结肠早癌自体荧光内镜诊断系统研究Ⅰ.结肠组织显微自体荧光图像分析
作者：杨川 唐贵林 张阳德 刘蔚东 万小平 李年丰 王渊景
单位：杨川(湖南医科大学第二附属医院病理科)；唐贵林(国防科技大学)；张阳德 刘蔚东 万小平 李年丰 王渊景(卫生部肝胆肠外科研究中心 长沙 410008)
关键词：显微自体荧光图像；结肠癌；早期诊断
中国内镜杂志000101 目的：探讨结肠正常组织和腺癌组织的显微自体荧光图像差异与肠壁不同结构层次的荧光强度差异。方法：采用共聚焦显微自体荧光图像系统采集与分析结肠正常和腺癌组织的自体荧光图像。结果：结肠正常组织自体荧光图像能清楚显示肠壁的三层结构，自体荧光主要来自于细胞间质和粘膜下层，上皮细胞的荧光强度很弱；腺癌组织的肠壁结构发生明显改变，荧光强度主要来自于粘膜下层；腺癌组织的显微自体荧光强度显著低于正常组织(P<0.05)，表明自体荧光分析法用于大肠癌的诊断是一个可行的方法。
, 百拇医药
分类号 R735
A STUDY ON AUTOFLUORESCENCE ENDOSCOPIC
DIAGNOSTIC SYSTEM FOR EARLY COLONIC CANCER
Ⅰ. MICROSCOPIC AUTOFLUORESCENCE IMAGING OF COLONIC TISSUES
Zhang Yangde, Liu Weidong, Wan Xiaoping
(National Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center,Ministry of Health, Affiliated Xiangya Hospital of
, http://www.100md.com
Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410008)
Abstract To investigate the difference of microscopic autofluorescence imaging of normal and adenocarcinoma colonic tissue, and the autofluorescence intensity difference among the colonic tissue layers. The microscopic autofluorescence in normal colonic tissues could be divided clearly into mucosa layer, submucosa layer and muscular layer. The major fluorophores in normal colon were located in the muscularis mucosa and submucosa layers, the intensity of epithelial cells was very weak. The tissue composition of the adenocarcinoma changes and the major fluorophores were located in the submucosa layers. The autofluorescence intensity of adenocarcinoma colon also decreased significantly compared with normal mucosa(P<0.05). The significant differences in histological structures and microscopic fluorescence between normal and adenocarcinoma colonic tissues suggest that autofluorescence technique is a powerful means for early diagnosis of diseased colonic tissues.
, http://www.100md.com
Key Words: Microscopic Autofluorescence Imaging; Colonic Cancer; Early Diagnosis
近年来，国际上利用自体荧光光谱分析法来诊断消化道癌的研究日趋活跃。文献报告，结肠组织在正常、腺瘤和癌变状况下的荧光光谱特征存在差异，正常组织的自体荧光强度高于癌组织[1～3]。但尚未见有关结肠正常和癌变组织显微自体荧光图像差异比较和不同结构层次荧光差异的研究报告。本研究采用共聚焦显微自体荧光图像系统研究了结肠正常和腺癌组织的显微自体荧光图像特征及荧光素在肠壁不同结构层次的空间分布。
1 材料与方法
1.1 实验设计
在光学显微镜下确定癌和正常组织块的粘膜层、粘膜下层和肌层，并录相，然后用共聚焦显微自体荧光检测系统(图1)检测对应区域的自体荧光图像，再进行结构比较，确定自体荧光图像的组织学基础。并选取包括粘膜、粘膜下层和肌层的视野测量各层的自体荧光强度，各层随机取三个区域测量，取其平均强度，比较正常与腺癌组织三层结构的荧光强度差异。
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1.2 标本准备
外科手术切下的15例大肠腺癌肠管，在癌灶和肠管残端(距离癌灶最远侧一端，视为正常组织，并通过病检证实)切取组织块，在离体30min内速冻于液氮中。实验时常温下解冻，在恒愠冰冻切片机(-20℃)内切成6μm厚，垂直于粘膜表面横切，以使每一切片块包括粘膜、粘膜下层、肌层，不进行染色和固定等处理，组织薄片置于经去污、去蛋白处理的玻片上，不加盖玻片。然后迅速将玻片放置于共聚焦显微自体荧光图像系统中检测。同时，取相邻的切片作HE染色进行常规组织学检查，确定癌块的病理类型和肠管残端是否是正常组织。
图1 显微自体荧光图像系统
1.3 自体荧光激发与收集
由25mW氩离子激光器在488nm波长激发，收集波长大于515nm的自体荧光，经Confocal 4.02系统分析。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
配对t检验
2 结果
通过比较同一视野的普通光学图像和自体荧光图像，在正常组织自体荧光图像中能清楚显示结肠壁的三层结构，粘膜、粘膜下层和肌层，其荧光主要来自于细胞间质和粘膜下层，上皮细胞的荧光强度很弱(图2-A)。而在腺癌组织，组织学结构发生明显改变，荧光主要来源于粘膜下层(图2-B)。粘膜层细胞间质的自体荧光平均强度正常组织为135.4，腺癌组织为46.3，二者存在显著差异(P<0.05)；腺上皮细胞自体荧光平均强度正常组织为4.9，腺癌组织为5.1，二者无显著差异(P>0.05)。粘膜下自体荧光强度亦较强，正常组织平均为118.2，腺癌组织为53.5，二者存在显著差异(P<0.05)。肌层的荧光强度较弱，正常组织平均为18.6，腺癌组织为17.9，二者无显著差异(P>0.05)。而且，自体荧光图像能清楚显示血管，血管壁有很强的自体荧光；炎性细胞的自体荧光强度亦很强。
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图2 大肠组织显微自体荧光图像
1 粘膜层 2 粘膜下层 3 肌层
3 讨论
自体荧光光谱分析以其极高的光谱分辨率、灵敏度、精确度以及无损、安全、快速等优点而成为医学光子学的主要研究领域。随着激光光谱技术在医学领域应用研究的深入开展，一门有发展潜力和应用前景的“医学光谱学”逐渐形成，其中最受关注的是研究生物组织的自体荧光与药物荧光光谱。人们已对激光诱导生物组织自体荧光诊断进行了临床前研究，发现结肠正常组织的荧光强度在特定波长段高出癌组织约4～6倍[4，5]。
生物组织包含十分复杂的分子成份，激光诱导的组织荧光光谱也相当复杂。深入了解生物组织的荧光物质及其自体荧光特征，是处理荧光光谱数据、得到其中隐含的特异性变化的前提之一。本研究通过比较结肠正常组织和腺癌组织的显微荧光图像，发现两者的显微自体荧光特征存在明显差异，正常组织的显微自体荧光强度明显高于腺癌组织(P<0.05)，也表明正常组织和癌组织的生化环境已发生显著改变。生物组织内的化合物能发出其特定的荧光信号，良性组织和恶性组织(包括癌前期病变)的生化特性不同，对应的自体荧光光谱也存在特异性差异，这种特异性差别反映了病变组织的特异性，这是自体荧光能早期区别良性与恶性组织的基础。然而，肠壁组织是一个多成份、多形态的复杂有机体，自体荧光诱导产生后，在辐射过程中被生物组织吸收和发生散射，收集观察到的荧光已发生了复杂的变化。另外，激发光穿透肠壁组织，也受到肠壁形态结构、理化状态的影响。不同的肠粘膜厚度、形态对吸收激发光的能力有差别，诱导产生的荧光也必然不同。肠壁组织能吸收激发光或荧光物质所发射的荧光，减少观察到的荧光，即所谓“内滤光效应”。观察到的生物组织自体荧光是经过了“内滤光效应”之后的荧光，是生物组织生化、形态结构的整体反映。研究组织的形态结构与观察到荧光光谱的关系，有利于进一步明确荧光光谱的本质特征，指导处理获得的荧光光谱数据，建立能提高自体荧光诊断分化不良组织(癌组织和癌前病变)敏感性和特异性的数学模型，以利于计算机处理，实现实时光学活检，是自体荧光光谱技术应用于临床的关键。
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本研究采用共聚焦显微自体荧光图像分析，证实结肠组织显微自体荧光的荧光素主要位于细胞间质和粘膜下层，正常组织和腺癌组织的显微自体荧光图像存在显著差异，表明自体荧光分析法用于大肠癌的诊断是一个可行的方法。
参 考 文 献
1，Schomacker KT, Frisoli JK, Compton CC,et al. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: Basic biology and diagnostic potential. Lasers Surg Med， 1992;12:63～78
2，Romer TJ, Fitamaurice M, Cothren RM， et al. Laser-induced fluorescence microscopy of normal colon and dysplasia in colonic adenomas: Implications for spectroscopic diagnosis. Am J Gastroentero 1995;90:81～87
, 百拇医药
3，Huang ZW, Chia TC, Zheng W,et al. Changes in autofluorescence emission intensities of human colonic tissues due to photobleaching process. SPIE 1998;3568:11～18
4，Hung J, Lam S, Leriche JC et al. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue. Lasers Surg Med 1991;11:99
5，Bessler M, Yang Y, Tang GC et al. Fluorescence spectroscopy colon cancer versus normal mucose. Gastrointest Endoscopy 1994;40:91
(1999-10-12收稿), http://www.100md.com
单位：杨川(湖南医科大学第二附属医院病理科)；唐贵林(国防科技大学)；张阳德 刘蔚东 万小平 李年丰 王渊景(卫生部肝胆肠外科研究中心 长沙 410008)
关键词：显微自体荧光图像；结肠癌；早期诊断
中国内镜杂志000101 目的：探讨结肠正常组织和腺癌组织的显微自体荧光图像差异与肠壁不同结构层次的荧光强度差异。方法：采用共聚焦显微自体荧光图像系统采集与分析结肠正常和腺癌组织的自体荧光图像。结果：结肠正常组织自体荧光图像能清楚显示肠壁的三层结构，自体荧光主要来自于细胞间质和粘膜下层，上皮细胞的荧光强度很弱；腺癌组织的肠壁结构发生明显改变，荧光强度主要来自于粘膜下层；腺癌组织的显微自体荧光强度显著低于正常组织(P<0.05)，表明自体荧光分析法用于大肠癌的诊断是一个可行的方法。
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分类号 R735
A STUDY ON AUTOFLUORESCENCE ENDOSCOPIC
DIAGNOSTIC SYSTEM FOR EARLY COLONIC CANCER
Ⅰ. MICROSCOPIC AUTOFLUORESCENCE IMAGING OF COLONIC TISSUES
Zhang Yangde, Liu Weidong, Wan Xiaoping
(National Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center,Ministry of Health, Affiliated Xiangya Hospital of
, http://www.100md.com
Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410008)
Abstract To investigate the difference of microscopic autofluorescence imaging of normal and adenocarcinoma colonic tissue, and the autofluorescence intensity difference among the colonic tissue layers. The microscopic autofluorescence in normal colonic tissues could be divided clearly into mucosa layer, submucosa layer and muscular layer. The major fluorophores in normal colon were located in the muscularis mucosa and submucosa layers, the intensity of epithelial cells was very weak. The tissue composition of the adenocarcinoma changes and the major fluorophores were located in the submucosa layers. The autofluorescence intensity of adenocarcinoma colon also decreased significantly compared with normal mucosa(P<0.05). The significant differences in histological structures and microscopic fluorescence between normal and adenocarcinoma colonic tissues suggest that autofluorescence technique is a powerful means for early diagnosis of diseased colonic tissues.
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Key Words: Microscopic Autofluorescence Imaging; Colonic Cancer; Early Diagnosis
近年来，国际上利用自体荧光光谱分析法来诊断消化道癌的研究日趋活跃。文献报告，结肠组织在正常、腺瘤和癌变状况下的荧光光谱特征存在差异，正常组织的自体荧光强度高于癌组织[1～3]。但尚未见有关结肠正常和癌变组织显微自体荧光图像差异比较和不同结构层次荧光差异的研究报告。本研究采用共聚焦显微自体荧光图像系统研究了结肠正常和腺癌组织的显微自体荧光图像特征及荧光素在肠壁不同结构层次的空间分布。
1 材料与方法
1.1 实验设计
在光学显微镜下确定癌和正常组织块的粘膜层、粘膜下层和肌层，并录相，然后用共聚焦显微自体荧光检测系统(图1)检测对应区域的自体荧光图像，再进行结构比较，确定自体荧光图像的组织学基础。并选取包括粘膜、粘膜下层和肌层的视野测量各层的自体荧光强度，各层随机取三个区域测量，取其平均强度，比较正常与腺癌组织三层结构的荧光强度差异。
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1.2 标本准备
外科手术切下的15例大肠腺癌肠管，在癌灶和肠管残端(距离癌灶最远侧一端，视为正常组织，并通过病检证实)切取组织块，在离体30min内速冻于液氮中。实验时常温下解冻，在恒愠冰冻切片机(-20℃)内切成6μm厚，垂直于粘膜表面横切，以使每一切片块包括粘膜、粘膜下层、肌层，不进行染色和固定等处理，组织薄片置于经去污、去蛋白处理的玻片上，不加盖玻片。然后迅速将玻片放置于共聚焦显微自体荧光图像系统中检测。同时，取相邻的切片作HE染色进行常规组织学检查，确定癌块的病理类型和肠管残端是否是正常组织。
图1 显微自体荧光图像系统
1.3 自体荧光激发与收集
由25mW氩离子激光器在488nm波长激发，收集波长大于515nm的自体荧光，经Confocal 4.02系统分析。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
配对t检验
2 结果
通过比较同一视野的普通光学图像和自体荧光图像，在正常组织自体荧光图像中能清楚显示结肠壁的三层结构，粘膜、粘膜下层和肌层，其荧光主要来自于细胞间质和粘膜下层，上皮细胞的荧光强度很弱(图2-A)。而在腺癌组织，组织学结构发生明显改变，荧光主要来源于粘膜下层(图2-B)。粘膜层细胞间质的自体荧光平均强度正常组织为135.4，腺癌组织为46.3，二者存在显著差异(P<0.05)；腺上皮细胞自体荧光平均强度正常组织为4.9，腺癌组织为5.1，二者无显著差异(P>0.05)。粘膜下自体荧光强度亦较强，正常组织平均为118.2，腺癌组织为53.5，二者存在显著差异(P<0.05)。肌层的荧光强度较弱，正常组织平均为18.6，腺癌组织为17.9，二者无显著差异(P>0.05)。而且，自体荧光图像能清楚显示血管，血管壁有很强的自体荧光；炎性细胞的自体荧光强度亦很强。
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图2 大肠组织显微自体荧光图像
1 粘膜层 2 粘膜下层 3 肌层
3 讨论
自体荧光光谱分析以其极高的光谱分辨率、灵敏度、精确度以及无损、安全、快速等优点而成为医学光子学的主要研究领域。随着激光光谱技术在医学领域应用研究的深入开展，一门有发展潜力和应用前景的“医学光谱学”逐渐形成，其中最受关注的是研究生物组织的自体荧光与药物荧光光谱。人们已对激光诱导生物组织自体荧光诊断进行了临床前研究，发现结肠正常组织的荧光强度在特定波长段高出癌组织约4～6倍[4，5]。
生物组织包含十分复杂的分子成份，激光诱导的组织荧光光谱也相当复杂。深入了解生物组织的荧光物质及其自体荧光特征，是处理荧光光谱数据、得到其中隐含的特异性变化的前提之一。本研究通过比较结肠正常组织和腺癌组织的显微荧光图像，发现两者的显微自体荧光特征存在明显差异，正常组织的显微自体荧光强度明显高于腺癌组织(P<0.05)，也表明正常组织和癌组织的生化环境已发生显著改变。生物组织内的化合物能发出其特定的荧光信号，良性组织和恶性组织(包括癌前期病变)的生化特性不同，对应的自体荧光光谱也存在特异性差异，这种特异性差别反映了病变组织的特异性，这是自体荧光能早期区别良性与恶性组织的基础。然而，肠壁组织是一个多成份、多形态的复杂有机体，自体荧光诱导产生后，在辐射过程中被生物组织吸收和发生散射，收集观察到的荧光已发生了复杂的变化。另外，激发光穿透肠壁组织，也受到肠壁形态结构、理化状态的影响。不同的肠粘膜厚度、形态对吸收激发光的能力有差别，诱导产生的荧光也必然不同。肠壁组织能吸收激发光或荧光物质所发射的荧光，减少观察到的荧光，即所谓“内滤光效应”。观察到的生物组织自体荧光是经过了“内滤光效应”之后的荧光，是生物组织生化、形态结构的整体反映。研究组织的形态结构与观察到荧光光谱的关系，有利于进一步明确荧光光谱的本质特征，指导处理获得的荧光光谱数据，建立能提高自体荧光诊断分化不良组织(癌组织和癌前病变)敏感性和特异性的数学模型，以利于计算机处理，实现实时光学活检，是自体荧光光谱技术应用于临床的关键。
, 百拇医药
本研究采用共聚焦显微自体荧光图像分析，证实结肠组织显微自体荧光的荧光素主要位于细胞间质和粘膜下层，正常组织和腺癌组织的显微自体荧光图像存在显著差异，表明自体荧光分析法用于大肠癌的诊断是一个可行的方法。
参 考 文 献
1，Schomacker KT, Frisoli JK, Compton CC,et al. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: Basic biology and diagnostic potential. Lasers Surg Med， 1992;12:63～78
2，Romer TJ, Fitamaurice M, Cothren RM， et al. Laser-induced fluorescence microscopy of normal colon and dysplasia in colonic adenomas: Implications for spectroscopic diagnosis. Am J Gastroentero 1995;90:81～87
, 百拇医药
3，Huang ZW, Chia TC, Zheng W,et al. Changes in autofluorescence emission intensities of human colonic tissues due to photobleaching process. SPIE 1998;3568:11～18
4，Hung J, Lam S, Leriche JC et al. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue. Lasers Surg Med 1991;11:99
5，Bessler M, Yang Y, Tang GC et al. Fluorescence spectroscopy colon cancer versus normal mucose. Gastrointest Endoscopy 1994;40:91
(1999-10-12收稿), http://www.100md.com