一氧化氮在实验化学性肝纤维化中作用的探讨
作者：李异玲 王天骄 傅宝玉
单位：王天骄(基础医学院生物化学教研室)；李异玲(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)；王天骄(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)；傅宝玉(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)
关键词：一氧化氮；化学性肝纤维化；一氧化氮合成酶抑制剂
中国医科大学学报000122 摘要 目的：探讨一氧化氮(NO)在实验化学性肝纤维化中的作用。方法：选用Wistar纯系大白鼠，通过皮下注射四氯化碳复制肝纤维化动物模型。于注射12周后将已经发生肝纤维化的大白鼠随机分成两组，一组尾静脉注射NO合成酶抑制剂L-NAME，另一组注射生理盐水作为对照，4周后检测血清NO浓度及肝脏病理改变。结果：血清NO浓度在肝纤维化过程中呈升高趋势，尾静脉注射L-NAME后，血清NO浓度下降，病理检查提示L-NAME组较生理盐水对照组纤维组织增多，纤维间隔增宽。结论：NO不但参与了化学性肝纤维化过程，并在此过程中起到抑制纤维化发展的作用。
, 百拇医药
Study on Nitric Oxide in Experimental Chemical Hepatic Fibrosis
Li Yiling Wang Tianjiao Fu Baoyu
(Department of Gastroenterology,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:This paper was designed to study the action of nitric oxide(NO) in experimental chemical hepatic fibrosis.Methods:Male Wistar rats with an average body weight of 100～120 g were used for the induction of liver fibrosis by subcutaneous injecting carbon tetrachloride(1.2 ml/kg).After 12 weeks,the rats were randomly divided into two groups,one group was injected with NO syntheses inhibitor L-NAME via tail vein,the other was injected with normal saline.Serum NO concentration was detected by α-naphthylamino spectrophotometry.Results:Serum NO rose in parallel with hepatic damage. After injecting L-NAME,serum NO concentration decreased markedly,pathology detection showed more fibrous tissue accumulated in the septa. Conclusion:The production of NO in chemical hepatic fibrosis can protect liver from damage.
, 百拇医药
KEY WORDS nitric oxide; chemical hepatic fibrosis; L-NAME
自从1987年发现内皮衍生舒张因子的本质是一氧化氮(nitric oxide,NO)以来[1]，NO在生物学界越来越引起重视。NO在许多疾病中发挥的血管舒张作用已得到认可。最近的研究发现，NO与肝细胞损伤亦有关，王根生[2]等研究表明NO在急性免疫性肝损伤中起保护作用，而在急性化学性肝损伤中作用甚微。本研究探讨NO在慢性化学性肝损伤——肝纤维化中的作用。为肝纤维化发病机理的研究及抗肝纤维化新药的研制提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：Wistar纯系大白鼠42只均为雄性，体重100～120 g。正常组7只，实验组35只，由中国医科大学实验动物部提供，分笼饲养，按昼夜时程及室温条件下，用平衡饲料喂养。
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1.1.2 试剂及设备：四氯化碳，α-奈胺盐酸盐，对氨基苯磺酸均为国产分析纯。NO合成酶抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲基乙酯(L-NAME，Sigma公
司)。氢氧化铝凝胶由1 mol/L硫酸铝与6 mol/L氢氧化钠等体积混合，离心洗涤后制成。仪器有日本岛津260分光光度仪，国产漩涡混匀器，低速离心机。
1.2 方法
1.2.1 实验化学性肝纤维化动物模型的制备：对于实验组动物，将40%四氯化碳花生油混合液按1.2 ml/kg皮下多点反复注射，每周2次，并于注射4、8、12周后分批处死动物，每次7只。12周后，将余下的大白鼠尾静脉分别注射L-NAME(25 mg/kg)及生理盐水，4周后处死，所有动物均颈静脉切开采血，剖腹取肝，进行检测。
1.2.2 NO水平的测定：参照文献[3]略加修改，用α-奈胺分光光度法检测血清NO含量：取新鲜血清0.6 ml，经氢氧化铝凝胶脱色后，依次加入3.2 mmol/L对氨基苯磺酸，3.2 mmol/L α-奈胺盐酸盐，0.1 mol/L乙酸钠各0.5 ml，30 min内，波长520 nm测定光密度值。
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2 结果
2.1 肝脏病理改变 正常：肝细胞以中央静脉为中心向外周呈放射状分布。4周：肝脏呈点状坏死，脂肪变性，空泡变性。8周：肝脏呈大片状坏死，纤维组织增生，但尚无完整纤维间隔形成。12周：纤维组织明显增多，形成较完整纤维间隔。
2.2 血清NO水平的变化 血清NO正常值为(16.2±1.4)μmol/L，注射四氯化碳4周后为(26.4±1.2)μmol/L，8周时为(37.3±1.9)μmol/L，12周时(54.8±1.5)μmol/L，较正常组明显增高(P<0.01)。尾静脉注射生理盐水4周后NO升为(42.2±1.1)μmol/L，尾静脉注射L-NAME 4周后，血清NO值为(17.5±1.4)μmol/L，较生理盐水组显著下降(P<0.01)。
尾静脉注射L-NAME后肝脏病理改变与生理盐水组相比，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，见图1、2。
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图1 尾静脉注射生理盐水4周后肝脏病理改变 ×10
Figure 1 Pathology of liver after injection of normal saline via tail vein(4 weeks) ×10
图2 尾静脉注射L-NAME 4周后肝脏病理改变 ×10
Figure 2 Pathology of liver after injection of L-NAME via tail vein (4 weeks) ×10
3 讨论
肝硬化严重威胁人类健康，而肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，它是在外界致炎因子的作用下，使胶原的生成与降解失衡，从而导致细胞外基质(ECM)的过度沉积，能否将病变终止于肝纤维化阶段，对于慢性肝病的防治，具有重大意义。
, 百拇医药
NO是一种新的细胞间信息交换的载体，广泛参与生理功能的调解。它在体内以左旋精氨酸为底物，在NO合成酶的作用下，脱去胍基末端氮原子而生成。NO与消化系统疾病关系密切，它可作为非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的一种递质，在胃肠道自主神经支配方面起主要作用。可调节胃粘膜血流，维持粘膜的完整性和防御能力[4]，促进溃疡的愈合，降低平滑肌张力。本实验通过皮下注射四氯化碳复制化学性肝纤维化动物模型，探讨NO在肝纤维化中的作用，结果表明，随着肝脏病理改变的加重，血清NO水平明显升高，由(16.2±1.4)μmol/L上升到(58.4±1.5)μmol/L，这一结果说明了NO在化学性肝纤维化中起到一定作用。为了研究其作用方式，对于已经发生肝纤维化的大白鼠，尾静脉给予NO合成酶抑制剂L-NAME 4周后，NO水平明显下降，降至(17.5±1.4)μmol/L，病理学检查发现使用抑制剂后，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，这一结果表明NO起到了抑制纤维化发展的作用，并且随着肝纤维化程度的加重，NO发挥的抗肝纤维化作用也越来越明显。生理盐水对照组，NO浓度降至(42.2±1.1)μmol/L，其病理改变较第12周减轻，说明NO水平与肝纤维化程度相平行。临床上需寻求提供NO的药物来抗肝纤维化，硝普钠、硝酸甘油能提供NO，乙酰胆碱能刺激内源性NO的释放，都有一定的应用前景。但对于NO的抗肝纤维化机制，有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Palmer RMT,Ferrige AG,Moncade S,et al.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor.Nature,1987,327(6122):524-526
2，王根生，刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用.中华医学杂志，1996，76(3)：203～206
3，李恩民，许丽艳，李琳，等.α-奈胺分光光度法检测血清中一氧化氮含量.分析化学，1995，23(8)：979～980
4，Plque JM,Esplugnes JV,Whittle BJR,et al.Endogenous nitric oxide as a mediator of gastric mucosal vasodilatation during acid secretion. Gastroenterology,1992,102(1):168-174
收稿 1998-12-08, http://www.100md.com
单位：王天骄(基础医学院生物化学教研室)；李异玲(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)；王天骄(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)；傅宝玉(中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001)
关键词：一氧化氮；化学性肝纤维化；一氧化氮合成酶抑制剂
中国医科大学学报000122 摘要 目的：探讨一氧化氮(NO)在实验化学性肝纤维化中的作用。方法：选用Wistar纯系大白鼠，通过皮下注射四氯化碳复制肝纤维化动物模型。于注射12周后将已经发生肝纤维化的大白鼠随机分成两组，一组尾静脉注射NO合成酶抑制剂L-NAME，另一组注射生理盐水作为对照，4周后检测血清NO浓度及肝脏病理改变。结果：血清NO浓度在肝纤维化过程中呈升高趋势，尾静脉注射L-NAME后，血清NO浓度下降，病理检查提示L-NAME组较生理盐水对照组纤维组织增多，纤维间隔增宽。结论：NO不但参与了化学性肝纤维化过程，并在此过程中起到抑制纤维化发展的作用。
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Study on Nitric Oxide in Experimental Chemical Hepatic Fibrosis
Li Yiling Wang Tianjiao Fu Baoyu
(Department of Gastroenterology,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:This paper was designed to study the action of nitric oxide(NO) in experimental chemical hepatic fibrosis.Methods:Male Wistar rats with an average body weight of 100～120 g were used for the induction of liver fibrosis by subcutaneous injecting carbon tetrachloride(1.2 ml/kg).After 12 weeks,the rats were randomly divided into two groups,one group was injected with NO syntheses inhibitor L-NAME via tail vein,the other was injected with normal saline.Serum NO concentration was detected by α-naphthylamino spectrophotometry.Results:Serum NO rose in parallel with hepatic damage. After injecting L-NAME,serum NO concentration decreased markedly,pathology detection showed more fibrous tissue accumulated in the septa. Conclusion:The production of NO in chemical hepatic fibrosis can protect liver from damage.
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自从1987年发现内皮衍生舒张因子的本质是一氧化氮(nitric oxide,NO)以来[1]，NO在生物学界越来越引起重视。NO在许多疾病中发挥的血管舒张作用已得到认可。最近的研究发现，NO与肝细胞损伤亦有关，王根生[2]等研究表明NO在急性免疫性肝损伤中起保护作用，而在急性化学性肝损伤中作用甚微。本研究探讨NO在慢性化学性肝损伤——肝纤维化中的作用。为肝纤维化发病机理的研究及抗肝纤维化新药的研制提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：Wistar纯系大白鼠42只均为雄性，体重100～120 g。正常组7只，实验组35只，由中国医科大学实验动物部提供，分笼饲养，按昼夜时程及室温条件下，用平衡饲料喂养。
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1.1.2 试剂及设备：四氯化碳，α-奈胺盐酸盐，对氨基苯磺酸均为国产分析纯。NO合成酶抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲基乙酯(L-NAME，Sigma公
司)。氢氧化铝凝胶由1 mol/L硫酸铝与6 mol/L氢氧化钠等体积混合，离心洗涤后制成。仪器有日本岛津260分光光度仪，国产漩涡混匀器，低速离心机。
1.2 方法
1.2.1 实验化学性肝纤维化动物模型的制备：对于实验组动物，将40%四氯化碳花生油混合液按1.2 ml/kg皮下多点反复注射，每周2次，并于注射4、8、12周后分批处死动物，每次7只。12周后，将余下的大白鼠尾静脉分别注射L-NAME(25 mg/kg)及生理盐水，4周后处死，所有动物均颈静脉切开采血，剖腹取肝，进行检测。
1.2.2 NO水平的测定：参照文献[3]略加修改，用α-奈胺分光光度法检测血清NO含量：取新鲜血清0.6 ml，经氢氧化铝凝胶脱色后，依次加入3.2 mmol/L对氨基苯磺酸，3.2 mmol/L α-奈胺盐酸盐，0.1 mol/L乙酸钠各0.5 ml，30 min内，波长520 nm测定光密度值。
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2 结果
2.1 肝脏病理改变 正常：肝细胞以中央静脉为中心向外周呈放射状分布。4周：肝脏呈点状坏死，脂肪变性，空泡变性。8周：肝脏呈大片状坏死，纤维组织增生，但尚无完整纤维间隔形成。12周：纤维组织明显增多，形成较完整纤维间隔。
2.2 血清NO水平的变化 血清NO正常值为(16.2±1.4)μmol/L，注射四氯化碳4周后为(26.4±1.2)μmol/L，8周时为(37.3±1.9)μmol/L，12周时(54.8±1.5)μmol/L，较正常组明显增高(P<0.01)。尾静脉注射生理盐水4周后NO升为(42.2±1.1)μmol/L，尾静脉注射L-NAME 4周后，血清NO值为(17.5±1.4)μmol/L，较生理盐水组显著下降(P<0.01)。
尾静脉注射L-NAME后肝脏病理改变与生理盐水组相比，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，见图1、2。
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图1 尾静脉注射生理盐水4周后肝脏病理改变 ×10
Figure 1 Pathology of liver after injection of normal saline via tail vein(4 weeks) ×10
图2 尾静脉注射L-NAME 4周后肝脏病理改变 ×10
Figure 2 Pathology of liver after injection of L-NAME via tail vein (4 weeks) ×10
3 讨论
肝硬化严重威胁人类健康，而肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，它是在外界致炎因子的作用下，使胶原的生成与降解失衡，从而导致细胞外基质(ECM)的过度沉积，能否将病变终止于肝纤维化阶段，对于慢性肝病的防治，具有重大意义。
, 百拇医药
NO是一种新的细胞间信息交换的载体，广泛参与生理功能的调解。它在体内以左旋精氨酸为底物，在NO合成酶的作用下，脱去胍基末端氮原子而生成。NO与消化系统疾病关系密切，它可作为非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的一种递质，在胃肠道自主神经支配方面起主要作用。可调节胃粘膜血流，维持粘膜的完整性和防御能力[4]，促进溃疡的愈合，降低平滑肌张力。本实验通过皮下注射四氯化碳复制化学性肝纤维化动物模型，探讨NO在肝纤维化中的作用，结果表明，随着肝脏病理改变的加重，血清NO水平明显升高，由(16.2±1.4)μmol/L上升到(58.4±1.5)μmol/L，这一结果说明了NO在化学性肝纤维化中起到一定作用。为了研究其作用方式，对于已经发生肝纤维化的大白鼠，尾静脉给予NO合成酶抑制剂L-NAME 4周后，NO水平明显下降，降至(17.5±1.4)μmol/L，病理学检查发现使用抑制剂后，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，这一结果表明NO起到了抑制纤维化发展的作用，并且随着肝纤维化程度的加重，NO发挥的抗肝纤维化作用也越来越明显。生理盐水对照组，NO浓度降至(42.2±1.1)μmol/L，其病理改变较第12周减轻，说明NO水平与肝纤维化程度相平行。临床上需寻求提供NO的药物来抗肝纤维化，硝普钠、硝酸甘油能提供NO，乙酰胆碱能刺激内源性NO的释放，都有一定的应用前景。但对于NO的抗肝纤维化机制，有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Palmer RMT,Ferrige AG,Moncade S,et al.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor.Nature,1987,327(6122):524-526
2，王根生，刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用.中华医学杂志，1996，76(3)：203～206
3，李恩民，许丽艳，李琳，等.α-奈胺分光光度法检测血清中一氧化氮含量.分析化学，1995，23(8)：979～980
4，Plque JM,Esplugnes JV,Whittle BJR,et al.Endogenous nitric oxide as a mediator of gastric mucosal vasodilatation during acid secretion. Gastroenterology,1992,102(1):168-174
收稿 1998-12-08, http://www.100md.com