂凝胶(含0.5%的溴乙锭)经TAE电泳30 min，在紫外光下出现210 bd荧光带为单式PCR-CT阳性，出现405 bd荧光带为套式PCR-CT阳性。
2 结果
2.1 CT-DNA检出情况 50例患儿分别进行单式和套式PCR检测(见表1)，其CT-DNA阳性检出率单式PCR和套式PCR分别是14%(7/50)和30%(15/50)，两者比较，经χ2 检验，差异有显著性(P<0.05)。对照组仅进行套式PCR 检测，其CT-DNA 阳性检出率为10%(3/30)，与肺炎组的套式阳性检出率30%(15/50)比较，差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 单式和套式PCR检测小婴儿肺炎CT感染结果 单式PCR
套 式 PCR
合 计
+
-
+
7
1
8
-
8
34
42
, 百拇医药
合计
15
35
50
2.2 CT-DNA阳性患儿与临床诊断的符合程度 CT-DNA阳性患儿的临床症状和体征均符合CT感染所致婴儿肺炎的临床诊断，如起病缓慢，初期有鼻塞、流涕，继而有阵发性咳嗽常伴气促；有拒奶、呕吐和腹泻现象；除2例有低热外，大多数不发热；肺部听诊，吸气末可闻及中小湿口 罗音；并经红霉素治疗均痊愈出院。
3 讨论
CT是一种专性细胞内寄生菌， 在当今世界上性传播疾病中居首位，它是通过围产期感染引发小婴儿肺炎的主要病原菌之一。据文献报道1/4的6个月以内下呼吸道感染住院患儿中有3/4婴儿无热性肺炎系CT引起[2]。本研究所示咽拭CT-DNA套式阳性率30%，与有关资料相符[3]。其母婴间感染的主要途径为：宫内感染、产道感染、产褥期感染，多数为产道感染，宫颈CT培养阳性的孕妇，经阴道分娩者中有23%～70%将传染给新生儿，吴仕孝等[3]首次从DNA测序分子水平证实母婴间垂直传染CT。生产时CT可直接定植于鼻咽部，以后下行至肺部引起肺炎，也可由感染结膜经鼻咽管下行鼻咽部再到下呼吸道。
, 百拇医药
CT肺炎多见于6个月以内的小婴儿，大多起病缓慢，病程较长，一般情况尚好，可有鼻塞等上呼吸道感染症状，主要表现为呼吸增快和特征性的阵发性咳嗽，有时以阵发性咳嗽为唯一线索。肺部体征和X线胸片均无特征性，故实验室诊断十分重要。
常用的实验诊断方法有分离培养法、DNA探针法和抗原、抗体检测等，灵敏度均不高[5]。而PCR的原理类似于DNA的体内复制过程，是快速体外基因扩增新技术，仅需4～5 h即可检出标本中1.57×10-15g的CT-DNA，具有简便、迅速、微量和特异性强等特点。但我们发现有时阳性率不太高，还有假阳性发生，这可能与在实际中标本受到各种影响PCR扩增的干扰因素有关，如各种蛋白、重金属离子，甚至DNA酶、RNA酶等。
目前，我们应用的等基因特异的套式PCR由于应用内外两套四条引物进行二次扩增放大信息识别靶基因，如果因为第一次扩增发生错配，出现非特异性扩增，第二次扩增只取其产物的少许作为模板，以错误模板再行扩增的机率将很小，CT-DNA阳性检出率比较可靠，正如本研究结果所示，同单式PCR相比，套式PCR阳性检出率高(P<0.05)，特异性更强。
, 百拇医药
作者简介：吕剑平，男，33岁，主治医师；江苏，镇江医学院附属医院儿科(212001)
参考文献：
1 中华人民共和国卫生部. 小儿肺炎防治方案. 中华儿科杂志, 1987, 25(2):47
2 Bchrmn R E, Kliegman R M, Nelson W E, et al. Nelson textbook of pediatrics.14th eds. Philadephia:Sunders, 1992. 767
3 吴仕孝, 沈 梨, 刘官信. 母婴垂直传播沙眼衣原体的聚合酶链反应及测序研究. 中华儿科杂志, 1997, 35(6):283
4 秦 玲, 糜祖皇. 沙眼衣原体感染及其诊治. 中国优生与遗传杂志, 1995, 3(1):140
收稿日期：1999-06-01, 百拇医药
单位：吕剑平(镇江医学院附属医院儿科 江苏 212001)
关键词：
医学新知杂志000119 近几年来，沙眼衣原体(CT)感染所致婴儿肺炎已逐步为人们所认识。运用聚合酶链反应直接法(单式PCR)检测CT的有关文献报道日益增多。我们于1997年1月～1997年9月对50例支气管肺炎患儿应用套式聚合酶链反应(套式PCR)方法检测CT并与对照组及单式PCR方法进行了对比，现报道如下。
1 对象和方法
1.1 对象 肺炎组为符合肺炎诊断标准[1]的患儿50例，其中男30例，女20例，年龄2周～3个月。对照组为同期住院的非感染性疾病患儿30例，其中男20例，女10例，年龄2周～3个月。
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1.2 方法
1.2.1 标本采集 在患儿入院2周内采集咽拭子标本。用干棉签紧贴咽峡部卷搽，然后置于含1 ml生理盐水的试管中振荡洗涤、挤干，标本立即送儿科实验室处理或置于4℃冰箱待查。
1.2.2 试剂盒来源 单式PCR试剂由上海复华生物技术中心提供，套式PCR由无锡克隆遗传技术研究所提供。
1.2.3 操作方法 使用美国PE公司生产的基因扩增仪。单、套式均完全按照说明书操作。单式PCR为一次扩增，套式PCR为二次扩增。其扩增产物分别取10μl与1μl溴酚蓝混匀，用2%的琼脂凝胶(含0.5%的溴乙锭)经TAE电泳30 min，在紫外光下出现210 bd荧光带为单式PCR-CT阳性，出现405 bd荧光带为套式PCR-CT阳性。
2 结果
2.1 CT-DNA检出情况 50例患儿分别进行单式和套式PCR检测(见表1)，其CT-DNA阳性检出率单式PCR和套式PCR分别是14%(7/50)和30%(15/50)，两者比较，经χ2 检验，差异有显著性(P<0.05)。对照组仅进行套式PCR 检测，其CT-DNA 阳性检出率为10%(3/30)，与肺炎组的套式阳性检出率30%(15/50)比较，差异有显著性(P<0.05)。
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表1 单式和套式PCR检测小婴儿肺炎CT感染结果 单式PCR
套 式 PCR
合 计
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7
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42
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合计
15
35
50
2.2 CT-DNA阳性患儿与临床诊断的符合程度 CT-DNA阳性患儿的临床症状和体征均符合CT感染所致婴儿肺炎的临床诊断，如起病缓慢，初期有鼻塞、流涕，继而有阵发性咳嗽常伴气促；有拒奶、呕吐和腹泻现象；除2例有低热外，大多数不发热；肺部听诊，吸气末可闻及中小湿口 罗音；并经红霉素治疗均痊愈出院。
3 讨论
CT是一种专性细胞内寄生菌， 在当今世界上性传播疾病中居首位，它是通过围产期感染引发小婴儿肺炎的主要病原菌之一。据文献报道1/4的6个月以内下呼吸道感染住院患儿中有3/4婴儿无热性肺炎系CT引起[2]。本研究所示咽拭CT-DNA套式阳性率30%，与有关资料相符[3]。其母婴间感染的主要途径为：宫内感染、产道感染、产褥期感染，多数为产道感染，宫颈CT培养阳性的孕妇，经阴道分娩者中有23%～70%将传染给新生儿，吴仕孝等[3]首次从DNA测序分子水平证实母婴间垂直传染CT。生产时CT可直接定植于鼻咽部，以后下行至肺部引起肺炎，也可由感染结膜经鼻咽管下行鼻咽部再到下呼吸道。
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CT肺炎多见于6个月以内的小婴儿，大多起病缓慢，病程较长，一般情况尚好，可有鼻塞等上呼吸道感染症状，主要表现为呼吸增快和特征性的阵发性咳嗽，有时以阵发性咳嗽为唯一线索。肺部体征和X线胸片均无特征性，故实验室诊断十分重要。
常用的实验诊断方法有分离培养法、DNA探针法和抗原、抗体检测等，灵敏度均不高[5]。而PCR的原理类似于DNA的体内复制过程，是快速体外基因扩增新技术，仅需4～5 h即可检出标本中1.57×10-15g的CT-DNA，具有简便、迅速、微量和特异性强等特点。但我们发现有时阳性率不太高，还有假阳性发生，这可能与在实际中标本受到各种影响PCR扩增的干扰因素有关，如各种蛋白、重金属离子，甚至DNA酶、RNA酶等。
目前，我们应用的等基因特异的套式PCR由于应用内外两套四条引物进行二次扩增放大信息识别靶基因，如果因为第一次扩增发生错配，出现非特异性扩增，第二次扩增只取其产物的少许作为模板，以错误模板再行扩增的机率将很小，CT-DNA阳性检出率比较可靠，正如本研究结果所示，同单式PCR相比，套式PCR阳性检出率高(P<0.05)，特异性更强。
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作者简介：吕剑平，男，33岁，主治医师；江苏，镇江医学院附属医院儿科(212001)
参考文献：
1 中华人民共和国卫生部. 小儿肺炎防治方案. 中华儿科杂志, 1987, 25(2):47
2 Bchrmn R E, Kliegman R M, Nelson W E, et al. Nelson textbook of pediatrics.14th eds. Philadephia:Sunders, 1992. 767
3 吴仕孝, 沈 梨, 刘官信. 母婴垂直传播沙眼衣原体的聚合酶链反应及测序研究. 中华儿科杂志, 1997, 35(6):283
4 秦 玲, 糜祖皇. 沙眼衣原体感染及其诊治. 中国优生与遗传杂志, 1995, 3(1):140
收稿日期：1999-06-01, 百拇医药