FCA包裹rhTNF对结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用
作者：黄显凯 张胜本 饶本强
单位：第三军医大学大坪医院普外科 重庆 400042
关键词：重组肿瘤坏死因子 结肠肿瘤
重庆医学000101
摘 要：目的：探讨增强TNF抗结肠癌作用的方法。方法：建立人结肠癌裸小鼠移植瘤模型，观察FCA包裹rhTNF对移植瘤体积、瘤重及抑瘤率等变化的影响。结果：FCA包裹rhTNF对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤体积、瘤重、生长及抑瘤率等抑制作用均较rhTNF明显增强；对裸小鼠体重及全身情况的影响较单用rhTNF明显减轻。结论：FCA增强rhTNF的抗结肠癌作用、减轻rhTNF的副作用，可能与FCA包裹后使rhTNF在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。
Effects of Recombinant Human TNF Coated with FCA on the Transplant Tumor of Human Colonic Carcinoma on Nude Mice
, http://www.100md.com
Huang Xiankai,Zhang Shengben,Rao Benqiang.
(Department of General Sugery,Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing，400042)
Abstract：Objective：To probe into the way to enhence the anticancer effect of TNF on colonic careinoma.Methods:To establish a model of nude mice transplant tumor of human colonic careinoma,to observe the effects of rhTNF coated with Freunds complete adjuvant(FCA) on size,weight ,and growth of the transplant tumor.Results:rhTNF coated with FCA had stronger inhibitory effect than that of rhTNF alone on the transplant tumor,and its effects on body weight and general condition of the nude mice were less than those of rhTNF alone.Conclusion:The enhencing effect might relate to slow release of rhTNF coated with FCA.
, 百拇医药
Key words：Recombinant human tumor necnosis factor Colonic neoplasms
本实验观察重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necnosisfactor,rhTNF)用福氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant,FCA)包裹后对结肠腺癌裸鼠移植癌的作用；并对TNF抗大肠癌的作用机理进行探讨。
1 材料与方法
1.1 人结肠腺癌裸鼠移植瘤模型的建立：人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由重庆医科大学病生教研室提供。第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸鼠。鼠龄5～7周，体重20±2g，雌雄不拘，实验时按无菌原则操作。初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调整细胞浓度至4×10/ml，取0.2ml接种于裸鼠腹部或颈背部皮下。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择接种成功的裸鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体，用含双抗的Hanks液洗两次，剪成1～2mm大小瘤块，经套管针接种于裸鼠上述部位进行传代。如此传代6次，每次接种裸鼠2～3只。其间每次将剩余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
, 百拇医药
1.2 FCA包裹rhTNF对人结肠腺癌裸鼠移植瘤的作用：
1.2.1 FCA包裹rhTNF的制备[1]：2%白蛋白生理盐水稀释rhTNF，逐滴加入FCA中，匀浆研磨器研磨成白色均匀一致的乳剂，制成rhTNF佐剂(rhTNF-FCA)，2%白蛋白生理盐水调整浓度使rhTNF-FCA中含rhTNF20000u/ml。
1.2.2 实验分组：按前述方法接种24只裸鼠，肿瘤长至5～8mm时随机分为4组，每组6只。对照组：生理盐水1ml；rhTNF处理组：rhTNF 20000u/只；FCA处理组：FCA 1ml；rhTNF-FCA处理组：rhTNF-FCA 1ml(含rhTNF 20000u/只)。均腹腔注射，3天1次，共6次，末次给药后24小时处死裸小鼠。
1.2.3 观察指标：(1)移植瘤生长曲线和抑瘤率：每只裸鼠接种后第三天开始每4天测量一次肿瘤长、短径，按前述公式绘制移植瘤生长曲线。按公式计算体积抑瘤率：
, 百拇医药
抑瘤率=
。(2)裸鼠用药前后体重变化及裸鼠的一般情况。根据用药前后体重及一般情况变化判定药物对裸小鼠的影响。(3)瘤重：处死裸鼠剥取肿瘤后，清除脂肪等非肿瘤组织，称量瘤重，按公式计算瘤重抑瘤率：
1.3 统计学处理：数据值均以x±s表示，统计处理采用本校数学教研室编制的SPMR程序包，按需要进行X2检验或t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 FCA包裹rhTNF对裸鼠的影响：rhTNF治疗组个别裸鼠有精神萎靡，活动及进食减少，烦躁不安等反应，所有裸鼠均无呼吸困难。治疗前后裸鼠体重增长值rhTNF组与对照组相比差异非常显著(P<0.01)，FCA处理组、rhTNF-FCA处理组与对照组相比无明显差异，见表1。
表1 各组治疗前后裸鼠体重变化(g)
治疗前
治疗后
增长值
对照组
20.54±0.29
25.43±0.32
4.89±0.44
, http://www.100md.com
FCA组
20.60±0.44
25.28±0.44
4.68±0.36
rhTNF组
20.62±0.28
21.26±0.67
0.64±0.60**
rhTNF-FCA组
20.57±0.35
24.61±0.46
, 百拇医药
4.03±0.64##
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
2.2 FCA包裹rhTNF对结肠腺癌移植瘤的抑制作用：FCA处理组对人结肠腺癌移植瘤体积及重量没有影响，rhTNF组及rhTNF-FCA组与对照组相比，其抑制移植瘤体积及重量的作用有显著性差异(P<0.01)，rhTNF-FCA组与rhTNF组比较差异显著(P<0.01)，见表2、表3。
表2 各组治疗前后肿瘤体积变化(mm3)
治疗前
治疗后
抑瘤率(%)
对照组
, http://www.100md.com
160.42±4.06
2134.09±143.64
―
FCA组
159.92±3.65
2046.99±178.88
―
rhTNF组
161.34±4.72
1711.25±105.63**
19.8±6.6
, http://www.100md.com rhTNF-FCA组
166.98±3.09
851.93±263.3**
65.2±13.4##
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
表3 各组治疗后肿瘤重量变化(g)
瘤重
抑瘤率(%)
对照组
2.17±0.33
―
, 百拇医药
FCA组
2.09±0.31
―
rhTNF组
1.76±0.15**
19.0±7.1
rhTNF-FCA组
0.76±0.32**
65.4±14.7**
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
3 讨 论
, 百拇医药
肿瘤坏死因子(TNF)在一定浓度能杀伤多种肿瘤细胞而不损伤正常组织细胞，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物因子之一，而且能和其它多种抗肿瘤药物协同，增加其抗肿瘤强度和范围。实验已证实TNF在体外有杀伤大肠癌细胞的作用。但是，临床尝试性应用表明，TNF治疗大肠癌的效果并不理想，而且TNF的半衰期短和毒副作用较大也限制了TNF的临床应用。因此，有必要深入研究TNF的抗肿瘤机理，并寻找增强TNF抗肿瘤效果，降低其毒副作用的方法。
FCA常用来包裹抗原免疫动物和制备抗体。Ito[2]等人率先用FCA包裹化疗药物，配合运用肝动脉栓塞，肌注IL2，治疗原发性肝癌取得了较好疗效。受此启发，本实验首次应用FCA包裹rhTNF，期望能提高rhTNF的抗大肠癌效应，减轻rhTNF对机体的不良影响。结果表明：rhTNF用FCA包裹后对大肠癌的抑制作用显著增强，而且经FCA包裹后的rhTNF几乎和生理盐水治疗组一样，对裸鼠未产生不良反应，虽然本实验中设计的剂量比常规裸鼠实验剂量增大一倍，但使用rhTNF-FCA后并未使裸鼠体重增长值明显减小。FCA增强rhTNF抗结肠癌作用的机理，推测与FCA包裹后能使rhTNF在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。黄晋生等用FCA包裹5―FU，证明FCA能明显延长5―FU的半衰期(从15分钟提高到72小时)[3]。
, 百拇医药
rhTNF在体内很不稳定，在人体内的半衰期仅15～30分钟，肌注或静脉输注人体最大耐受剂量(150～200μg/mI.d)时，血液中的有效浓度仍很低，且维持时间短，外源性TNF通过层层障碍到达肿瘤细胞后，真正与肿瘤细胞发生作用的rhTNF极少。如果单纯靠增加剂量，势必加重副作用。因而如何延长rhTNF对肿瘤的作用时间，使rhTNF在肿瘤局部持续稳定地保持有效杀瘤剂量，成为提高rhTNF抗肿瘤效应的关键。脂质体、聚乙醇包裹TNF或碳化二亚胺修饰TNF、TNF的基因治疗等都是针对这一问题进行研究，并已取得一定成绩[4、5]。本实验应用FCA包裹rhTNF已证实可明显增强其抗肿瘤作用，且能减轻rhTNF的副作用，具有临床应用前景。
基金项目：国家自然基金资助项目，No.39270656
参考文献
[1]杨景山.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1988：73
, http://www.100md.com
[2]Ito T.Immunotherapy using Freunds adjuvant and recombinant interleukin-2 combined with transarterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology，1989， 24(4):386
[3]黄晋生，刘为纹，刘松青，等.5―FU佐剂包裹的抗肿瘤机理的实验研究.肿瘤防治研究，1995，22(3)：129
[4]Saito M, Fan D, Lachman LB. Antitumor effcets of liposomal IL alpha, and TNF alpha against the pulmonary metastases of the B16F10 murine melanoma in syngeneic mice. Clin Exp Metastases,1995,13(4): 249
[5]Tsutsumi Y, Kibira T, Tsunoda S, et al.Intravenous administration of polyethyleme glycol-modified tumornecrosis factor-alpha completely regressed solid tumor immeth-A murine sarcoma model. Jpn J Cancer Res,1994, 85(12):1185, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院普外科 重庆 400042
关键词：重组肿瘤坏死因子 结肠肿瘤
重庆医学000101
摘 要：目的：探讨增强TNF抗结肠癌作用的方法。方法：建立人结肠癌裸小鼠移植瘤模型，观察FCA包裹rhTNF对移植瘤体积、瘤重及抑瘤率等变化的影响。结果：FCA包裹rhTNF对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤体积、瘤重、生长及抑瘤率等抑制作用均较rhTNF明显增强；对裸小鼠体重及全身情况的影响较单用rhTNF明显减轻。结论：FCA增强rhTNF的抗结肠癌作用、减轻rhTNF的副作用，可能与FCA包裹后使rhTNF在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。
Effects of Recombinant Human TNF Coated with FCA on the Transplant Tumor of Human Colonic Carcinoma on Nude Mice
, http://www.100md.com
Huang Xiankai,Zhang Shengben,Rao Benqiang.
(Department of General Sugery,Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing，400042)
Abstract：Objective：To probe into the way to enhence the anticancer effect of TNF on colonic careinoma.Methods:To establish a model of nude mice transplant tumor of human colonic careinoma,to observe the effects of rhTNF coated with Freunds complete adjuvant(FCA) on size,weight ,and growth of the transplant tumor.Results:rhTNF coated with FCA had stronger inhibitory effect than that of rhTNF alone on the transplant tumor,and its effects on body weight and general condition of the nude mice were less than those of rhTNF alone.Conclusion:The enhencing effect might relate to slow release of rhTNF coated with FCA.
, 百拇医药
Key words：Recombinant human tumor necnosis factor Colonic neoplasms
本实验观察重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necnosisfactor,rhTNF)用福氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant,FCA)包裹后对结肠腺癌裸鼠移植癌的作用；并对TNF抗大肠癌的作用机理进行探讨。
1 材料与方法
1.1 人结肠腺癌裸鼠移植瘤模型的建立：人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由重庆医科大学病生教研室提供。第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸鼠。鼠龄5～7周，体重20±2g，雌雄不拘，实验时按无菌原则操作。初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调整细胞浓度至4×10/ml，取0.2ml接种于裸鼠腹部或颈背部皮下。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择接种成功的裸鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体，用含双抗的Hanks液洗两次，剪成1～2mm大小瘤块，经套管针接种于裸鼠上述部位进行传代。如此传代6次，每次接种裸鼠2～3只。其间每次将剩余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
, 百拇医药
1.2 FCA包裹rhTNF对人结肠腺癌裸鼠移植瘤的作用：
1.2.1 FCA包裹rhTNF的制备[1]：2%白蛋白生理盐水稀释rhTNF，逐滴加入FCA中，匀浆研磨器研磨成白色均匀一致的乳剂，制成rhTNF佐剂(rhTNF-FCA)，2%白蛋白生理盐水调整浓度使rhTNF-FCA中含rhTNF20000u/ml。
1.2.2 实验分组：按前述方法接种24只裸鼠，肿瘤长至5～8mm时随机分为4组，每组6只。对照组：生理盐水1ml；rhTNF处理组：rhTNF 20000u/只；FCA处理组：FCA 1ml；rhTNF-FCA处理组：rhTNF-FCA 1ml(含rhTNF 20000u/只)。均腹腔注射，3天1次，共6次，末次给药后24小时处死裸小鼠。
1.2.3 观察指标：(1)移植瘤生长曲线和抑瘤率：每只裸鼠接种后第三天开始每4天测量一次肿瘤长、短径，按前述公式绘制移植瘤生长曲线。按公式计算体积抑瘤率：
, 百拇医药
抑瘤率=
。(2)裸鼠用药前后体重变化及裸鼠的一般情况。根据用药前后体重及一般情况变化判定药物对裸小鼠的影响。(3)瘤重：处死裸鼠剥取肿瘤后，清除脂肪等非肿瘤组织，称量瘤重，按公式计算瘤重抑瘤率：1.3 统计学处理：数据值均以x±s表示，统计处理采用本校数学教研室编制的SPMR程序包，按需要进行X2检验或t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 FCA包裹rhTNF对裸鼠的影响：rhTNF治疗组个别裸鼠有精神萎靡，活动及进食减少，烦躁不安等反应，所有裸鼠均无呼吸困难。治疗前后裸鼠体重增长值rhTNF组与对照组相比差异非常显著(P<0.01)，FCA处理组、rhTNF-FCA处理组与对照组相比无明显差异，见表1。
表1 各组治疗前后裸鼠体重变化(g)
治疗前
治疗后
增长值
对照组
20.54±0.29
25.43±0.32
4.89±0.44
, http://www.100md.com
FCA组
20.60±0.44
25.28±0.44
4.68±0.36
rhTNF组
20.62±0.28
21.26±0.67
0.64±0.60**
rhTNF-FCA组
20.57±0.35
24.61±0.46
, 百拇医药
4.03±0.64##
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
2.2 FCA包裹rhTNF对结肠腺癌移植瘤的抑制作用：FCA处理组对人结肠腺癌移植瘤体积及重量没有影响，rhTNF组及rhTNF-FCA组与对照组相比，其抑制移植瘤体积及重量的作用有显著性差异(P<0.01)，rhTNF-FCA组与rhTNF组比较差异显著(P<0.01)，见表2、表3。
表2 各组治疗前后肿瘤体积变化(mm3)
治疗前
治疗后
抑瘤率(%)
对照组
, http://www.100md.com
160.42±4.06
2134.09±143.64
―
FCA组
159.92±3.65
2046.99±178.88
―
rhTNF组
161.34±4.72
1711.25±105.63**
19.8±6.6
, http://www.100md.com rhTNF-FCA组
166.98±3.09
851.93±263.3**
65.2±13.4##
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
表3 各组治疗后肿瘤重量变化(g)
瘤重
抑瘤率(%)
对照组
2.17±0.33
―
, 百拇医药
FCA组
2.09±0.31
―
rhTNF组
1.76±0.15**
19.0±7.1
rhTNF-FCA组
0.76±0.32**
65.4±14.7**
与对照组相比**P<0.01；与rhTNF组相比##P<0.01
3 讨 论
, 百拇医药
肿瘤坏死因子(TNF)在一定浓度能杀伤多种肿瘤细胞而不损伤正常组织细胞，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物因子之一，而且能和其它多种抗肿瘤药物协同，增加其抗肿瘤强度和范围。实验已证实TNF在体外有杀伤大肠癌细胞的作用。但是，临床尝试性应用表明，TNF治疗大肠癌的效果并不理想，而且TNF的半衰期短和毒副作用较大也限制了TNF的临床应用。因此，有必要深入研究TNF的抗肿瘤机理，并寻找增强TNF抗肿瘤效果，降低其毒副作用的方法。
FCA常用来包裹抗原免疫动物和制备抗体。Ito[2]等人率先用FCA包裹化疗药物，配合运用肝动脉栓塞，肌注IL2，治疗原发性肝癌取得了较好疗效。受此启发，本实验首次应用FCA包裹rhTNF，期望能提高rhTNF的抗大肠癌效应，减轻rhTNF对机体的不良影响。结果表明：rhTNF用FCA包裹后对大肠癌的抑制作用显著增强，而且经FCA包裹后的rhTNF几乎和生理盐水治疗组一样，对裸鼠未产生不良反应，虽然本实验中设计的剂量比常规裸鼠实验剂量增大一倍，但使用rhTNF-FCA后并未使裸鼠体重增长值明显减小。FCA增强rhTNF抗结肠癌作用的机理，推测与FCA包裹后能使rhTNF在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。黄晋生等用FCA包裹5―FU，证明FCA能明显延长5―FU的半衰期(从15分钟提高到72小时)[3]。
, 百拇医药
rhTNF在体内很不稳定，在人体内的半衰期仅15～30分钟，肌注或静脉输注人体最大耐受剂量(150～200μg/mI.d)时，血液中的有效浓度仍很低，且维持时间短，外源性TNF通过层层障碍到达肿瘤细胞后，真正与肿瘤细胞发生作用的rhTNF极少。如果单纯靠增加剂量，势必加重副作用。因而如何延长rhTNF对肿瘤的作用时间，使rhTNF在肿瘤局部持续稳定地保持有效杀瘤剂量，成为提高rhTNF抗肿瘤效应的关键。脂质体、聚乙醇包裹TNF或碳化二亚胺修饰TNF、TNF的基因治疗等都是针对这一问题进行研究，并已取得一定成绩[4、5]。本实验应用FCA包裹rhTNF已证实可明显增强其抗肿瘤作用，且能减轻rhTNF的副作用，具有临床应用前景。
基金项目：国家自然基金资助项目，No.39270656
参考文献
[1]杨景山.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1988：73
, http://www.100md.com
[2]Ito T.Immunotherapy using Freunds adjuvant and recombinant interleukin-2 combined with transarterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology，1989， 24(4):386
[3]黄晋生，刘为纹，刘松青，等.5―FU佐剂包裹的抗肿瘤机理的实验研究.肿瘤防治研究，1995，22(3)：129
[4]Saito M, Fan D, Lachman LB. Antitumor effcets of liposomal IL alpha, and TNF alpha against the pulmonary metastases of the B16F10 murine melanoma in syngeneic mice. Clin Exp Metastases,1995,13(4): 249
[5]Tsutsumi Y, Kibira T, Tsunoda S, et al.Intravenous administration of polyethyleme glycol-modified tumornecrosis factor-alpha completely regressed solid tumor immeth-A murine sarcoma model. Jpn J Cancer Res,1994, 85(12):1185, 百拇医药