唾液酸8,9-二硫酸酯衍生物的合成及唾液酸酶抑制活性
作者：李文姬 崔浩 李绍顺
单位：李文姬(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433)；李绍顺(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433)；崔浩(军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：唾液酸衍生物；硫酸酯化；唾液酸酶活性
第二军医大学学报000118 摘 要：目的：合成2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸8,9-二硫酸酯衍生物，并探讨其与唾液酸酶抑制活性的关系。方法：在对4,7-二羟基保护后，用三氧化硫三甲胺[SO3。N(CH3)3]对8,9-二羟基进行硫酸酯化, 并对化合物(3), (4)，(5)，(6)进行初步唾液酸酶抑制活性试验。结果和结论：合成了4个结构全新的唾液酸8,9-二硫酰氧基衍生物，其结构均得到1HNMR, MS 确证; 合成的唾液酸硫酸酯衍生物均具有较强的唾液酸酶抑制活性，提示唾液酸衍生物的分子结构中含有的硫酰氧基可增强其抗病毒活性。
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中图分类号：R 962 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0056-03
Synthesis of 8,9-disulfates derivatives from sialic acid and sialidase inhibitory activities
LI Wen-Ji
(Department of Pharmacology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Shao-Shun(Department of Pharmacology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, http://www.100md.com
CUI Hao
(Institute of Radiant Medicine, Academic Military Medical Sciences)
ABSTRACT：Objective：To synthesize 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-8,9-O-disulfoneuraminic acid and investigate the relationship between the sulfate group in the sialic acid derivatives and their sialidase inhibitory activities. Methods: The title compound was synthesized by sulfation using sulfur trioxide-trimethyl amine complex after protecting 4,7-dihydroxyl groups with acetic anhydride. Results and Conclusion: The 4 derivatives of 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-8,9-O-disulfoneuraminic acid were synthesized. Their structures were confirmed by 1HNMR and MS spectrum. The behavior of compounds (3), (4), (5), (6) towards sialidase had been investigated. All of these sulfated derivatives of sialic acid possessed potent sialidase inhibitory activities. This suggested that the sulfate group in the compounds might enhance their antiviral activities.
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KEY WORDS：sialic acid derivatives; sulfation; sialidase activity▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 56-58]
唾液酸是一类广泛存在于自然界的壬糖酸，包括20多种分别在氨基上带有乙酰基、羟乙酰基和在众多的羟基上带有乙酰基、甲基或磺酰基的天然唾液酸衍生物，其中2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰基神经氨酸(2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl neuraminic acid, Neu5Ac2en)是一类重要的唾液酸衍生物。其晶体X-射线衍射研究表明，Neu5Ac2en分子立体结构与唾液酸酶活性位点空间结构相匹配,具有较强的唾液酸酶抑制活性[1]。因此，围绕Neu5Ac2en研究寻找有效的抗病毒活性物质已成为新的研究热点。澳大利亚墨尔本大学的Itzstein教授等[1，2]研究合成的4-胍基-Neu5Ac2en即GG167已以商品名Zananivir进入Ⅳ期临床试验，用于病毒性流感的防治，初步疗效良好，且无明显的不良反应。
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Kubo等[3]从海胆卵等组织分离出的唾液酰神经鞘氨脂中发现存在N-羟乙酰基-8-O-磺酰基神经氨酸，引起人们对唾液酸硫酸酯类衍生物研究的兴趣； Tanaka等[4]合成了N-羟乙酰基-8-O-磺酰基神经氨酸。已有研究表明，糖类硫酸酯化可增强其抗病毒活性，且SO42-为必需基团[5]；同时，抗病毒谱增广，一些硫酸酯化多糖表现出良好的抗AIDS病毒活性[6]。我们在以往对Neu5Ac2en的硫酸酯化研究中，利用4-OH，7-OH空间位阻的差异，对4-OH, 7-OH进行了选择性的硫酸酯化[7]，并发现4-OH硫酸酯衍生物的唾液酸酶抑制活性比Neu5Ac2en有所增强。在此基础上，本研究从Neu5Ac2en甲酯出发，合成了唾液酸8,9-二羟基硫酸酯化合物，并初步进行了体外抑制唾液酸酶活性实验。
1 材料和方法
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1.1 材料和仪器 唾液酸由日本北里大学药学部提供；Neu5Ac2en甲酯(1)、化合物(2)和三氧化硫三甲胺复合物[SO3N(CH3)3]的制备按文献[8]的方法；GF254薄层层析板自制；所用试剂均为分析纯；熔点用毛细管法测定，温度计未校正；红外光谱用Bio-RAD FTS-185型红外光谱仪测定;质谱用Finnigam MATS430型质谱仪测定; 1HNMR用AC-P300c(300 MHz)型核磁共振仪测定。唾液酸酶(vibrio cholerea)购自Calbiochem公司；牛血清蛋白购自Merck公司；Mu-Neu5Ac(底物) 购自Sigma公司； 荧光测定仪为岛津RF-510。
1.2 合成方法和路线 唾液酸8,9-二硫酸酯化的合成路线见图1。
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图1 唾液酸8，9-二硫酸酯衍生物的合成
Fig 1 Synthesis of 8,9-disulfoneuraminic acid derivatives
1.2.1 8, 9-二硫酸酯基-4, 7-O-二乙酰基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(3)的制备 化合物(2) 45.0 mg(0.12 mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)1 ml中，加入干燥0.4 nm分子筛粉末250 mg，通入氮气30 min，搅拌下加入SO3-N(CH3)3 230 mg(1.5 mmol)，室温搅拌24 h。加入三乙胺2 ml，搅拌30 min。过滤，减压蒸干，加入少量甲醇溶解，TLC分离，展开剂氯仿∶甲醇(4∶1)，用甲醇洗脱。蒸除甲醇, 得无色油状物70.0 mg，收率80.6%。MS(FAB) m/z:752(M++1)；1HNMR (CD3OD) δ: 7.15 (1H, d, JNH,5=9.3 Hz, NH), 5.90(1H, d, J3,4=2.5 Hz, 3-H), 5.55(2H, m, 4,7-H)， 4.95(1H, dd, J8,7=4.8 Hz, J8,9=9.4 Hz, 8-H), 4.61(1H, dd, J6,7=2.0 Hz, J6,5=10.4 Hz, 6-H), 4.47(1H, dd, J9′，8=2.0 Hz, J9′，9=10.4 Hz, 9′-H), 4.34(1H, dd, J9,8=9.3 Hz, J9,9′=10.3 Hz, 9-H), 4.14～4.08(1H, m, 5-H), 3.76(3H, s, -COOCH3), 1.91(3H, s, -COCH3)。
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1.2.2 8,9-二硫酸酯基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(4)和8,9-二硫酸酯基-7-O-乙酰基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(5)的制备 化合物(3)30.0 mg(0.04 mmol) 溶于无水甲醇5 ml，冰浴冷至0℃，滴加甲醇钠1 ml(0.43 mmol/L)，并于0℃搅拌反应30 min，加入酸性树脂中和至pH 6～7，滤除树脂，加入三乙胺1 ml搅拌30 min，减压蒸干。TLC分离，展开剂为氯仿∶甲醇(2∶1)，用甲醇洗脱，得无色油状化合物(4)15 mg，收率56.7%。MS(FAB) m/z: 668(M++1)； 1HNMR(CD3OD)δ: 5.88(1H, d, J3,4=2.4 Hz, 3-H), 4.75(1H, dd, J8,9′=1.9 Hz, J8,9=10.8 Hz, 8-H), 4.58(1H, dd, J9′，8=1.9 Hz, J9′,9=10.5 Hz, 9′-H),4.38～4.34(2H,m,4,9-H),4.21(1H, d, J6,5=10.7 Hz, 6-H), 4.11(1H, dd, J5,4=8.6 Hz, J5,6=10.8 Hz, 5-H), 3.95(1H, d, J7,6=8.7 Hz, 7-H), 3.76(3H, s, -COOCH3), 3.20[12H, q, N(CH2CH3)3], 2.06(3H, s, -COCH3)， 1.29[18H, t, N(CH2CH3)3] 。得化合物(5)5 mg，收率17.6%。MS(FAB) m/z: 710(M++1) ； 1HNMR(CD3OD)δ:5.94(1H, d, J3,4=2.5 Hz, 3-H), 5.40(1H, dd, J7,6=1.9 Hz, J7,8=7.4 Hz, 7-H), 4.99(1H, ddd, J8,7=1.9 Hz, J8, 9′=4.7 Hz, J8,9=10.8 Hz, 8-H), 4.40(1H, dd, J6,7=1.9 Hz, J6,5=10.6 Hz, 6-H), 4.32(1H, dd, J9′,8=4.8 Hz, J9′,9=10.7 Hz, 9′-H) 4.27(1H, dd, J4,3=2.5 Hz, J4,5=8.7 Hz, 4-H), 4.19(1H, dd, J9,8=10.6 Hz, J9, 9′=10.8 Hz, 9-H), 4.05(1H, dd, J5,4=8.5 Hz, J5,6=10.6 Hz, 5-H), 3.78(3H, s,-COOCH3)，2.05 (3H, s, -NHCOCH3), 1.93 (3H, s, COCH3)。
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1.2.3 8,9-二硫酸酯基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸三钠盐(6)的制备 化合物(3)30 mg(0.04 mmol)溶于5 ml 0.1 mol/L NaOH 溶液，室温搅拌14 h，加入酸性树脂中和至pH 6～7，过滤，母液冷冻干燥得白色粉末15.5 mg，收率74.9%。MS(FAB)m/z:518(M++1)； 1HNMR(CD3OD)δ: 5.64(1H, d, J3,4=2.1 Hz, 3-H), 4.71(1H, ddd, J8,7=2.2 Hz, J8,9=2.6 Hz, J8, 9′=9.0 Hz, 8-H), 4.51(1H, dd, J9,8=2.6 Hz, J9, 9′=10.9 Hz, 9-H), 4.40(1H, dd, J9′,8=2.2 Hz, J9′,9=10.9 Hz, 9′-H), 4.31(1H, dd, J4,3=2.1 Hz, J4,5=8.4 Hz, 4-H), 4.16(1H, d, J5,6=10.8 Hz, 6-H), 4.05(1H, dd, J5,4=8.5 Hz, J5,6=10.6 Hz, 5-H), 3.81(1H,d, J7,6=9.04 Hz, 7-H), 3.39(3H, s, -COCH3) 2.02(3H, s, -COOCH3)。
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1.3 生物活性测定
1.3.1 酶制备液 将100 mU的酶溶于含有0.5 mmol的CaCl2和0.1 mg/ml牛血清蛋白(pH 5.5)的10 ml 0.1 mol/L乙酸盐缓冲液中制得。
1.3.2 孵化 将含有0.2 mU的酶(20 μl酶制备液)，0.5 mmol的CaCl2, 2.0×10-1 mol的Mu-Neu5Ac，0.1 mol/L乙酸盐缓冲液，pH为5.5的100 ml孵化液, 于37℃孵化反应15 min，加入900 μl甘氨酸缓冲液pH为10 (0.042 mol Na2CO3, 0.06 mol NaCl和0.133 mol甘氨酸)，终止反应。在激发波长365 nm，发射波长450 nm处用荧光法测定游离的甲基伞形酮(methylumbelliferon)的含量。
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1.3.3 抑制剂Ki值的计算 在各种浓度的抑制剂存在下孵化不同浓度的Mu-Neu5Ac (0.5×10-4～4×10-4 mol/L)。将反应速率的倒数对Mu-Neu5Ac2en(底物, Sigma)浓度的倒数作图(Linweaever-Burk plot)，再将所得到的斜率对抑制剂浓度作图，得到线性回归曲线，由此曲线外推至X轴交点即为抑制剂的Ki值。
2 结果和讨论
首先将2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰基神经氨酸甲酯(1)的8,9-位羟基用缩丙酮保护后，将4,7-位羟基乙酰化，然后在酸性条件下水解掉8,9-位保护基，进行硫酸酯化，得到化合物(3)，最后，经醇解和水解得到化合物(4)，(5)，(6)3个新化合物。在醇解反应中，由于化合物(3)的4,7-位乙酰基的空间位阻不同，低温短时间反应，得到4,7-位二乙酰基水解产物(4)和4-位乙酰基水解产物(5)，延长反应时间，则4,7-位乙酰基均水解得到单一产物(4)。
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所合成的化合物结构均经过1HNMR和 MS(FAB) 或MS(EI)的确证，其中化合物(3)，(4), (5)，(6)为新化合物, 已进行了初步的体外唾液酸酶抑制活性实验。从抑制酶活性实验结果看, 化合物(3), (5)的抑酶活性不如母体化合物, 化合物(4)与母体化合物相当, 化合物(6)是母体化合物的两倍, 即比母体化合物略强， 也即, 化合物(1)的8,9-位羟基硫酸酯化后，所得化合物具有较强的酶抑制活性；经碱水解后，1-位羧基、4,7-位羟基游离状态下酶抑制活性更强，这可能与化合物分子的羧基、羟基处于游离状态时，分子与酶结合更易、更紧密有关。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570837)
作者简介：李文姬(1969～)，女(汉族)，博士
参考文献：
[1]von Itzstein M, Wu WY, Kok GB, et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication[J]. Nature, 1993, 363(6428):418-423.
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[2]Service RF. Researchers seek new weapon against the Flu[J]. Science, 1997, 275(5301): 756-757.
[3]Kubo H, Irie A, Inagaki F, et al. Gangliosides from the eggs of the sea urchin, Anthocidaris crassispina. J Biochem, 1990, 108(2): 185-192.
[4]Tanaka M, Kai T, Sun XL, et al. Synthesis of N-glycolyl-8-O-sulfoneuraminic acid[J]. Chem Pharm Bull, 1995, 43(12):2095-2098.
[5]田庚元，李寿桐，宋麦丽, 等. 牛膝多糖硫酸酯的合成及其抗病毒活性[J]. 药学学报，1995，30(2):107-111.
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[6]向道斌， 李晓玉. 硫酸化多糖：一类治疗AIDS的新药[J]. 国外医学。药学分册，1992，19(1):1-5.
[7]崔 浩， 李文姬，李绍顺. 唾液酸衍生物的立体选择性硫酸酯化[J]. 第二军医大学学报， 1998，19(4):381-383.
[8]李绍顺，崔 浩，小仓治夫. 唾液酸衍生物的合成及生物活性研究.Ⅰ.2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰基神经氨酸的合成[J]. 中国药物化学杂志， 1997, 7(3): 167-170.
收稿日期：1999-08-23
修回日期：1999-12-05, 百拇医药
单位：李文姬(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433)；李绍顺(第二军医大学基础医学部药理学教研室，上海 200433)；崔浩(军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：唾液酸衍生物；硫酸酯化；唾液酸酶活性
第二军医大学学报000118 摘 要：目的：合成2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸8,9-二硫酸酯衍生物，并探讨其与唾液酸酶抑制活性的关系。方法：在对4,7-二羟基保护后，用三氧化硫三甲胺[SO3。N(CH3)3]对8,9-二羟基进行硫酸酯化, 并对化合物(3), (4)，(5)，(6)进行初步唾液酸酶抑制活性试验。结果和结论：合成了4个结构全新的唾液酸8,9-二硫酰氧基衍生物，其结构均得到1HNMR, MS 确证; 合成的唾液酸硫酸酯衍生物均具有较强的唾液酸酶抑制活性，提示唾液酸衍生物的分子结构中含有的硫酰氧基可增强其抗病毒活性。
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中图分类号：R 962 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0056-03
Synthesis of 8,9-disulfates derivatives from sialic acid and sialidase inhibitory activities
LI Wen-Ji
(Department of Pharmacology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Shao-Shun(Department of Pharmacology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
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CUI Hao
(Institute of Radiant Medicine, Academic Military Medical Sciences)
ABSTRACT：Objective：To synthesize 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-8,9-O-disulfoneuraminic acid and investigate the relationship between the sulfate group in the sialic acid derivatives and their sialidase inhibitory activities. Methods: The title compound was synthesized by sulfation using sulfur trioxide-trimethyl amine complex after protecting 4,7-dihydroxyl groups with acetic anhydride. Results and Conclusion: The 4 derivatives of 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-8,9-O-disulfoneuraminic acid were synthesized. Their structures were confirmed by 1HNMR and MS spectrum. The behavior of compounds (3), (4), (5), (6) towards sialidase had been investigated. All of these sulfated derivatives of sialic acid possessed potent sialidase inhibitory activities. This suggested that the sulfate group in the compounds might enhance their antiviral activities.
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KEY WORDS：sialic acid derivatives; sulfation; sialidase activity▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 56-58]
唾液酸是一类广泛存在于自然界的壬糖酸，包括20多种分别在氨基上带有乙酰基、羟乙酰基和在众多的羟基上带有乙酰基、甲基或磺酰基的天然唾液酸衍生物，其中2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰基神经氨酸(2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl neuraminic acid, Neu5Ac2en)是一类重要的唾液酸衍生物。其晶体X-射线衍射研究表明，Neu5Ac2en分子立体结构与唾液酸酶活性位点空间结构相匹配,具有较强的唾液酸酶抑制活性[1]。因此，围绕Neu5Ac2en研究寻找有效的抗病毒活性物质已成为新的研究热点。澳大利亚墨尔本大学的Itzstein教授等[1，2]研究合成的4-胍基-Neu5Ac2en即GG167已以商品名Zananivir进入Ⅳ期临床试验，用于病毒性流感的防治，初步疗效良好，且无明显的不良反应。
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Kubo等[3]从海胆卵等组织分离出的唾液酰神经鞘氨脂中发现存在N-羟乙酰基-8-O-磺酰基神经氨酸，引起人们对唾液酸硫酸酯类衍生物研究的兴趣； Tanaka等[4]合成了N-羟乙酰基-8-O-磺酰基神经氨酸。已有研究表明，糖类硫酸酯化可增强其抗病毒活性，且SO42-为必需基团[5]；同时，抗病毒谱增广，一些硫酸酯化多糖表现出良好的抗AIDS病毒活性[6]。我们在以往对Neu5Ac2en的硫酸酯化研究中，利用4-OH，7-OH空间位阻的差异，对4-OH, 7-OH进行了选择性的硫酸酯化[7]，并发现4-OH硫酸酯衍生物的唾液酸酶抑制活性比Neu5Ac2en有所增强。在此基础上，本研究从Neu5Ac2en甲酯出发，合成了唾液酸8,9-二羟基硫酸酯化合物，并初步进行了体外抑制唾液酸酶活性实验。
1 材料和方法
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1.1 材料和仪器 唾液酸由日本北里大学药学部提供；Neu5Ac2en甲酯(1)、化合物(2)和三氧化硫三甲胺复合物[SO3N(CH3)3]的制备按文献[8]的方法；GF254薄层层析板自制；所用试剂均为分析纯；熔点用毛细管法测定，温度计未校正；红外光谱用Bio-RAD FTS-185型红外光谱仪测定;质谱用Finnigam MATS430型质谱仪测定; 1HNMR用AC-P300c(300 MHz)型核磁共振仪测定。唾液酸酶(vibrio cholerea)购自Calbiochem公司；牛血清蛋白购自Merck公司；Mu-Neu5Ac(底物) 购自Sigma公司； 荧光测定仪为岛津RF-510。
1.2 合成方法和路线 唾液酸8,9-二硫酸酯化的合成路线见图1。
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图1 唾液酸8，9-二硫酸酯衍生物的合成
Fig 1 Synthesis of 8,9-disulfoneuraminic acid derivatives
1.2.1 8, 9-二硫酸酯基-4, 7-O-二乙酰基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(3)的制备 化合物(2) 45.0 mg(0.12 mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)1 ml中，加入干燥0.4 nm分子筛粉末250 mg，通入氮气30 min，搅拌下加入SO3-N(CH3)3 230 mg(1.5 mmol)，室温搅拌24 h。加入三乙胺2 ml，搅拌30 min。过滤，减压蒸干，加入少量甲醇溶解，TLC分离，展开剂氯仿∶甲醇(4∶1)，用甲醇洗脱。蒸除甲醇, 得无色油状物70.0 mg，收率80.6%。MS(FAB) m/z:752(M++1)；1HNMR (CD3OD) δ: 7.15 (1H, d, JNH,5=9.3 Hz, NH), 5.90(1H, d, J3,4=2.5 Hz, 3-H), 5.55(2H, m, 4,7-H)， 4.95(1H, dd, J8,7=4.8 Hz, J8,9=9.4 Hz, 8-H), 4.61(1H, dd, J6,7=2.0 Hz, J6,5=10.4 Hz, 6-H), 4.47(1H, dd, J9′，8=2.0 Hz, J9′，9=10.4 Hz, 9′-H), 4.34(1H, dd, J9,8=9.3 Hz, J9,9′=10.3 Hz, 9-H), 4.14～4.08(1H, m, 5-H), 3.76(3H, s, -COOCH3), 1.91(3H, s, -COCH3)。
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1.2.2 8,9-二硫酸酯基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(4)和8,9-二硫酸酯基-7-O-乙酰基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸甲酯三乙胺盐(5)的制备 化合物(3)30.0 mg(0.04 mmol) 溶于无水甲醇5 ml，冰浴冷至0℃，滴加甲醇钠1 ml(0.43 mmol/L)，并于0℃搅拌反应30 min，加入酸性树脂中和至pH 6～7，滤除树脂，加入三乙胺1 ml搅拌30 min，减压蒸干。TLC分离，展开剂为氯仿∶甲醇(2∶1)，用甲醇洗脱，得无色油状化合物(4)15 mg，收率56.7%。MS(FAB) m/z: 668(M++1)； 1HNMR(CD3OD)δ: 5.88(1H, d, J3,4=2.4 Hz, 3-H), 4.75(1H, dd, J8,9′=1.9 Hz, J8,9=10.8 Hz, 8-H), 4.58(1H, dd, J9′，8=1.9 Hz, J9′,9=10.5 Hz, 9′-H),4.38～4.34(2H,m,4,9-H),4.21(1H, d, J6,5=10.7 Hz, 6-H), 4.11(1H, dd, J5,4=8.6 Hz, J5,6=10.8 Hz, 5-H), 3.95(1H, d, J7,6=8.7 Hz, 7-H), 3.76(3H, s, -COOCH3), 3.20[12H, q, N(CH2CH3)3], 2.06(3H, s, -COCH3)， 1.29[18H, t, N(CH2CH3)3] 。得化合物(5)5 mg，收率17.6%。MS(FAB) m/z: 710(M++1) ； 1HNMR(CD3OD)δ:5.94(1H, d, J3,4=2.5 Hz, 3-H), 5.40(1H, dd, J7,6=1.9 Hz, J7,8=7.4 Hz, 7-H), 4.99(1H, ddd, J8,7=1.9 Hz, J8, 9′=4.7 Hz, J8,9=10.8 Hz, 8-H), 4.40(1H, dd, J6,7=1.9 Hz, J6,5=10.6 Hz, 6-H), 4.32(1H, dd, J9′,8=4.8 Hz, J9′,9=10.7 Hz, 9′-H) 4.27(1H, dd, J4,3=2.5 Hz, J4,5=8.7 Hz, 4-H), 4.19(1H, dd, J9,8=10.6 Hz, J9, 9′=10.8 Hz, 9-H), 4.05(1H, dd, J5,4=8.5 Hz, J5,6=10.6 Hz, 5-H), 3.78(3H, s,-COOCH3)，2.05 (3H, s, -NHCOCH3), 1.93 (3H, s, COCH3)。
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1.2.3 8,9-二硫酸酯基-2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰神经氨酸三钠盐(6)的制备 化合物(3)30 mg(0.04 mmol)溶于5 ml 0.1 mol/L NaOH 溶液，室温搅拌14 h，加入酸性树脂中和至pH 6～7，过滤，母液冷冻干燥得白色粉末15.5 mg，收率74.9%。MS(FAB)m/z:518(M++1)； 1HNMR(CD3OD)δ: 5.64(1H, d, J3,4=2.1 Hz, 3-H), 4.71(1H, ddd, J8,7=2.2 Hz, J8,9=2.6 Hz, J8, 9′=9.0 Hz, 8-H), 4.51(1H, dd, J9,8=2.6 Hz, J9, 9′=10.9 Hz, 9-H), 4.40(1H, dd, J9′,8=2.2 Hz, J9′,9=10.9 Hz, 9′-H), 4.31(1H, dd, J4,3=2.1 Hz, J4,5=8.4 Hz, 4-H), 4.16(1H, d, J5,6=10.8 Hz, 6-H), 4.05(1H, dd, J5,4=8.5 Hz, J5,6=10.6 Hz, 5-H), 3.81(1H,d, J7,6=9.04 Hz, 7-H), 3.39(3H, s, -COCH3) 2.02(3H, s, -COOCH3)。
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1.3 生物活性测定
1.3.1 酶制备液 将100 mU的酶溶于含有0.5 mmol的CaCl2和0.1 mg/ml牛血清蛋白(pH 5.5)的10 ml 0.1 mol/L乙酸盐缓冲液中制得。
1.3.2 孵化 将含有0.2 mU的酶(20 μl酶制备液)，0.5 mmol的CaCl2, 2.0×10-1 mol的Mu-Neu5Ac，0.1 mol/L乙酸盐缓冲液，pH为5.5的100 ml孵化液, 于37℃孵化反应15 min，加入900 μl甘氨酸缓冲液pH为10 (0.042 mol Na2CO3, 0.06 mol NaCl和0.133 mol甘氨酸)，终止反应。在激发波长365 nm，发射波长450 nm处用荧光法测定游离的甲基伞形酮(methylumbelliferon)的含量。
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1.3.3 抑制剂Ki值的计算 在各种浓度的抑制剂存在下孵化不同浓度的Mu-Neu5Ac (0.5×10-4～4×10-4 mol/L)。将反应速率的倒数对Mu-Neu5Ac2en(底物, Sigma)浓度的倒数作图(Linweaever-Burk plot)，再将所得到的斜率对抑制剂浓度作图，得到线性回归曲线，由此曲线外推至X轴交点即为抑制剂的Ki值。
2 结果和讨论
首先将2-去氧-2,3-去氢-N-乙酰基神经氨酸甲酯(1)的8,9-位羟基用缩丙酮保护后，将4,7-位羟基乙酰化，然后在酸性条件下水解掉8,9-位保护基，进行硫酸酯化，得到化合物(3)，最后，经醇解和水解得到化合物(4)，(5)，(6)3个新化合物。在醇解反应中，由于化合物(3)的4,7-位乙酰基的空间位阻不同，低温短时间反应，得到4,7-位二乙酰基水解产物(4)和4-位乙酰基水解产物(5)，延长反应时间，则4,7-位乙酰基均水解得到单一产物(4)。
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所合成的化合物结构均经过1HNMR和 MS(FAB) 或MS(EI)的确证，其中化合物(3)，(4), (5)，(6)为新化合物, 已进行了初步的体外唾液酸酶抑制活性实验。从抑制酶活性实验结果看, 化合物(3), (5)的抑酶活性不如母体化合物, 化合物(4)与母体化合物相当, 化合物(6)是母体化合物的两倍, 即比母体化合物略强， 也即, 化合物(1)的8,9-位羟基硫酸酯化后，所得化合物具有较强的酶抑制活性；经碱水解后，1-位羧基、4,7-位羟基游离状态下酶抑制活性更强，这可能与化合物分子的羧基、羟基处于游离状态时，分子与酶结合更易、更紧密有关。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570837)
作者简介：李文姬(1969～)，女(汉族)，博士
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收稿日期：1999-08-23
修回日期：1999-12-05, 百拇医药