大鼠蛛网膜下腔出血后急性脑血管痉挛血及脑组织一氧化氮和内皮素含量的动态观察
作者：孙保亮 夏作理 杨明峰 高美常 邱平明
单位：泰山医学院附属医院老年病科，泰安 271000
关键词：蛛网膜下腔出血；脑血管痉挛；脑缺血；一氧化氮；内皮素
中国老年学杂志000121
摘 要 目的 探讨一氧化氮(NO)、内皮素(ET)在蛛网膜下腔出血(SAH)后急性脑血管痉挛(CVS)中的作用。方法 对SAH模型组和假手术组大鼠检测术后24 h内局部脑血流量(rCBF)、血浆及脑组织NO、ET含量的动态改变，并测量基底动脉(BA)管径，3 d后行海马组织病理检查。结果 SAH后24 h内rCBF迅速而持续降低，BA痉挛；3 d后海马CA1区神经元明显受损，血清NO明显减少，脑组织NO显著增多，血浆及脑组织ET明显增加。结论 血NO减少、ET增加在SAH后急性CVS发生中起重要作用；脑组织NO及ET增多加重急性CVS所致脑缺血性损伤。
, http://www.100md.com
Dynamic changes of nitric oxide and endothelin levels in blood and brain tissue during acute cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats
Sun Baoliang,Xia Zuoli,Yang Mingfeng et al
(Department of Geriatrics,Affiliated Hospital,Taishan Medical College,Taian 271000)
Abstraact：Objective To investigate the effect of nitric oxide(NO),endothelin(ET) on cerebral vasospasm(CVS) following subarbarachnoid hemorrhage(SAH).Methods Rats were divided into sham-operated group and SAH group.Dynamic changes of regional cerebral blood flow(rCBF),NO and ET levels in both blood and brain tissue within 24 h after operation were observed.Diameter of basilar artery(BA) and pathological change of CA1 region of hippocampus were also examined.Results SAH caused obvious and persistent decrease of rCBF within 24 h.Spasm of BA occured 0.5 h after SAH.Neurons of hippocampus CA1 region were damaged severely 3 d after SAH.Serum NO levels decreased while brain NO levels increased.ET levels in both plasma and brain tissue increased.Conclusions Decrease of NO and increase of ET in blood are involved in the development of acute CVS after SAH.Increase of NO and ET in brain tissue contributes to brain damage due to CVS.
, 百拇医药
Key words Subarachnoid hemorrhage Cerebral vasospasm Brain ischemia Nitric oxide Endothelin
蛛网膜下腔出血(CVS)1 w后发生的迟发性脑血管痉挛(CVS)已得到广泛重视和研究。然而，在许多发生神经功能损伤的SAH病人，血管造影并未发现严重的迟发性CVS。急性CVS等因素所致早期的脑缺血可能为病人死亡和伤残的始动和重要原因之一〔1，2〕。一氧化氮(NO)和内皮素(ET)在脑血流调节中起重要作用，同时又有许多其他复杂作用〔3〕。本文利用大鼠SAH模型，探讨了SAH后急性CVS时血及脑组织NO、ET含量的动态变化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与分组 Wistar大鼠90只，雌雄不限，体重300～500 g，均分为SAH组(模型组)和假手术组。每组各取8只测量手术前后局部脑血流量(rCBF)，并于3 d后行海马病理检查；各5只测量手术前后基底动脉(BA)管径，各32只检测术后24 h内血浆及脑组织NO及ET含量动态改变。
, http://www.100md.com
1.1.2 主要仪器与试剂 玻璃纤维系日本Aatron 3号渔线，直径0.285 mm；激光多普勒血流仪(LDF)，pf2型，瑞典Perimed公司产品；721型分光光度计，上海申化仪表自控公司；微机多探头γ计数器，FT630 G型，北京核仪器厂；镉颗粒为北京57601化工厂产品，纯度99.99%；ET放免药合购于解放军总医院东亚免疫技术研究所；余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 参照Bederson等〔2〕非开颅方法刺破Willis环前部造成SAH。假手术对照组除不刺破Willis环外，余操作过程均同上。行右侧股动脉插管监测血压及血气指标。
1.2.2 rCBF及BA管径测量 于大鼠前囟后、中线旁左侧各3 mm处钻一直径2～3 mm小孔，将LDF探头垂直置放于硬脑膜测量rCBF。经斜坡开骨窗暴露BA全程，用显微镜测微尺及显微摄影方法测量BA 3个部位(椎基底动脉汇合处、BA脑桥中部和分叉处)直径，取均值。
, 百拇医药
1.2.3 海马组织病理检查 脑组织固定后常规制备海马组织切片，HE染色，对CA1区行光镜观察。
1.2.4 血清及脑组织NO测定 在各测定时间将动物快速断头取血1 ml。迅速分离海马及皮层，pH 7.4的PBS缓冲液制成10%(w/v)的匀浆液。采用铜离子活化镉还原法测定NO-2/NO-3浓度反映NO水平。
1.2.5 血浆及脑组织ET测定 动物处死后取血。在海马及皮层组织中加1 N醋酸(w/v=10%)，水浴中煮沸10 min后匀浆。用放免法测定ET含量。
1.2.6 统计学处理 采用配对或组间t检验。
2 结 果
假手术组大鼠颅脑解剖无异常发现，SAH模型动物均见有大量血液或血凝块分布于蛛网膜下腔，所有动物均无脑实质损伤。各组动物动脉血气无明显变化。模型组产生SAH后股动脉平均动脉压稍增高，1 h后恢复。
, http://www.100md.com
2.1 rCBF及BA管径 在实验过程中假手术组rCBF保持相对恒定。模型组术后rCBF立即降低，1 h达最低值(减少56.12%)，24 h内无恢复趋势(见表1)。由表2可见，假手术组手术前后BA管径未见明显变化，模型组于术后0.5 h BA明显收缩。
2.2 海马CA1区病理改变 在术后3 d，海马CA1区锥体细胞在假手术组保存良好，而在模型组则明显减少，且多深染、变暗或固缩。
2.3 血及脑组织NO、ET含量 由表3和表4可以看出，模型组于产生SAH后1 h血清NO含量明显低于假手术组，6 h
表1 假手术组和模型组rCBF变化(LDF单位，
±s，n=8) 组别
术前
, http://www.100md.com
术后
0 h
0.5 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
809.5±57.6
765.1±69.1
797.8±41.2
839.3±78.2
785.0±37.7
, http://www.100md.com
807.2±54.3
模型组
821.4±87.3
580.0±79.21)
443.6±40.21)
360.6±43.31)
430.2±57.21)
399.6±65.41)
与术前值或假手术组比较，1)P<0.01表2 假手术组及模型组手术前后BA管径观察(μm，±s) 组别
, 百拇医药
n
术前对照
术后0.5 h
假手术组
5
235.5±34.2
227.4±34.2
模型组
5
245.7±23.9
125.2±16.71)
与术前值或假手术组比较，1)P<0.01
, http://www.100md.com
达最低值，24 h仍维持于低水平。脑组织匀浆中NO含量于SAH后1 h迅速增加，24 h有恢复趋势，但仍较假手术组为高。
在模型组动物，血浆及脑组织ET含量分别于术后即刻及1 h开始增加，在观察的24 h内持续增高，峰值分别在6 h和24 h。见表4和表5。表3 假手术组和模型组血清、脑组织NO含量的变化(NO-2/NO-3，x±s,n=8) 组别
血清(μmol/L)
脑组织(nmol/L)
0 h
1 h
6 h
, http://www.100md.com 24 h
0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
71.56±10.83
67.92±9.54
66.72±8.76
69.94±12.17
0.290 4±0.046 3
0.272 5±0.033 7
, 百拇医药
0.307 2±0.038 3
0.280 6±0.049 2
模型组
61.36±15.83
44.51±10.531)
34.90±7.881)
39.14±10.481)
0.292 0±0.062 8
0.845 6±0.174 51)
1.118 5±0.285 41)
, 百拇医药
0.433 3±0.084 91)
与假手术组比较，1)P<0.01表4 假手术组和模型组血浆ET含量的变化
(pg/ml，±s，n＝8) 组别
0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
75.38±13.79
76.14±14.53
, 百拇医药
78.03±14.53
75.75±16.01
模型组
91.63±19.591)
244.38±44.692)
278.38±70.472)
242.75±62.312)
与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01表5 假手术组和模型组术后脑组织匀浆
ET含量的变化(pg/ml，±s，n＝8) 组别
, 百拇医药
0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
6.30±2.38
7.01±2.99
7.50±3.56
6.13±2.75
模型组
7.23±3.27
10.93±3.911)
, 百拇医药
17.61±5.192)
18.37±5.002)
与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨 论
本研究发现，SAH后早期BA痉挛，rCBF于24 h内明显下降，海马CA1区神经元明显受损。说明SAH后早期的脑缺血主要为急性CVS所致，并由此导致脑损伤。
血液中NO及ET均主要来源于血管内皮细胞。NO弥散至血管平滑肌细胞，激活其内可溶性鸟苷酸环化酶使cGMP含量增加，后者使细胞内游离Ca2+减少，并开放Ca2+依赖性钾通道，从而发挥舒张血管效应。ET与血管平滑肌细胞上的ET受体结合，通过细胞内储存Ca2+释放及细胞外Ca2+内流而引起血管收缩〔3〕。本研究表明，SAH后24 h内血液中NO明显减少，ET显著增加，由此导致急性CVS。血NO、ET异常变化的可能原因为〔3，4〕：(1)血管内皮细胞受损而NO合酶(NOS)活性下降，NO产量减少；(2)红细胞释放的氧合血红蛋白及其代谢产生的自由基使NO灭活，并可刺激ET产生；(3)出血刺激及其他缩血管物质的释放以及血NO减少，可促使内皮细胞ET mRNA表达。
, http://www.100md.com
NO本身是一种典型的自由基。Sato等〔5〕发现在颈动脉结扎大鼠缺血性脑组织中NO显著增加。许多研究表明脑组织缺血灶中ET含量亦增多。本实验发现在SAH后急性CVS时脑组织NO、ET含量均显著增加。这可能与缺血缺氧诱导神经元和胶质细胞NOS活性增强及ET基因表达增加有关。脑组织中高浓度NO可介导谷氨酸神经毒性作用，抑制线粒体呼吸，以及形成过量羟自由基造成脂质过氧化损伤。而ET可促进谷氨酸等兴奋性氨基酸释放，并通过激活磷脂酶C和间接开放电压依赖性Ca2+通道，使神经细胞Ca2+超负荷〔6〕。上述变化可加重SAH后急性CVS造成的缺血性神经细胞损伤，促进神经功能缺损的发生。
作者简介：孙保亮，男，36岁，副教授，硕士，研究方向：脑血管病的防治
参考文献
1，McCormic PW,McCOrmic J,Zabramski MB et al.Hemodynamics of subarachnoid hemorrhage arrest.J Neurosurg，1994；80：710
, http://www.100md.com
2，Bederson JB,Germano M,Guarino L.Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in rats.Stroke，1995；26(6)：1 087
3，Zimmermann M,Seifert V,Loffler BM.Prevention of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage by RO470203,a newly developed orally active endothelin receptor antagonist.Neurosurgery，1996；38：115
4，Kasuya H,Weir BKA,Nakane M et al.Nitric oxide synthase and guanylate cyclase levels in canine basilar artery after subarachnoid hemorrhage.Neurosurgery，1995；82：250
, 百拇医药
5，Sato S,Tominage T,Ohnishi T et al.EPR spin-trapping study of nitic oxide formation during bilateral caortid occlusion in the rat.Biochem Biophys Acta，1993；1181：195
6，Ziv I,Heminger G,Dyaldetti R et al.Increasd plasma endothelin 1 in acute ischemic stroke.Stroke，1992；23：1014
收稿日期：1998-11-15
修回日期：1999-09-26, 百拇医药
单位：泰山医学院附属医院老年病科，泰安 271000
关键词：蛛网膜下腔出血；脑血管痉挛；脑缺血；一氧化氮；内皮素
中国老年学杂志000121
摘 要 目的 探讨一氧化氮(NO)、内皮素(ET)在蛛网膜下腔出血(SAH)后急性脑血管痉挛(CVS)中的作用。方法 对SAH模型组和假手术组大鼠检测术后24 h内局部脑血流量(rCBF)、血浆及脑组织NO、ET含量的动态改变，并测量基底动脉(BA)管径，3 d后行海马组织病理检查。结果 SAH后24 h内rCBF迅速而持续降低，BA痉挛；3 d后海马CA1区神经元明显受损，血清NO明显减少，脑组织NO显著增多，血浆及脑组织ET明显增加。结论 血NO减少、ET增加在SAH后急性CVS发生中起重要作用；脑组织NO及ET增多加重急性CVS所致脑缺血性损伤。
, http://www.100md.com
Dynamic changes of nitric oxide and endothelin levels in blood and brain tissue during acute cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats
Sun Baoliang,Xia Zuoli,Yang Mingfeng et al
(Department of Geriatrics,Affiliated Hospital,Taishan Medical College,Taian 271000)
Abstraact：Objective To investigate the effect of nitric oxide(NO),endothelin(ET) on cerebral vasospasm(CVS) following subarbarachnoid hemorrhage(SAH).Methods Rats were divided into sham-operated group and SAH group.Dynamic changes of regional cerebral blood flow(rCBF),NO and ET levels in both blood and brain tissue within 24 h after operation were observed.Diameter of basilar artery(BA) and pathological change of CA1 region of hippocampus were also examined.Results SAH caused obvious and persistent decrease of rCBF within 24 h.Spasm of BA occured 0.5 h after SAH.Neurons of hippocampus CA1 region were damaged severely 3 d after SAH.Serum NO levels decreased while brain NO levels increased.ET levels in both plasma and brain tissue increased.Conclusions Decrease of NO and increase of ET in blood are involved in the development of acute CVS after SAH.Increase of NO and ET in brain tissue contributes to brain damage due to CVS.
, 百拇医药
Key words Subarachnoid hemorrhage Cerebral vasospasm Brain ischemia Nitric oxide Endothelin
蛛网膜下腔出血(CVS)1 w后发生的迟发性脑血管痉挛(CVS)已得到广泛重视和研究。然而，在许多发生神经功能损伤的SAH病人，血管造影并未发现严重的迟发性CVS。急性CVS等因素所致早期的脑缺血可能为病人死亡和伤残的始动和重要原因之一〔1，2〕。一氧化氮(NO)和内皮素(ET)在脑血流调节中起重要作用，同时又有许多其他复杂作用〔3〕。本文利用大鼠SAH模型，探讨了SAH后急性CVS时血及脑组织NO、ET含量的动态变化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物与分组 Wistar大鼠90只，雌雄不限，体重300～500 g，均分为SAH组(模型组)和假手术组。每组各取8只测量手术前后局部脑血流量(rCBF)，并于3 d后行海马病理检查；各5只测量手术前后基底动脉(BA)管径，各32只检测术后24 h内血浆及脑组织NO及ET含量动态改变。
, http://www.100md.com
1.1.2 主要仪器与试剂 玻璃纤维系日本Aatron 3号渔线，直径0.285 mm；激光多普勒血流仪(LDF)，pf2型，瑞典Perimed公司产品；721型分光光度计，上海申化仪表自控公司；微机多探头γ计数器，FT630 G型，北京核仪器厂；镉颗粒为北京57601化工厂产品，纯度99.99%；ET放免药合购于解放军总医院东亚免疫技术研究所；余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 参照Bederson等〔2〕非开颅方法刺破Willis环前部造成SAH。假手术对照组除不刺破Willis环外，余操作过程均同上。行右侧股动脉插管监测血压及血气指标。
1.2.2 rCBF及BA管径测量 于大鼠前囟后、中线旁左侧各3 mm处钻一直径2～3 mm小孔，将LDF探头垂直置放于硬脑膜测量rCBF。经斜坡开骨窗暴露BA全程，用显微镜测微尺及显微摄影方法测量BA 3个部位(椎基底动脉汇合处、BA脑桥中部和分叉处)直径，取均值。
, 百拇医药
1.2.3 海马组织病理检查 脑组织固定后常规制备海马组织切片，HE染色，对CA1区行光镜观察。
1.2.4 血清及脑组织NO测定 在各测定时间将动物快速断头取血1 ml。迅速分离海马及皮层，pH 7.4的PBS缓冲液制成10%(w/v)的匀浆液。采用铜离子活化镉还原法测定NO-2/NO-3浓度反映NO水平。
1.2.5 血浆及脑组织ET测定 动物处死后取血。在海马及皮层组织中加1 N醋酸(w/v=10%)，水浴中煮沸10 min后匀浆。用放免法测定ET含量。
1.2.6 统计学处理 采用配对或组间t检验。
2 结 果
假手术组大鼠颅脑解剖无异常发现，SAH模型动物均见有大量血液或血凝块分布于蛛网膜下腔，所有动物均无脑实质损伤。各组动物动脉血气无明显变化。模型组产生SAH后股动脉平均动脉压稍增高，1 h后恢复。
, http://www.100md.com
2.1 rCBF及BA管径 在实验过程中假手术组rCBF保持相对恒定。模型组术后rCBF立即降低，1 h达最低值(减少56.12%)，24 h内无恢复趋势(见表1)。由表2可见，假手术组手术前后BA管径未见明显变化，模型组于术后0.5 h BA明显收缩。
2.2 海马CA1区病理改变 在术后3 d，海马CA1区锥体细胞在假手术组保存良好，而在模型组则明显减少，且多深染、变暗或固缩。
2.3 血及脑组织NO、ET含量 由表3和表4可以看出，模型组于产生SAH后1 h血清NO含量明显低于假手术组，6 h
表1 假手术组和模型组rCBF变化(LDF单位，
±s，n=8) 组别术前
, http://www.100md.com
术后
0 h
0.5 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
809.5±57.6
765.1±69.1
797.8±41.2
839.3±78.2
785.0±37.7
, http://www.100md.com
807.2±54.3
模型组
821.4±87.3
580.0±79.21)
443.6±40.21)
360.6±43.31)
430.2±57.21)
399.6±65.41)
与术前值或假手术组比较，1)P<0.01表2 假手术组及模型组手术前后BA管径观察(μm，
±s) 组别, 百拇医药
n
术前对照
术后0.5 h
假手术组
5
235.5±34.2
227.4±34.2
模型组
5
245.7±23.9
125.2±16.71)
与术前值或假手术组比较，1)P<0.01
, http://www.100md.com
达最低值，24 h仍维持于低水平。脑组织匀浆中NO含量于SAH后1 h迅速增加，24 h有恢复趋势，但仍较假手术组为高。
在模型组动物，血浆及脑组织ET含量分别于术后即刻及1 h开始增加，在观察的24 h内持续增高，峰值分别在6 h和24 h。见表4和表5。表3 假手术组和模型组血清、脑组织NO含量的变化(NO-2/NO-3，x±s,n=8) 组别
血清(μmol/L)
脑组织(nmol/L)
0 h
1 h
6 h
, http://www.100md.com 24 h
0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
71.56±10.83
67.92±9.54
66.72±8.76
69.94±12.17
0.290 4±0.046 3
0.272 5±0.033 7
, 百拇医药
0.307 2±0.038 3
0.280 6±0.049 2
模型组
61.36±15.83
44.51±10.531)
34.90±7.881)
39.14±10.481)
0.292 0±0.062 8
0.845 6±0.174 51)
1.118 5±0.285 41)
, 百拇医药
0.433 3±0.084 91)
与假手术组比较，1)P<0.01表4 假手术组和模型组血浆ET含量的变化
(pg/ml，
±s，n＝8) 组别0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
75.38±13.79
76.14±14.53
, 百拇医药
78.03±14.53
75.75±16.01
模型组
91.63±19.591)
244.38±44.692)
278.38±70.472)
242.75±62.312)
与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01表5 假手术组和模型组术后脑组织匀浆
ET含量的变化(pg/ml，
±s，n＝8) 组别, 百拇医药
0 h
1 h
6 h
24 h
假手术组
6.30±2.38
7.01±2.99
7.50±3.56
6.13±2.75
模型组
7.23±3.27
10.93±3.911)
, 百拇医药
17.61±5.192)
18.37±5.002)
与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨 论
本研究发现，SAH后早期BA痉挛，rCBF于24 h内明显下降，海马CA1区神经元明显受损。说明SAH后早期的脑缺血主要为急性CVS所致，并由此导致脑损伤。
血液中NO及ET均主要来源于血管内皮细胞。NO弥散至血管平滑肌细胞，激活其内可溶性鸟苷酸环化酶使cGMP含量增加，后者使细胞内游离Ca2+减少，并开放Ca2+依赖性钾通道，从而发挥舒张血管效应。ET与血管平滑肌细胞上的ET受体结合，通过细胞内储存Ca2+释放及细胞外Ca2+内流而引起血管收缩〔3〕。本研究表明，SAH后24 h内血液中NO明显减少，ET显著增加，由此导致急性CVS。血NO、ET异常变化的可能原因为〔3，4〕：(1)血管内皮细胞受损而NO合酶(NOS)活性下降，NO产量减少；(2)红细胞释放的氧合血红蛋白及其代谢产生的自由基使NO灭活，并可刺激ET产生；(3)出血刺激及其他缩血管物质的释放以及血NO减少，可促使内皮细胞ET mRNA表达。
, http://www.100md.com
NO本身是一种典型的自由基。Sato等〔5〕发现在颈动脉结扎大鼠缺血性脑组织中NO显著增加。许多研究表明脑组织缺血灶中ET含量亦增多。本实验发现在SAH后急性CVS时脑组织NO、ET含量均显著增加。这可能与缺血缺氧诱导神经元和胶质细胞NOS活性增强及ET基因表达增加有关。脑组织中高浓度NO可介导谷氨酸神经毒性作用，抑制线粒体呼吸，以及形成过量羟自由基造成脂质过氧化损伤。而ET可促进谷氨酸等兴奋性氨基酸释放，并通过激活磷脂酶C和间接开放电压依赖性Ca2+通道，使神经细胞Ca2+超负荷〔6〕。上述变化可加重SAH后急性CVS造成的缺血性神经细胞损伤，促进神经功能缺损的发生。
作者简介：孙保亮，男，36岁，副教授，硕士，研究方向：脑血管病的防治
参考文献
1，McCormic PW,McCOrmic J,Zabramski MB et al.Hemodynamics of subarachnoid hemorrhage arrest.J Neurosurg，1994；80：710
, http://www.100md.com
2，Bederson JB,Germano M,Guarino L.Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in rats.Stroke，1995；26(6)：1 087
3，Zimmermann M,Seifert V,Loffler BM.Prevention of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage by RO470203,a newly developed orally active endothelin receptor antagonist.Neurosurgery，1996；38：115
4，Kasuya H,Weir BKA,Nakane M et al.Nitric oxide synthase and guanylate cyclase levels in canine basilar artery after subarachnoid hemorrhage.Neurosurgery，1995；82：250
, 百拇医药
5，Sato S,Tominage T,Ohnishi T et al.EPR spin-trapping study of nitic oxide formation during bilateral caortid occlusion in the rat.Biochem Biophys Acta，1993；1181：195
6，Ziv I,Heminger G,Dyaldetti R et al.Increasd plasma endothelin 1 in acute ischemic stroke.Stroke，1992；23：1014
收稿日期：1998-11-15
修回日期：1999-09-26, 百拇医药