黑素瘤抑制蛋白MIA/CD-RAP在人乳腺癌组织中的表达
作者：高勇 贺祥 谢渭芬 王杰军 李舰
单位：高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；贺祥(科研部)；谢渭芬(长征医院消化内科)；李舰(长征医院消化内科)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；乳腺肿瘤
第二军医大学学报000129 中图分类号：R 737.9 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0090-01▲
黑素瘤抑制蛋白(MIA)是Bogdahn等1989年在研究黑素瘤细胞株HTZ-19时分离到的一个能够抑制黑素瘤细胞增殖的因子,其基因与在软骨细胞内发现的CD-RAP基因相同。在对转基因小鼠的研究中观察到，MIA主要在胚胎的软骨细胞内表达，但在乳腺胚胎发育过程中也有该基因的短暂表达，乳腺发育成熟后即消失。本研究采用分子生物学方法，观察该基因在人乳腺癌中的表达，现报告如下。
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1 材料和方法
经病理证实的乳腺浸润性导管腺癌手术标本7例，患者年龄45～68岁，平均(51.8±7.95)岁；2例雌、孕激素受体阴性，余均阳性；3例未绝经。乳腺良性病变3例，其中乳腺增生病1例，乳腺腺瘤2例，年龄分别为44，56，38岁。标本于液氮内保存。取50 mg肿瘤组织，在液氮内碾碎后，采用一步法抽提RNA(试剂全部来源于Promega)后进行RT-PCR。PCR引物均由中科院上海生化所合成，其中MIA：上游5′-CATCTTGCTGTCTGCCTTC-3′，下游5′-GATTTCTACTGCCAGTGAGC-3′；β-actin引物：上游5′-TCCTGAGGAGCA CCCCGTGC-3′，下游5′- CAACACAGTGCTGT CTGGTG-3′。反转录体系:5 μl RNA，4 μl 5× buffer，1 μl AMV(30 U)，1 μl RNAsin，1 μl dNTPs (10 mmol/L)，1 μl 随机引物，7 μl dH2O，46℃ 45 min。PCR体系: 5 μl 10×buffer，2 μl 模板cDNA，4 μl MgCl2，2 μl dNTPs (10 mmol/L)，1 μl 上游引物和1 μl下游引物，94℃ 5 min变性，随后加入1 μl Taq酶循环25～30次(以上试剂购于罗氏试剂公司)，具体为94℃ 30 s，58℃ 50 s，72℃ 60 s(PCR仪为Hybaid公司产品)，最后72℃ 10 min延伸。PCR产物经1.8%琼脂糖电泳观察。凝胶经扫描和计算机处理计算出每个条带的密度，并与β-actin比较得出MIA相对量。
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其余组织经甲醛固定、石蜡包埋、免疫组化研究。采用SABC法：切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加抗MIA的一抗工作液(抗-MIA单克隆抗体由美国华盛顿大学医学院Sandell博士惠赠)，37℃ 2 h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃ 20 min。TBS冲洗，DAB显色，苏木精轻度复染，脱水封片。
2 结果和讨论
7例乳腺癌标本均检测到MIA mRNA，其中4例扩增产物明显阳性(信号与β-actin相当)；3例乳腺良性肿瘤未检测到MIA mRNA。免疫组化结果：7例腺癌细胞质内呈明显阳性反应，而胞膜及胞核未被染色，间质细胞和正常组织均未检测到MIA，良性乳腺小叶增生和纤维腺瘤也未检测到MIA。表明MIA为一胞质内存在的分泌性蛋白，具有明显的肿瘤细胞特异性。
MIA是一种分泌性蛋白，正常情况下，该基因仅在胚胎软骨中表达，但恶性黑素瘤及软骨肉瘤可有高水平表达。1997年，美国AMC癌症研究中心利用差异显示法从两种小鼠乳腺癌模型上皮组织中均证实MIA mRNA的持续表达。1998年底，美国华盛顿大学医学院的谢渭芬博士研究CD-RAP转基因小鼠时，证实在正常小鼠的发育过程中，只有软骨组织和乳腺芽胚中才有该基因的丰富表达，而成熟的乳腺组织则无表达。本研究通过RT-PCR进一步证实乳腺导管腺癌组织内有MIA基因的高表达，而良性乳腺病变则没有。免疫组化研究表明，MIA蛋白主要在乳腺癌细胞的胞质内，其周围的基质细胞则没有。目前，还不能肯定MIA基因在乳腺癌或乳腺发育过程中的作用及与乳腺上皮细胞癌发生的关系，但MIA可能作为一个类似于甲胎蛋白的幼稚蛋白出现在乳腺组织的发育初期，随后停止转录和表达，当由于某种原因使乳腺上皮细胞发生癌变后，MIA基因重新激活转录并表达，由此推测MIA的作用可能与乳腺癌的生长有密切的关系。■
基金项目：国家“863”计划资助项目(102-10-04-03)
作者简介：高 勇(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：高勇(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；王杰军(第二军医大学长征医院肿瘤科，上海 200003)；贺祥(科研部)；谢渭芬(长征医院消化内科)；李舰(长征医院消化内科)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；乳腺肿瘤
第二军医大学学报000129 中图分类号：R 737.9 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0090-01▲
黑素瘤抑制蛋白(MIA)是Bogdahn等1989年在研究黑素瘤细胞株HTZ-19时分离到的一个能够抑制黑素瘤细胞增殖的因子,其基因与在软骨细胞内发现的CD-RAP基因相同。在对转基因小鼠的研究中观察到，MIA主要在胚胎的软骨细胞内表达，但在乳腺胚胎发育过程中也有该基因的短暂表达，乳腺发育成熟后即消失。本研究采用分子生物学方法，观察该基因在人乳腺癌中的表达，现报告如下。
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1 材料和方法
经病理证实的乳腺浸润性导管腺癌手术标本7例，患者年龄45～68岁，平均(51.8±7.95)岁；2例雌、孕激素受体阴性，余均阳性；3例未绝经。乳腺良性病变3例，其中乳腺增生病1例，乳腺腺瘤2例，年龄分别为44，56，38岁。标本于液氮内保存。取50 mg肿瘤组织，在液氮内碾碎后，采用一步法抽提RNA(试剂全部来源于Promega)后进行RT-PCR。PCR引物均由中科院上海生化所合成，其中MIA：上游5′-CATCTTGCTGTCTGCCTTC-3′，下游5′-GATTTCTACTGCCAGTGAGC-3′；β-actin引物：上游5′-TCCTGAGGAGCA CCCCGTGC-3′，下游5′- CAACACAGTGCTGT CTGGTG-3′。反转录体系:5 μl RNA，4 μl 5× buffer，1 μl AMV(30 U)，1 μl RNAsin，1 μl dNTPs (10 mmol/L)，1 μl 随机引物，7 μl dH2O，46℃ 45 min。PCR体系: 5 μl 10×buffer，2 μl 模板cDNA，4 μl MgCl2，2 μl dNTPs (10 mmol/L)，1 μl 上游引物和1 μl下游引物，94℃ 5 min变性，随后加入1 μl Taq酶循环25～30次(以上试剂购于罗氏试剂公司)，具体为94℃ 30 s，58℃ 50 s，72℃ 60 s(PCR仪为Hybaid公司产品)，最后72℃ 10 min延伸。PCR产物经1.8%琼脂糖电泳观察。凝胶经扫描和计算机处理计算出每个条带的密度，并与β-actin比较得出MIA相对量。
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其余组织经甲醛固定、石蜡包埋、免疫组化研究。采用SABC法：切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加抗MIA的一抗工作液(抗-MIA单克隆抗体由美国华盛顿大学医学院Sandell博士惠赠)，37℃ 2 h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃ 20 min。TBS冲洗，DAB显色，苏木精轻度复染，脱水封片。
2 结果和讨论
7例乳腺癌标本均检测到MIA mRNA，其中4例扩增产物明显阳性(信号与β-actin相当)；3例乳腺良性肿瘤未检测到MIA mRNA。免疫组化结果：7例腺癌细胞质内呈明显阳性反应，而胞膜及胞核未被染色，间质细胞和正常组织均未检测到MIA，良性乳腺小叶增生和纤维腺瘤也未检测到MIA。表明MIA为一胞质内存在的分泌性蛋白，具有明显的肿瘤细胞特异性。
MIA是一种分泌性蛋白，正常情况下，该基因仅在胚胎软骨中表达，但恶性黑素瘤及软骨肉瘤可有高水平表达。1997年，美国AMC癌症研究中心利用差异显示法从两种小鼠乳腺癌模型上皮组织中均证实MIA mRNA的持续表达。1998年底，美国华盛顿大学医学院的谢渭芬博士研究CD-RAP转基因小鼠时，证实在正常小鼠的发育过程中，只有软骨组织和乳腺芽胚中才有该基因的丰富表达，而成熟的乳腺组织则无表达。本研究通过RT-PCR进一步证实乳腺导管腺癌组织内有MIA基因的高表达，而良性乳腺病变则没有。免疫组化研究表明，MIA蛋白主要在乳腺癌细胞的胞质内，其周围的基质细胞则没有。目前，还不能肯定MIA基因在乳腺癌或乳腺发育过程中的作用及与乳腺上皮细胞癌发生的关系，但MIA可能作为一个类似于甲胎蛋白的幼稚蛋白出现在乳腺组织的发育初期，随后停止转录和表达，当由于某种原因使乳腺上皮细胞发生癌变后，MIA基因重新激活转录并表达，由此推测MIA的作用可能与乳腺癌的生长有密切的关系。■
基金项目：国家“863”计划资助项目(102-10-04-03)
作者简介：高 勇(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-10-25, 百拇医药