免疫抑制剂SIPI-96-1014的分离和鉴别
作者：姜健 龚炳永 郝伟月 谢家政
单位：上海医药工业研究院， 上海 200040
关键词：免疫抑制；分离；鉴别；邻羟基乙酰苯胺；吸水链霉菌SIPI-96-1014；啤酒酵母
中国抗生素杂志000102 摘 要 在应用酵母突变株模型筛选免疫抑制剂过程中，筛选出一阳性菌株SIPI-96-1014。经过发酵提取，分离和纯化，从其菌丝体中分离出一个活性化合物SIPI-96-1014。通过对其理化性质等光谱数据的分析，确定其结构与化合物邻羟基乙酰苯胺一致。生物学活性研究表明，其对酵母野生株和突变株具有一定的抑制活性，详细的免疫抑制活性有待于进一步研究。
SIPI-96-1014, an immunosupperssant: isolation and identificaton
, 百拇医药
Jiang Jian， Gong Bingyong， Hao Weiyue and Xie Jiazheng
(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040)
ABSTRACT As part of a program aimed at discovering novel immunosuppressive agents, we have isolated a Streptomyces hygroscopicus No.1014. One active component, SIPI-96-1041 was isolated from the culture broth and it showed strong inhibitory effect on the test organisms Saccharomyces cerevisiae (Wild type) and Saccharomyces cerevisiae (Mutant type).
, 百拇医药
Based on the spectral data and physico-chemical properties of SIPI-96-1014, it has been identified as O-hydroxyacetanilide. The details about immuno-pharmacological profile of this immunosuppressive agent were under investigation.
KEY WORDS Immunosuppressant； Isolation； Identification； O-hydroxyacetanilide； Streptomyces hygroscopicus SIPI-96-1014； Saccharomyces cerevisiae
瑞士Sandoz药厂Borel从真菌Tolypocladium inflatum代谢产物中分离得11环肽化合物环孢素(cyclosporin A)，因其免疫活力高而骨髓毒性较低，已应用于临床成为抑制移植器官排斥反应的一线药物[1]。随后日本Kino等在1987年从链霉菌Strepto-myces tsukubaensis No.9993的发酵产物中发现了FK-506，其有效浓度是环孢素的1/1000，而作用特异性远优于前者，1993年4月FK-506(他克莫司，tacro-limus)获准投入市场(商品名：Prograf)[2，3]。1975年在抗真菌物质筛选中发现的31元大环内酯抗生素rapamycin，产生菌为Streptomyces hygroscopicus ATCC29253，因其结构与FK-506类似，转而研究其免疫抑制活性，现已进入Ⅲ期临床研究[4，5]。
, 百拇医药
根据本实验室已经建立的免疫抑制剂筛选模型，以已知的免疫抑制剂他克莫司为阳性对照，据对酵母野生株和突变株抑菌圈的有无及差异，来筛选微生物发酵液中是否合成有免疫抑制活性的化合物[6]。从山西五台山地区的土壤中分离、筛选出阳性菌株SIPI-96-1014，据其菌落培养特征和生理生化物性可归入吸水链霉菌类群。经其发酵、提取、分离和纯化的研究，从中分离出活性化合物SIPI-96-1014。本文报道SIPI-96-1014的发酵、提取、理化性质和结构。
1 SIPI-96-1014的发酵
将吸水链霉菌SIPI-96-1014接种于ISP2斜面培养基，28℃培养14～21d，生长良好。SIPI-96-1014的发酵采用斜面接种和三级发酵。
种子培养 培养基组分(%)：葡萄糖2.5，黄豆粉1，酵母粉0.1，碳酸钙0.1，自来水配制，消前pH6.8～7.0。250ml三角瓶装20ml培养基，斜面挖块接种，28℃(220r/min)振荡培养48h；二级种子培养基(同前)培养48h，再以8%接种量种入发酵培养基。
, http://www.100md.com
发酵培养 培养基组分(%)：可溶性淀粉2，葡萄糖1，黄豆粉2.5，牛肉膏0.1，酵母粉0.4，氯化钠0.2，磷酸氢二钾0.005，碳酸钙0.15，自来水配制，消前pH7.0～7.2。750ml三角瓶装150ml培养基，28℃(220r/min)振荡培养72～96h。
2 SIPI-96-1014的分离纯化
将SIPI-96-1014菌株72～96h发酵培养液(20L)，以4000r/min离心20min，分离得菌丝体，反复用80%丙酮浸泡，直至丙酮浸泡液中残存活性(用啤酒酵母检测)很低为止，浸泡液经减压浓缩除去丙酮，残存水液与发酵上清液(9L)合并，经非离子型大孔吸附剂HP-20(Mitsubishi Chemical Industries Ltd.，Japan)(900ml)层析柱吸附。用去离子水(5L)清洗后，经25%、75%、100%丙酮溶液(各1000ml)梯度洗脱，合并有生物活性的洗脱液(用啤酒酵母检测)，减压浓缩，残留液拌入硅胶(10g，200～300目，青岛海洋化工厂，下同)，风干后经硅胶柱层析(160g干柱)，用环己烷-乙酸乙酯(5∶1、3∶1、1∶1各500ml)梯度洗脱，分步收集，TLC检测(高效硅胶板，HF254，青岛海洋化工厂，流动相：环己烷-乙酸乙酯2∶1)，合并Rf值为0.35处的活性组分，减压浓缩至干，得白色粉末(30mg)，以甲醇-丙酮重结晶两次，得白色针状结晶(12mg)。
, 百拇医药
3 SIPI-96-1014的鉴别
SIPI-96-1014为白色针状结晶，易溶于丙酮、二甲亚砜，可溶于低级醇、醚、苯和热水，不溶于冷水，遇三氯化铁显绿色。
HPLC分析：Waters 996二级管矩阵检测器，Nova-Pak3.9mm×150mm，4μm，C18柱，流动相：MeOH/H2O(60∶40，V/V)，流速：0.8ml/min，tR值：1.875min。
SIPI-96-1014熔点为211℃(差热分析法)；紫外光谱λmax(MeOH)为215，238，281nm；其红外光谱中，显示有下列特征吸收峰：υcm-1，3450(仲酰胺N-H)，3400～3000(酚羟基和苯环C-H)，1660(仲酰胺Ⅰ带)，1595和1615(苯环C-C)，1545(仲酰胺Ⅱ带)，1450(苯环骨架)，1380(甲基C-H)，1330(酚C-O)，1285(仲酰胺Ⅲ带)，1240和1255(酚羟基)，1000～1230(酚C-O)，770(1，2，3，4四连氢苯环C-H)，670(含氢键的O-H)，与SADTLER标准谱库中的2′-hydroxyacetanilide完全一致，分子量为151(EI-MS法，图1)，高分辨质谱确定其分子式为C8H9NO2，测量值：151.062975，理论值：151.063323。
, 百拇医药
SIPI-96-1014的1H核磁共振谱(图2)和13C核磁共振谱(图3)与SADTLER标准谱库中的2′-hydrox-yacetanilide一致，且分辨率优于后者。结合HMQC(图4)和HMBC(图5)所给的信息，可确定碳和氢的偶合关系。HMQC谱上可见，甲基及苯环上4个次甲基的直接相连C和H的偶合点。HMBC谱上可见，8-CH3上H和7-C=O上C偶合，H-3与C-1偶合，H-4与C-2/C-6偶合，H-5与C-3/C-1偶合，H-6与C-2偶合(图6)1H-1H COSY谱(图7)显示，H-6与H-5偶合，H-5与H-4偶合，H-4与H-3偶合。1H-NMR谱上，9.30ppm的馒头峰为酰胺氮上的质子，9.51ppm为酚羟基上的氢。1.3、3.1ppm等处的峰，在各相关谱中没有相应的偶合关系，为样品中残留微量的水、甲醇及其他杂质所引入的干扰，2.1ppm附近的多重峰为氘代丙酮的溶剂峰。综合以上结果，确定SIPI-96-1014的结构为邻羟基乙酰苯胺(图8)，其碳氢归属见表1。
, 百拇医药
图1 SIPI-96-1014的EI-MS图谱
4 SIPI-96-1014的生物学活性
抑菌试验发现，SIPI-96-1014没有抗烟曲霉和白色念珠菌的活性，但有抗啤酵母的活性(最低抑菌浓度低于20mg/L)，在体外筛选免疫抑制剂的模型中，有一定的抑制作用，其详细的生物学活性有待进一步研究。
5 结果与讨论
该化合物已广泛应用于有机合成、制药工业、偶氮染料的生产，也是生物抗氧剂和过氧化氢稳定剂。其异构体间羟基乙酰苯胺、对羟基乙酰苯胺也有相似的用途。后者作为解热镇痛药的主要成分，其制剂已由世界各大制药公司生产。
表1 SIPI-96-1014的1H-NMR及13C-NMR的化学位移归属 编 号
, 百拇医药
碳原子的
化学位移
δC(ppm)
相连氢原子的
化学位移
δH(ppm)
C-1
127.17
-
C-2
148.62
-
, http://www.100md.com
C-3
118.16
6.91
C-4
125.99
7.02
C-5
120.06
6.81
C-6
122.28
7.46
C-7
, http://www.100md.com
170.58
-
C-8
23.11
2.21
NH
-
9.30
OH
-
9.51
图2 SIPI-96-1014的1H-NMR谱(Acetone-d6，400MHz)
, 百拇医药
图3 SIPI-96-1014的13C-NMR谱和13C-DEPT-135谱(Acetone-d6，400MHz)
图4 SIPI-96-1014的HMQC谱(Acetone-d6，400MHz)
图5 SIPI-96-1014的HMBC谱(Acetone-d6，400MHz)
本实验室在以下不同的靶酶筛选微生物来源的酶抑制剂的过程中，分离鉴定的相关化合物有：胆固醇生物合成酶抑制剂——抗生素SIPI-8926-Ⅲ；甾体5α-还原酶抑制剂——SIPI-94-1079-Ⅱ[6～8]。 SIPI-96-1014的发现，为深入研究这类化合物在不同筛选模型中的作用机制及其在生物合成途径中的相互关系提供了可能。
, http://www.100md.com
图6 HMBC的碳和氢的偶合关系
图7 SIPI-96-1014的1H-1H COSY谱
(Acetone-d6，400MHz)
图8 SIPI-96-1014结构
姜健，男，生 于1968年，学士，助理研究员。
参考文献
1，Borel J F. Cyclosporin A. ed by White D J G, Amsterdam: Elsevier Biomedical Press，1983：5
, 百拇医药
2，Kino T, Hatanaka H, Hashimoto M, et al. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces, Ⅰ.Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics. J Antibiot，1987；40：1249
3，马替纯二. 免疫抑制剂是如何起作用的. 国外医药抗生素分册，1993；14(4)：305
4，Vezina C, Kudelski A, Sehgal S N. Rapamycin(AY-22,989), a new antifungal antibiotic. Ⅰ.Taxonomy of the pro-ducing Streptomycete and isolation of the active principle. J Antibiot，1975；28：721
, 百拇医药
5，Nishide H, Sakakibara T, Aoki F, et al. Generation of novel rapamycin structures by microbial manipulations. J Anti-biot，1995；48(7)：657
6，胡海峰，朱宝泉，龚炳永. 生物活性物质的筛选与新药研究. 国外医药抗生素分册，1998；19(6)：401
7，孟晓峰，龚炳永，朱宝泉. 微生物来源的甾体5α-还原酶抑制剂SIPI-94-1079-Ⅱ的研究. 中国抗生素杂志，1997；22(6)：401
8，胡海峰，朱宝泉，龚炳永. 微生物来源的胆固醇生物合成酶抑制剂研究 抗生素SIPI-8926-Ⅲ的研究. 中国医药工业杂志，1995；26(11)：484
1998年3月2日收稿, 百拇医药
单位：上海医药工业研究院， 上海 200040
关键词：免疫抑制；分离；鉴别；邻羟基乙酰苯胺；吸水链霉菌SIPI-96-1014；啤酒酵母
中国抗生素杂志000102 摘 要 在应用酵母突变株模型筛选免疫抑制剂过程中，筛选出一阳性菌株SIPI-96-1014。经过发酵提取，分离和纯化，从其菌丝体中分离出一个活性化合物SIPI-96-1014。通过对其理化性质等光谱数据的分析，确定其结构与化合物邻羟基乙酰苯胺一致。生物学活性研究表明，其对酵母野生株和突变株具有一定的抑制活性，详细的免疫抑制活性有待于进一步研究。
SIPI-96-1014, an immunosupperssant: isolation and identificaton
, 百拇医药
Jiang Jian， Gong Bingyong， Hao Weiyue and Xie Jiazheng
(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040)
ABSTRACT As part of a program aimed at discovering novel immunosuppressive agents, we have isolated a Streptomyces hygroscopicus No.1014. One active component, SIPI-96-1041 was isolated from the culture broth and it showed strong inhibitory effect on the test organisms Saccharomyces cerevisiae (Wild type) and Saccharomyces cerevisiae (Mutant type).
, 百拇医药
Based on the spectral data and physico-chemical properties of SIPI-96-1014, it has been identified as O-hydroxyacetanilide. The details about immuno-pharmacological profile of this immunosuppressive agent were under investigation.
KEY WORDS Immunosuppressant； Isolation； Identification； O-hydroxyacetanilide； Streptomyces hygroscopicus SIPI-96-1014； Saccharomyces cerevisiae
瑞士Sandoz药厂Borel从真菌Tolypocladium inflatum代谢产物中分离得11环肽化合物环孢素(cyclosporin A)，因其免疫活力高而骨髓毒性较低，已应用于临床成为抑制移植器官排斥反应的一线药物[1]。随后日本Kino等在1987年从链霉菌Strepto-myces tsukubaensis No.9993的发酵产物中发现了FK-506，其有效浓度是环孢素的1/1000，而作用特异性远优于前者，1993年4月FK-506(他克莫司，tacro-limus)获准投入市场(商品名：Prograf)[2，3]。1975年在抗真菌物质筛选中发现的31元大环内酯抗生素rapamycin，产生菌为Streptomyces hygroscopicus ATCC29253，因其结构与FK-506类似，转而研究其免疫抑制活性，现已进入Ⅲ期临床研究[4，5]。
, 百拇医药
根据本实验室已经建立的免疫抑制剂筛选模型，以已知的免疫抑制剂他克莫司为阳性对照，据对酵母野生株和突变株抑菌圈的有无及差异，来筛选微生物发酵液中是否合成有免疫抑制活性的化合物[6]。从山西五台山地区的土壤中分离、筛选出阳性菌株SIPI-96-1014，据其菌落培养特征和生理生化物性可归入吸水链霉菌类群。经其发酵、提取、分离和纯化的研究，从中分离出活性化合物SIPI-96-1014。本文报道SIPI-96-1014的发酵、提取、理化性质和结构。
1 SIPI-96-1014的发酵
将吸水链霉菌SIPI-96-1014接种于ISP2斜面培养基，28℃培养14～21d，生长良好。SIPI-96-1014的发酵采用斜面接种和三级发酵。
种子培养 培养基组分(%)：葡萄糖2.5，黄豆粉1，酵母粉0.1，碳酸钙0.1，自来水配制，消前pH6.8～7.0。250ml三角瓶装20ml培养基，斜面挖块接种，28℃(220r/min)振荡培养48h；二级种子培养基(同前)培养48h，再以8%接种量种入发酵培养基。
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发酵培养 培养基组分(%)：可溶性淀粉2，葡萄糖1，黄豆粉2.5，牛肉膏0.1，酵母粉0.4，氯化钠0.2，磷酸氢二钾0.005，碳酸钙0.15，自来水配制，消前pH7.0～7.2。750ml三角瓶装150ml培养基，28℃(220r/min)振荡培养72～96h。
2 SIPI-96-1014的分离纯化
将SIPI-96-1014菌株72～96h发酵培养液(20L)，以4000r/min离心20min，分离得菌丝体，反复用80%丙酮浸泡，直至丙酮浸泡液中残存活性(用啤酒酵母检测)很低为止，浸泡液经减压浓缩除去丙酮，残存水液与发酵上清液(9L)合并，经非离子型大孔吸附剂HP-20(Mitsubishi Chemical Industries Ltd.，Japan)(900ml)层析柱吸附。用去离子水(5L)清洗后，经25%、75%、100%丙酮溶液(各1000ml)梯度洗脱，合并有生物活性的洗脱液(用啤酒酵母检测)，减压浓缩，残留液拌入硅胶(10g，200～300目，青岛海洋化工厂，下同)，风干后经硅胶柱层析(160g干柱)，用环己烷-乙酸乙酯(5∶1、3∶1、1∶1各500ml)梯度洗脱，分步收集，TLC检测(高效硅胶板，HF254，青岛海洋化工厂，流动相：环己烷-乙酸乙酯2∶1)，合并Rf值为0.35处的活性组分，减压浓缩至干，得白色粉末(30mg)，以甲醇-丙酮重结晶两次，得白色针状结晶(12mg)。
, 百拇医药
3 SIPI-96-1014的鉴别
SIPI-96-1014为白色针状结晶，易溶于丙酮、二甲亚砜，可溶于低级醇、醚、苯和热水，不溶于冷水，遇三氯化铁显绿色。
HPLC分析：Waters 996二级管矩阵检测器，Nova-Pak3.9mm×150mm，4μm，C18柱，流动相：MeOH/H2O(60∶40，V/V)，流速：0.8ml/min，tR值：1.875min。
SIPI-96-1014熔点为211℃(差热分析法)；紫外光谱λmax(MeOH)为215，238，281nm；其红外光谱中，显示有下列特征吸收峰：υcm-1，3450(仲酰胺N-H)，3400～3000(酚羟基和苯环C-H)，1660(仲酰胺Ⅰ带)，1595和1615(苯环C-C)，1545(仲酰胺Ⅱ带)，1450(苯环骨架)，1380(甲基C-H)，1330(酚C-O)，1285(仲酰胺Ⅲ带)，1240和1255(酚羟基)，1000～1230(酚C-O)，770(1，2，3，4四连氢苯环C-H)，670(含氢键的O-H)，与SADTLER标准谱库中的2′-hydroxyacetanilide完全一致，分子量为151(EI-MS法，图1)，高分辨质谱确定其分子式为C8H9NO2，测量值：151.062975，理论值：151.063323。
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SIPI-96-1014的1H核磁共振谱(图2)和13C核磁共振谱(图3)与SADTLER标准谱库中的2′-hydrox-yacetanilide一致，且分辨率优于后者。结合HMQC(图4)和HMBC(图5)所给的信息，可确定碳和氢的偶合关系。HMQC谱上可见，甲基及苯环上4个次甲基的直接相连C和H的偶合点。HMBC谱上可见，8-CH3上H和7-C=O上C偶合，H-3与C-1偶合，H-4与C-2/C-6偶合，H-5与C-3/C-1偶合，H-6与C-2偶合(图6)1H-1H COSY谱(图7)显示，H-6与H-5偶合，H-5与H-4偶合，H-4与H-3偶合。1H-NMR谱上，9.30ppm的馒头峰为酰胺氮上的质子，9.51ppm为酚羟基上的氢。1.3、3.1ppm等处的峰，在各相关谱中没有相应的偶合关系，为样品中残留微量的水、甲醇及其他杂质所引入的干扰，2.1ppm附近的多重峰为氘代丙酮的溶剂峰。综合以上结果，确定SIPI-96-1014的结构为邻羟基乙酰苯胺(图8)，其碳氢归属见表1。
, 百拇医药
图1 SIPI-96-1014的EI-MS图谱
4 SIPI-96-1014的生物学活性
抑菌试验发现，SIPI-96-1014没有抗烟曲霉和白色念珠菌的活性，但有抗啤酵母的活性(最低抑菌浓度低于20mg/L)，在体外筛选免疫抑制剂的模型中，有一定的抑制作用，其详细的生物学活性有待进一步研究。
5 结果与讨论
该化合物已广泛应用于有机合成、制药工业、偶氮染料的生产，也是生物抗氧剂和过氧化氢稳定剂。其异构体间羟基乙酰苯胺、对羟基乙酰苯胺也有相似的用途。后者作为解热镇痛药的主要成分，其制剂已由世界各大制药公司生产。
表1 SIPI-96-1014的1H-NMR及13C-NMR的化学位移归属 编 号
, 百拇医药
碳原子的
化学位移
δC(ppm)
相连氢原子的
化学位移
δH(ppm)
C-1
127.17
-
C-2
148.62
-
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C-3
118.16
6.91
C-4
125.99
7.02
C-5
120.06
6.81
C-6
122.28
7.46
C-7
, http://www.100md.com
170.58
-
C-8
23.11
2.21
NH
-
9.30
OH
-
9.51
图2 SIPI-96-1014的1H-NMR谱(Acetone-d6，400MHz)
, 百拇医药
图3 SIPI-96-1014的13C-NMR谱和13C-DEPT-135谱(Acetone-d6，400MHz)
图4 SIPI-96-1014的HMQC谱(Acetone-d6，400MHz)
图5 SIPI-96-1014的HMBC谱(Acetone-d6，400MHz)
本实验室在以下不同的靶酶筛选微生物来源的酶抑制剂的过程中，分离鉴定的相关化合物有：胆固醇生物合成酶抑制剂——抗生素SIPI-8926-Ⅲ；甾体5α-还原酶抑制剂——SIPI-94-1079-Ⅱ[6～8]。 SIPI-96-1014的发现，为深入研究这类化合物在不同筛选模型中的作用机制及其在生物合成途径中的相互关系提供了可能。
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图6 HMBC的碳和氢的偶合关系
图7 SIPI-96-1014的1H-1H COSY谱
(Acetone-d6，400MHz)
图8 SIPI-96-1014结构
姜健，男，生 于1968年，学士，助理研究员。
参考文献
1，Borel J F. Cyclosporin A. ed by White D J G, Amsterdam: Elsevier Biomedical Press，1983：5
, 百拇医药
2，Kino T, Hatanaka H, Hashimoto M, et al. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces, Ⅰ.Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics. J Antibiot，1987；40：1249
3，马替纯二. 免疫抑制剂是如何起作用的. 国外医药抗生素分册，1993；14(4)：305
4，Vezina C, Kudelski A, Sehgal S N. Rapamycin(AY-22,989), a new antifungal antibiotic. Ⅰ.Taxonomy of the pro-ducing Streptomycete and isolation of the active principle. J Antibiot，1975；28：721
, 百拇医药
5，Nishide H, Sakakibara T, Aoki F, et al. Generation of novel rapamycin structures by microbial manipulations. J Anti-biot，1995；48(7)：657
6，胡海峰，朱宝泉，龚炳永. 生物活性物质的筛选与新药研究. 国外医药抗生素分册，1998；19(6)：401
7，孟晓峰，龚炳永，朱宝泉. 微生物来源的甾体5α-还原酶抑制剂SIPI-94-1079-Ⅱ的研究. 中国抗生素杂志，1997；22(6)：401
8，胡海峰，朱宝泉，龚炳永. 微生物来源的胆固醇生物合成酶抑制剂研究 抗生素SIPI-8926-Ⅲ的研究. 中国医药工业杂志，1995；26(11)：484
1998年3月2日收稿, 百拇医药