造血干细胞移植自体造血干细胞移植微小残留病净化
作者：刘启发
单位：510515 广州市，第一军医大学南方医院
关键词：
实用医学杂志000102 造血干细胞移植(HSCT)是当今治疗白血病和某些实体瘤的最主要和最有效的手段，甚至是治愈的唯一方法。但是，HSCT后仍有相当一部分病人复发，复发的根源与微小残留病(MRD)有关。因此，HSCT中的MRD治疗是影响疗效的关键，包括AHSCT(自体)和Allo-HSCT(异体)。AHSCT与Allo-HSCT相比较其复发率高，原因有二：一是移植物中含有MRD，二是缺乏Allo-HSCT具有的移植物抗瘤(白血病)效应(GVL)。针对这两个原因，目前解决的主要手段包括：对移植物进行体外净化；移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫诱导抗瘤效应；以及在移植前进行有效的强烈化疗，尽量减少移植物中及移植时体内MRD的负载。
1 移植物中MRD体外净化
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白血病AHSCT是否需要体外净化，在80年代末以前还存在不同看法，为此Gorin将1988年以前欧洲BMT登记处登记的病例进行统计分析，其结果认为净化者较未净化者复发率低；美国Brenner采用逆转录病毒载体将NeoR基因转染自身骨髓进行移植治疗急性白血病患者使患者移植后造血功能得到重建，对移植复发患者测定NeoR基因发现为阳性，证实白血病复发克隆来源移植物。上述研究结果肯定白血病AHSCT复发与移植物中MRD有关，除白血病AHSCT需要体外净化MRD外，当今研究认为淋巴瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌等移植后复发也与移植物中存在MRD有关。
体外净化的方法很多，国际上将净化分为两大类：负净化(Negative selection)是将肿瘤细胞从移植物中清除；正净化(Positive selection)是将正常造血干细胞(HSC)从移植物中分离纯化。目前临床应用的方法多为负净化，但近年正净化引起人们极大的关注，已用于临床。
1.1 正净化 HSC是一个功能上的概念，具有自我复制和增殖分化两大功能，至今形态学上还不能辩别HSC。但是，近年发现HSC在一些物理性状与表面标志等方面与其它细胞有差异。如：比重小于1.060，而造血祖细胞及白血病细胞大于1.060；在FACS上表现为低前角光散射和低到中度垂直光散射。表面标记为CD34+，CD38-，HLA-DR-，CD71-，Lin-。因此，各国学者根据HSC上述生物与物理学特征建立了一些分选HSC方法。
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1.1.1 FACS分选法 包括根据HSC的光散射性质进行净化和利用荧光标记抗体的细胞受光激发后在电场中运动方向改变分离HSC。该方法需要FACS，而且分选大量的HSC费时，故不易推广，临床应用较少。
1.1.2 免疫磁珠法 将抗体与磁性颗粒交联成免疫磁珠，利用磁场作用分离HSC。目前国外已有成品出售，其中Bater Co，Cellpro Co获美国FAD批准已进入临床应用。目前我科采用Bater Co生产的Isolex 300正选CD34+造血干细胞，对1例淋巴瘤和2例HLA不合的病人进行移植，获得成功。
1.1.3 生物素亲合素免疫吸附法 将生物素标记的特异性单抗阳性细胞与亲合素结合，亲合素交联于Bio-Gel上，用亲合层析的方法将特异性阳性细胞分开。该方法特点是可以处理大量样本，已用于临床，但不足之处是纯度相对较免疫磁珠法差，且丢失量多。
1.1.4 间接免疫包被法 原理是利用抗体能粘附玻璃或塑料的特性，用二抗包被平皿，从而使特异性单抗阳性细胞吸附于平皿，达到分离HSC作用。该方法较为繁琐，多用于实验研究。
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1.1.5 HSC体外扩增 具有正、负净化的双重作用。利用体外适合HSC扩增而不利于肿瘤细胞生成的培养体系，达到净化MRD的作用。
1.1.6 细胞淘洗法 根据HSC比重与肿瘤细胞的差异，采用梯度离心淘洗方法进行分选，该方法不足是HSC含量低，净化效果不理想。
目前临床正净化应用最多的方法是免疫磁珠法，该方法CD34+干细胞纯度高、对造血重建影响较少，移植CD34+干细胞>2×106/kg足以使造血重建。
1.2 负净化 文献报道的体外负净化方法很多，主要有：物理学、药理学、单克隆抗体、生物学等方法。本文主要介绍一些已应用于临床，而且取得一定疗效的净化方法。
1.2.1 物理学方法 此法应用较早，利用正常HSC与肿瘤细胞在大小、形状、表面电荷、密度、温度敏感性等不同，达到净化MRD的作用。(1)高温净化法：正常体细胞包括HSC与肿瘤细胞对温度敏感性存在差异，在高温(42℃～43.0℃)和深低温(-170℃)对HSC损害较少，而对肿瘤细胞有明显的损害作用。利用高热(42℃～43℃)可杀灭两个对数级以上的肿瘤细胞，而对正常HSC无明显杀伤作用，从而达到净化MRD作用。(2)光敏剂净化法：肿瘤细胞可选择结合、摄入或储留某些光敏物质(如MC540，血卟啉衍生物等)，而HSC无此功能。在一定波长光照后产生的光敏效应可杀灭4～5对数级的肿瘤细胞，而HSC损伤较轻。
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1.2.2 药物学方法 理想的净化药物应具备：(1)对造血干细胞损伤小，对肿瘤细胞杀伤大，两者须有明显差异；(2)属于非周期特异性药物；(3)净化后易清除；(4)无致癌作用；(5)在体外具有直接杀伤肿瘤作用。目前用于体外净化的药物尚不多，主要为以下几种药物：4HC，Mafosfamide，Vp16，VCR，AraG，博来霉素等。临床应用较多，而且肯定疗效的主要是4HC，Mafosfamide和Vp16。
1.2.3 单克隆抗体法 该方法是基于HSC与白血病细胞表面抗原差异，针对白血病细胞特异的抗原、抗体选择性结合到白血病细胞上，然后通过适当方法清除白血病细胞。目前常用的方法包括补体法，导向药物或毒物法，免疫物理法等。所用的单抗皆系针对正常HSC各系各阶段分化抗原，至今未发现真正的白血病克隆细胞特异性抗原，而且不同白血病个体存在差异和白血病在发生与发展过程中存在抗原演化。因此，采用单抗净化特异性较差，对HSC损害较明显，从而导致净化效果不十分理想，现应用单抗体外净化MRD的临床应用逐步减少。
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1.2.4 生物学净化法 随着对白血病发生与发展的认识，各种生物因子的基因产品问世，近几年来对白血病AHSCT体外生物学净化法展示广泛的应用前展。前述的正净化中HSC扩增属于生物学净化法中的一种。现介绍几种已用于临床的净化方法。(1)细胞因子法：利用肿瘤细胞与HSC对细胞因子的依附性差异，某些细胞因子可抑制和杀伤肿瘤细胞，而对正常HSC无影响，甚至可促进HSC增殖，细胞因子与骨髓或外周血共同培养后可达到净化MRD作用。目前具有净化作用的细胞因子主要有：IL2，IL3，IL7，IL12，CSF，IFN，TNF，TGFβ等，临床应于最多的是IL2，IFN，CSF三种。IL2具有多种生物学活性，能诱导和激活免疫功能对肿瘤的杀伤，诱导白血病细胞凋亡，参加造血调控等。IL2与骨髓或外周血共同培养1～5天，甚至更长时间(2周)，可对骨髓或外周血中MRD进行净化，同时HSC的造血功能不受影响。我们应用IL2体外净化MRD自体移植治疗白血病、淋巴瘤，移植后应用低剂量IL2，从1993年移植至今50余例病人，移植后病人5年无病生存率达80%以上，显示良好的前景。IFN是一种抗增殖因子，对CML具有特异性抑制作用。此外，IFN还可以通过激活免疫活性细胞对肿瘤进行杀伤。目前IFN主要是用于Ph+的CML体外净化，缺陷是对移植后造血功能重建有一定的影响。目前发现在体外对MRD有直接净化作用的是G-CSF和GM-CSF，其机理是诱导白血病细胞凋亡，但单用不理想。现主张CSF与其它净化方法如长期培养、药物、毒物等联合。CSF具有促进及保护HSC功能，提高药物对肿瘤的敏感性，逆转耐药等作用。细胞因子净化主张多因子合用，其疗效优于单一细胞因子，具有协同作用，同时可降低某因子的副作用。(2)免疫活性细胞：免疫活性细胞体外净化MRD的最大优点是：免疫活性细胞输注具有对体内MRD净化作用。目前已应用临床体外净化的免疫活性细胞包括：LAK，ABM，AHSC和实验阶段的基因转导免疫活性细胞，转基因肿瘤疫苗诱导的特异性杀伤细胞等。(3)反义寡核苷酸技术：针对肿瘤特异的癌基因，采用反义技术封闭癌基因，从而导致肿瘤细胞失去增殖能力，针对bcr/abl、p53、cym-C等基因现已用于临床。我们从1993年以来对5例CML采用反义技术封闭bcr/abl基因净化自体移植获得成功。(4)具有体内外双重净化的生物学方法：理想的体外净化方法是在体外不仅对MRD有净化作用，而且要求对HSC无损害，不影响移植后造血与免疫功能重建，甚至具有加速造血与免疫重建，在体内具有净化MRD的作用。上述介绍的净化方法中，某些生物学方法具有上述作用。
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2 移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫对MRD的净化
Gale等提出在ANLL病人AHSCT后复发主要来源于体内MRD，因此移植后诱导抗瘤效应显得十分重要。研究移植后诱导抗瘤效应是今后AHSCT治疗肿瘤、降低移植后肿瘤复发的重点发展方面。现介绍临床上比较成熟的几种方法。
2.1 环孢菌素A(CSA) 在动物和人类HSCT均成功诱生SGVHD，产生抗瘤效应。有关CSA诱导移植物抗宿主病(GVHD)的机理目前仍不清楚，可能与CSA抑制自身T细胞、改变T淋巴细胞的功能有关。
2.2 自体与异体干细胞混合移植 在动物与人类均证实采用小量HLA半相合的干细胞和自体干细胞混合移植，可克服大量的HLA不相合的干细胞移植而导致严重的GVHD，同时小量异体HSC短暂植活，诱导GVL。
2.3 异体淋巴细胞输注 负责GVHD与GVL的主要效应细胞为淋巴细胞，在AHSCT早期机体免疫功能未恢复正常的情况，采用异体淋巴细胞输注可诱导GVL。
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2.4 细胞因子与免疫活性细胞 在体外MRD净化提到的细胞因子与免疫活性细胞，体内应用均有净化体内MRD的作用，是今后AHSCT体内净化MRD的主要发展方向。
2.5 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗应用移植后MRD的治疗，现广泛受到关注，其疗效有待于进一步证实。目前国外正在移植后试用慢粒和多发性骨髓瘤的瘤苗。
3 移植前强烈化疗和二次AHSCT
根据国际ABMT登记处统计分析，诱导缓解时间，缓解后巩固强化疗程与剂量，以及CR持续时间与移植后复发率有关。据此提出在白血病获得CR后，进行5～6疗程的强烈化疗，以尽量减少移植物中及体内MRD负荷，对降低AHSCT后的复发率十分有利，移植前强烈化疗能减轻移植后肿瘤复发在临床上的作用，已得到肯定。
AHSCT后是否再进行化疗目前仍有争论，多数主张不宜进行强烈化疗，但是在动物实验与人类均证实能接受二次HSCT预处理方案，因此提出二次AHSCT达到净化体内MRD的作用。二次AHSCT预处理方案选择方面提出不宜采用含TBI的预处理，因人类不宜接受二次TBI剂量。
4 展望
上述就当今AHSCT微小残留病净化的临床应用与研究现况进行了讨论，需要强调的是任何单一的净化方法可能不十分理想，某些净化方法还需时间的论证，目前主张多方案联合应用，尤是移植后诱导或放大自身免疫清除MRD是今后AHSCT净化MRD研究的重要方向。甚至有人提出移植后体内MRD的净化，是HSCT中不能缺少的一部分，包括allo-HSCT。■, http://www.100md.com
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实用医学杂志000102 造血干细胞移植(HSCT)是当今治疗白血病和某些实体瘤的最主要和最有效的手段，甚至是治愈的唯一方法。但是，HSCT后仍有相当一部分病人复发，复发的根源与微小残留病(MRD)有关。因此，HSCT中的MRD治疗是影响疗效的关键，包括AHSCT(自体)和Allo-HSCT(异体)。AHSCT与Allo-HSCT相比较其复发率高，原因有二：一是移植物中含有MRD，二是缺乏Allo-HSCT具有的移植物抗瘤(白血病)效应(GVL)。针对这两个原因，目前解决的主要手段包括：对移植物进行体外净化；移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫诱导抗瘤效应；以及在移植前进行有效的强烈化疗，尽量减少移植物中及移植时体内MRD的负载。
1 移植物中MRD体外净化
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白血病AHSCT是否需要体外净化，在80年代末以前还存在不同看法，为此Gorin将1988年以前欧洲BMT登记处登记的病例进行统计分析，其结果认为净化者较未净化者复发率低；美国Brenner采用逆转录病毒载体将NeoR基因转染自身骨髓进行移植治疗急性白血病患者使患者移植后造血功能得到重建，对移植复发患者测定NeoR基因发现为阳性，证实白血病复发克隆来源移植物。上述研究结果肯定白血病AHSCT复发与移植物中MRD有关，除白血病AHSCT需要体外净化MRD外，当今研究认为淋巴瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌等移植后复发也与移植物中存在MRD有关。
体外净化的方法很多，国际上将净化分为两大类：负净化(Negative selection)是将肿瘤细胞从移植物中清除；正净化(Positive selection)是将正常造血干细胞(HSC)从移植物中分离纯化。目前临床应用的方法多为负净化，但近年正净化引起人们极大的关注，已用于临床。
1.1 正净化 HSC是一个功能上的概念，具有自我复制和增殖分化两大功能，至今形态学上还不能辩别HSC。但是，近年发现HSC在一些物理性状与表面标志等方面与其它细胞有差异。如：比重小于1.060，而造血祖细胞及白血病细胞大于1.060；在FACS上表现为低前角光散射和低到中度垂直光散射。表面标记为CD34+，CD38-，HLA-DR-，CD71-，Lin-。因此，各国学者根据HSC上述生物与物理学特征建立了一些分选HSC方法。
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1.1.1 FACS分选法 包括根据HSC的光散射性质进行净化和利用荧光标记抗体的细胞受光激发后在电场中运动方向改变分离HSC。该方法需要FACS，而且分选大量的HSC费时，故不易推广，临床应用较少。
1.1.2 免疫磁珠法 将抗体与磁性颗粒交联成免疫磁珠，利用磁场作用分离HSC。目前国外已有成品出售，其中Bater Co，Cellpro Co获美国FAD批准已进入临床应用。目前我科采用Bater Co生产的Isolex 300正选CD34+造血干细胞，对1例淋巴瘤和2例HLA不合的病人进行移植，获得成功。
1.1.3 生物素亲合素免疫吸附法 将生物素标记的特异性单抗阳性细胞与亲合素结合，亲合素交联于Bio-Gel上，用亲合层析的方法将特异性阳性细胞分开。该方法特点是可以处理大量样本，已用于临床，但不足之处是纯度相对较免疫磁珠法差，且丢失量多。
1.1.4 间接免疫包被法 原理是利用抗体能粘附玻璃或塑料的特性，用二抗包被平皿，从而使特异性单抗阳性细胞吸附于平皿，达到分离HSC作用。该方法较为繁琐，多用于实验研究。
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1.1.5 HSC体外扩增 具有正、负净化的双重作用。利用体外适合HSC扩增而不利于肿瘤细胞生成的培养体系，达到净化MRD的作用。
1.1.6 细胞淘洗法 根据HSC比重与肿瘤细胞的差异，采用梯度离心淘洗方法进行分选，该方法不足是HSC含量低，净化效果不理想。
目前临床正净化应用最多的方法是免疫磁珠法，该方法CD34+干细胞纯度高、对造血重建影响较少，移植CD34+干细胞>2×106/kg足以使造血重建。
1.2 负净化 文献报道的体外负净化方法很多，主要有：物理学、药理学、单克隆抗体、生物学等方法。本文主要介绍一些已应用于临床，而且取得一定疗效的净化方法。
1.2.1 物理学方法 此法应用较早，利用正常HSC与肿瘤细胞在大小、形状、表面电荷、密度、温度敏感性等不同，达到净化MRD的作用。(1)高温净化法：正常体细胞包括HSC与肿瘤细胞对温度敏感性存在差异，在高温(42℃～43.0℃)和深低温(-170℃)对HSC损害较少，而对肿瘤细胞有明显的损害作用。利用高热(42℃～43℃)可杀灭两个对数级以上的肿瘤细胞，而对正常HSC无明显杀伤作用，从而达到净化MRD作用。(2)光敏剂净化法：肿瘤细胞可选择结合、摄入或储留某些光敏物质(如MC540，血卟啉衍生物等)，而HSC无此功能。在一定波长光照后产生的光敏效应可杀灭4～5对数级的肿瘤细胞，而HSC损伤较轻。
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1.2.2 药物学方法 理想的净化药物应具备：(1)对造血干细胞损伤小，对肿瘤细胞杀伤大，两者须有明显差异；(2)属于非周期特异性药物；(3)净化后易清除；(4)无致癌作用；(5)在体外具有直接杀伤肿瘤作用。目前用于体外净化的药物尚不多，主要为以下几种药物：4HC，Mafosfamide，Vp16，VCR，AraG，博来霉素等。临床应用较多，而且肯定疗效的主要是4HC，Mafosfamide和Vp16。
1.2.3 单克隆抗体法 该方法是基于HSC与白血病细胞表面抗原差异，针对白血病细胞特异的抗原、抗体选择性结合到白血病细胞上，然后通过适当方法清除白血病细胞。目前常用的方法包括补体法，导向药物或毒物法，免疫物理法等。所用的单抗皆系针对正常HSC各系各阶段分化抗原，至今未发现真正的白血病克隆细胞特异性抗原，而且不同白血病个体存在差异和白血病在发生与发展过程中存在抗原演化。因此，采用单抗净化特异性较差，对HSC损害较明显，从而导致净化效果不十分理想，现应用单抗体外净化MRD的临床应用逐步减少。
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1.2.4 生物学净化法 随着对白血病发生与发展的认识，各种生物因子的基因产品问世，近几年来对白血病AHSCT体外生物学净化法展示广泛的应用前展。前述的正净化中HSC扩增属于生物学净化法中的一种。现介绍几种已用于临床的净化方法。(1)细胞因子法：利用肿瘤细胞与HSC对细胞因子的依附性差异，某些细胞因子可抑制和杀伤肿瘤细胞，而对正常HSC无影响，甚至可促进HSC增殖，细胞因子与骨髓或外周血共同培养后可达到净化MRD作用。目前具有净化作用的细胞因子主要有：IL2，IL3，IL7，IL12，CSF，IFN，TNF，TGFβ等，临床应于最多的是IL2，IFN，CSF三种。IL2具有多种生物学活性，能诱导和激活免疫功能对肿瘤的杀伤，诱导白血病细胞凋亡，参加造血调控等。IL2与骨髓或外周血共同培养1～5天，甚至更长时间(2周)，可对骨髓或外周血中MRD进行净化，同时HSC的造血功能不受影响。我们应用IL2体外净化MRD自体移植治疗白血病、淋巴瘤，移植后应用低剂量IL2，从1993年移植至今50余例病人，移植后病人5年无病生存率达80%以上，显示良好的前景。IFN是一种抗增殖因子，对CML具有特异性抑制作用。此外，IFN还可以通过激活免疫活性细胞对肿瘤进行杀伤。目前IFN主要是用于Ph+的CML体外净化，缺陷是对移植后造血功能重建有一定的影响。目前发现在体外对MRD有直接净化作用的是G-CSF和GM-CSF，其机理是诱导白血病细胞凋亡，但单用不理想。现主张CSF与其它净化方法如长期培养、药物、毒物等联合。CSF具有促进及保护HSC功能，提高药物对肿瘤的敏感性，逆转耐药等作用。细胞因子净化主张多因子合用，其疗效优于单一细胞因子，具有协同作用，同时可降低某因子的副作用。(2)免疫活性细胞：免疫活性细胞体外净化MRD的最大优点是：免疫活性细胞输注具有对体内MRD净化作用。目前已应用临床体外净化的免疫活性细胞包括：LAK，ABM，AHSC和实验阶段的基因转导免疫活性细胞，转基因肿瘤疫苗诱导的特异性杀伤细胞等。(3)反义寡核苷酸技术：针对肿瘤特异的癌基因，采用反义技术封闭癌基因，从而导致肿瘤细胞失去增殖能力，针对bcr/abl、p53、cym-C等基因现已用于临床。我们从1993年以来对5例CML采用反义技术封闭bcr/abl基因净化自体移植获得成功。(4)具有体内外双重净化的生物学方法：理想的体外净化方法是在体外不仅对MRD有净化作用，而且要求对HSC无损害，不影响移植后造血与免疫功能重建，甚至具有加速造血与免疫重建，在体内具有净化MRD的作用。上述介绍的净化方法中，某些生物学方法具有上述作用。
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2 移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫对MRD的净化
Gale等提出在ANLL病人AHSCT后复发主要来源于体内MRD，因此移植后诱导抗瘤效应显得十分重要。研究移植后诱导抗瘤效应是今后AHSCT治疗肿瘤、降低移植后肿瘤复发的重点发展方面。现介绍临床上比较成熟的几种方法。
2.1 环孢菌素A(CSA) 在动物和人类HSCT均成功诱生SGVHD，产生抗瘤效应。有关CSA诱导移植物抗宿主病(GVHD)的机理目前仍不清楚，可能与CSA抑制自身T细胞、改变T淋巴细胞的功能有关。
2.2 自体与异体干细胞混合移植 在动物与人类均证实采用小量HLA半相合的干细胞和自体干细胞混合移植，可克服大量的HLA不相合的干细胞移植而导致严重的GVHD，同时小量异体HSC短暂植活，诱导GVL。
2.3 异体淋巴细胞输注 负责GVHD与GVL的主要效应细胞为淋巴细胞，在AHSCT早期机体免疫功能未恢复正常的情况，采用异体淋巴细胞输注可诱导GVL。
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2.4 细胞因子与免疫活性细胞 在体外MRD净化提到的细胞因子与免疫活性细胞，体内应用均有净化体内MRD的作用，是今后AHSCT体内净化MRD的主要发展方向。
2.5 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗应用移植后MRD的治疗，现广泛受到关注，其疗效有待于进一步证实。目前国外正在移植后试用慢粒和多发性骨髓瘤的瘤苗。
3 移植前强烈化疗和二次AHSCT
根据国际ABMT登记处统计分析，诱导缓解时间，缓解后巩固强化疗程与剂量，以及CR持续时间与移植后复发率有关。据此提出在白血病获得CR后，进行5～6疗程的强烈化疗，以尽量减少移植物中及体内MRD负荷，对降低AHSCT后的复发率十分有利，移植前强烈化疗能减轻移植后肿瘤复发在临床上的作用，已得到肯定。
AHSCT后是否再进行化疗目前仍有争论，多数主张不宜进行强烈化疗，但是在动物实验与人类均证实能接受二次HSCT预处理方案，因此提出二次AHSCT达到净化体内MRD的作用。二次AHSCT预处理方案选择方面提出不宜采用含TBI的预处理，因人类不宜接受二次TBI剂量。
4 展望
上述就当今AHSCT微小残留病净化的临床应用与研究现况进行了讨论，需要强调的是任何单一的净化方法可能不十分理想，某些净化方法还需时间的论证，目前主张多方案联合应用，尤是移植后诱导或放大自身免疫清除MRD是今后AHSCT净化MRD研究的重要方向。甚至有人提出移植后体内MRD的净化，是HSCT中不能缺少的一部分，包括allo-HSCT。■, http://www.100md.com