检测抗P53蛋白抗体ABC-ELISA法的建立和初步临床应用
作者：郭品娥 沈茜 吴月琴
单位：郭品娥(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)；沈茜(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)；吴月琴(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)
关键词：抗体；抗P53蛋白；荧光抗体技术；肿瘤标志物
摘 要摘 要：目的：建立检测抗P53蛋白抗体的ABC-ELISA法，并进行初步临床应用的总结。方法：用人工合成P53蛋白N端25个氨基酸肽链为抗原，建立了敏感的亲和素-生物素ELISA法，240份肿瘤患者和100份正常人血清抗P53蛋白抗体，用免疫组化检测肿瘤细胞内P53蛋白表达情况。结果：肿瘤患者血清抗P53蛋白抗体阳性率分别为：结直肠癌22%、肺癌34%、乳腺癌25%、胃癌36%、原发性肝癌32%；而正常人血清中抗P53蛋白抗体的阳性率≤2%。对20份肿瘤组织进行免疫组化检测,肿瘤细胞内P53蛋白阳性率为60%。此外，用Pharma-Cell试剂盒检测90份结直肠癌患者和乳腺癌患者血清，结果与ABC-ELISA法无统计学差异(P>0.05)。结论：抗P53蛋白抗体在肿瘤患者中检出率显著高于正常人群，它可以作为一种新的肿瘤标志物，对肿瘤的诊断起到辅助作用。
, 百拇医药
中图分类号：R 730.45 文献标识码： A
文章编号：0258-879X(2000)01-0053-03
Development of ABC-ELISA method for detecting anti-P53-antibodies and its primary clinical application
GUO Pin-E
(Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
SHEN Qian
, 百拇医药 (Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WU Yue-Qin (Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective: To develop ABC-ELISA for detecting antibodies of P53 protein (P53-Abs) and evaluate the significance of P53 with the pathalogical stage and the prognosis of tumor. Methods: Serum P53-Abs were detected in 240 tumor patients and 100 normal adults by ABC-ELISA. Expression of P53 in the solid tumor was examined by immunohistochemisty. Results: The positive rate of serum P53-Abs from the normal subjects was ≤2%. The positive rates of serum P53-Abs from the patients with tumors were obviously different according to the origin of tumor and its pathological stage. The positive rates of colorectal cacinoma, lung cancer, breast cancer, stomach cancer,primary liver cancer were 22%,34%,25%,36%,32%，respectively. Expression of P53 in 20 solid tumor specimens was assessed by immunohistochemistry and the positive rate was 60%.We also detected serum p53-Abs in 90 patients with colorectal cacinoma and breast cancer by Pharma-Cell detecting kit.There was no significant difference between these 2 methods(P>0.05). Conclusion：This study shows that the positive rate of P53-Abs expression in solid tumor is significant higher than that in normal adult. It may become a new diagnostic indicator of tumor.
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KEY WORDS：antibodies, anti-P53; fluorescent antibody technique; tumor marker▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 53-55]
肿瘤是严重危害人类健康的恶性疾病。在我国，肿瘤的发病率逐年升高，已成为我国男性死亡的第二大因素，女性死亡的第三大因素。因此肿瘤的早期诊断、治疗和预后判断一直是临床医师密切关注的焦点。近年来发现P53抑癌基因的突变在恶性肿瘤中最为常见，其肿瘤突变率可达40%～80%[1，2]。P53抑癌基因的突变常引起P53蛋白空间构象的改变，以致它的半衰期从原来的20 min延长到几小时，造成突变P53蛋白在细胞内大量积聚。这种突变的P53蛋白失去了抑制细胞生长的功能，因而与肿瘤的发生密切相关，并诱导机体产生抗P53蛋白的特异性抗体[3]。本研究用合成的P53多肽为抗原，建立敏感的亲和素-生物素抗P53蛋白抗体的ELISA法。同时对临床上常见肿瘤患者进行了检测，并结合临床病理资料，探讨P53蛋白抗体检测对诊断和疗效观察的意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源 取自临床上经病理检查证实的肿瘤患者血清240份，其中结直肠癌50份、胃癌50份、乳腺癌40份、肺癌50份、原发性肝癌50份；正常人血清100份，贮存于-20℃，待用。
1.2 P53抗原多肽 选择P53蛋白N端25个氨基酸为合成抗原，由美国赛百盛公司合成，纯度>98%。进行同源性比较，其同源性为100%。
1.3 生物素标记P53多肽抗原 亲和素购自华美生物试剂公司；酯化生物素由中国人民解放军海军医学研究所提供。按1 mg酯化生物素与1 mg P53抗原的比例混匀，放37℃水箱1 h，装入透析袋用PBS缓冲液透析，每隔2～3 h换水，共5次。取出分装保存备用。
1.4 亲和素-生物素抗P53蛋白抗体ELISA法的建立 (1)0.1 mol/L NaHCO3溶解亲和素至终质量浓度为5 μg/ml，包被聚苯乙烯板微孔,每孔100 μl,置37℃孵育箱，待液体蒸发干后取出，用0.05%吐温20 PBS缓冲液洗涤6次，拍干。用2%BSA封闭已包被的反应板，37℃ 1 h，洗涤备用。加入5 μg/ml生物素化P53抗原多肽，每孔50 μl,放室温摇床上摇动1 h，再用PBS缓冲液洗涤5次，拍干。加入1∶200稀释的患者血清，稀释液含1%BSA,1%PEG, 3% NaCl, 37℃水浴25 min，洗涤。再加入1∶3 000稀释的HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(购自上海生物制品所),37℃水浴20 min，洗涤5次。加入TMB显色剂，显色5 min，加入2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm波长测D值。(2)检测100份正常人血清抗P53蛋白抗体，波长450 nm，测得平均D值为0.20，s为0.06，以D+2 s(即0.32)为cut off 值,SD(患者样品)≥ ND(阴性对照)+2 s为阳性。
, 百拇医药
1.5 Pharma-Cell试剂盒检测 结直肠癌(50份)和乳腺癌(40份)患者的血清，操作和阳性结果判定按说明书进行。
1.6 免疫组化检测 肿瘤细胞内P53蛋白和CEA抗原表达由我院病理科常规完成。选择50份结直肠癌患者肿瘤细胞进行免疫组化染色和血清CEA抗原检测。
1.7 病理分析 选择30份抗P53蛋白抗体阳性患者进行病理资料分析。
1.8 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 血清抗P53蛋白抗体的检测结果 由表1可以看出，各组肿瘤检测结果与正常对照组比较差异非常显著(P<0.01)。
表1 血清抗P53蛋白抗体检测结果
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Tab 1 P53 antibodies in sera of patients
with various cancer types
Group
n
Positive
Negative
Positive rate(%)
Colon cancer
50
11
39
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22**
Lung cancer
50
17
33
34**
Breast cancer
40
10
30
25**
Stomach cancer
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50
18
32
36**
Primary liver cancer
50
16
34
32**
Normal control
100
2
, http://www.100md.com
98
2
**P<0.01 vs normal control2.2 两种检测方法的结果比较 用Pharma-Cell 公司的抗P53-ABS试剂盒检测直肠癌患者血清50份，乳腺癌患者血清40份，两者阳性率均为20%。检测结果与建立的ABC-ELISA法检测结果(22%和25%)相比较，无显著性差异(P>0.05)。但是,ABC-ELISA法3份阳性标本,进口试剂检测为阴性;2份阴性标本进口试剂检测为阳性(表2)。
表2 ABC-ELISA 法和进口试剂盒检测结果比较
Tab 2 The comparison of 2 methods between
ABC-ELISA and import kit
, 百拇医药
Import kit
ABC-ELISA(n)
Positive
Negative
Total
Positive
18
2
20
Negative
3
67
70
, http://www.100md.com
Total
21
69
90
2.3 免疫组化分析 取抗P53抗体阳性8例和阴性12例患者肿瘤组织进行免疫组化分析，观察肿瘤细胞P53蛋白的表达和积聚情况,结果见表3。
表3 免疫组化和抗P53抗体检测结果的比较
Tab 3 Relationship between serum anti-P53 antibodies
and P53 expression in primary cancer tissue
[n, (%)]
, 百拇医药
Mutant P53 expression
in primary tumor
Serum anti-P53 antibodies test
Positive
Negative
Total
Positive
7 (35)
5 (25)
12(60)
Negative
, 百拇医药
1 (5)
7 (35)
8(40)
Total
8(40)
12 (60)
20(100)
2.4 免疫组化染色结果 对50份结直肠癌患者肿瘤细胞进行免疫组化染色，结果显示肿瘤细胞内CEA抗原阳性率为60%，ELISA法检测血清中CEA阳性率为35%。
2.5 病理资料分析 30份抗P53蛋白抗体阳性患者病理资料分析显示：19份肿瘤细胞呈低分化或已转移，8份肿瘤细胞呈中度分化，3份肿瘤细胞呈高中度分化。
, 百拇医药
3 讨论
P53抑癌基因突变引起肿瘤发生是目前医学研究的热点，P53基因编码的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53蛋白可通过使细胞生长停止在G1期或诱导细胞凋亡等机制抑制肿瘤细胞增殖。人类肿瘤中P53基因突变95%以上发生在高度保守区(中间部分)，以175，248，249，273和282位点突变率最高，不同种类肿瘤其突变类型不同[4]。P53蛋白抗原决定簇位于其分子的N端和C端。研究表明：98%的抗P53抗体与P53蛋白的N端结合，而与C端结合的只有48%。本研究用人工合成的P53蛋白N端25个氨基酸作为抗原，建立了较敏感的亲和素-生物素ELISA法。为了减少非特异性，还将封闭液改成2%BSA，将稀释液中加入1%BSA，1%PEG和3% NaCl，大大减低了非特异性。本实验方法较为简便，易于操作，能够适合批量标本的检测，可以作为肿瘤高危人群的筛选。
用我们建立的ABC-ELISA法检测了240份肿瘤患者和100份正常人血清的抗P53蛋白抗体，结果显示正常人抗P53抗体的阳性率≤2%，而肿瘤患者的阳性率可随肿瘤发生部位的不同而有所差异，阳性率从22%～36%不等(表1)。同时用Pharma-Cell试剂盒进行检测，结直肠癌和乳腺癌患者血清抗P53蛋白抗体阳性率均为20%，与ABC-ELISA法检测结果相比无统计学意义(P>0.05)。但是，ABC-ELISA检测3份阳性样本，进口试剂检测为阴性；2份阴性样本进口试剂检测为阳性(表2)。由于进口试剂是基因重组P53蛋白为抗原，故这种现象的出现是否由于方法不同所引起，还是选用P53蛋白抗原性有差异，有待探讨。
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选择抗P53抗体阳性8例和阴性12例患者的肿瘤细胞进行免疫组化分析，肿瘤细胞内P53蛋白表达阳性率为60%(表3)，而正常细胞内P53蛋白表达阳性率<0.5%[5，6]。20份样本中7份免疫组化和血清抗P53抗体同时阳性，5份肿瘤细胞P53蛋白表达阳性而血清中抗P53抗体阴性；1份血清抗P53抗体阳性，而免疫组化肿瘤细胞P53蛋白表达阴性。由此可见，不是所有肿瘤细胞P53蛋白聚集都能诱导机体产生抗P53抗体。Winter等[7]指出仅有P53基因外显子5～6出现点突变时，编码的P53蛋白才具有免疫原性，诱导机体产生抗P53蛋白抗体。同时报道仅有30%～40%的突变P53蛋白产生抗P53抗体。此外本研究中1例血清抗P53抗体阳性，肿瘤组织却未能检出P53蛋白的过度表达和积聚，其原因目前尚不清楚，是否P53基因突变确实存在，但由于实验方法或取样等问题而未能检测到，或者其突变型的P53蛋白由于某种原因没有聚集，免疫组化不能检测到，均有待于进一步研究。通过对30份阳性标本进行临床病理资料分析，发现抗P53抗体在肿瘤发生的各个阶段都能检测到，但在肿瘤极低分化及分化不良且已转移的病例中血清抗P53抗体阳性率要高于高分化的未转移的患者，表明抗P53抗体的检测对肿瘤预后的判断有一定的参考价值。本实验中我们还对50例直肠癌患者血清进行了CEA抗原的检测和免疫组化资料分析，免疫组化显示肿瘤细胞内CEA抗原的阳性率为60%，与P53蛋白的免疫组化阳性率相同，而血清中CEA抗体的检测阳性率仅为35%，我们发现这两种肿瘤的突变之间无相关性，此结果与Shibata等[8]相一致。因此，抗P53抗体虽然是一种非特异性指标，进一步研究可望和CEA一起成为一种新的肿瘤标志物，起到辅助诊断的作用。■
, 百拇医药
作者简介：郭品娥(1962～)，女(汉族)，技师
参考文献：
[1]Lubin R, Schlichtholz B. Analysis of P53 antibodies in patients with various cancer define B-cell epitopes of human P53:distribution on primary structure and exposure on protein surface[J]. Cancer Res， 1993,53(24):5872-5876.
[2]Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B,et al. P53 mutations in human cancers[J]. Science， 1991,253(5015):49-53.
, 百拇医药
[3]何球藻,吴厚生 主编. 免疫学[M].上海：上海医科大学出版社，1997.180-182.
[4]Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, et al. Participation of P53 protein in the cellular response to DNA damage[J]. Cancer Res， 1991,51(23 pt 1):6304-6311.
[5]Soussi T. The humoral response to the tumor suppressor gene-product P53 in human cancer:implication for diagnosis and therapy[J]. Immunol Today, 1996,17(8):354-358.
[6]Houbiers JG, van der Burg SH, Watering LMG,et al . Antibodies against P53 are associated with poor prognosis of colorectal cancer[J]. Br J Cancer, 1995,72(3):637-641.
, 百拇医药
[7]Winter SF, Minna JD. Development of antibodies against P53 in lung cancer patients appears to be dependent on the type of P53 mutation[J]. Cancer Res, 1992,52(15):4168-4174.
[8]Shibata Y,Kotanagi H,Andoh H,et al. Detection of circulating anti-P53 antibodies in patients with colorectal carcinoma and the antibody's relation to clinical factors[J]. Dis Colon Rectum, 1996,39(11):1269-1274.
收稿日期：1999-09-15
修回日期：1999-12-20, http://www.100md.com
单位：郭品娥(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)；沈茜(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)；吴月琴(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海 200433)
关键词：抗体；抗P53蛋白；荧光抗体技术；肿瘤标志物
摘 要摘 要：目的：建立检测抗P53蛋白抗体的ABC-ELISA法，并进行初步临床应用的总结。方法：用人工合成P53蛋白N端25个氨基酸肽链为抗原，建立了敏感的亲和素-生物素ELISA法，240份肿瘤患者和100份正常人血清抗P53蛋白抗体，用免疫组化检测肿瘤细胞内P53蛋白表达情况。结果：肿瘤患者血清抗P53蛋白抗体阳性率分别为：结直肠癌22%、肺癌34%、乳腺癌25%、胃癌36%、原发性肝癌32%；而正常人血清中抗P53蛋白抗体的阳性率≤2%。对20份肿瘤组织进行免疫组化检测,肿瘤细胞内P53蛋白阳性率为60%。此外，用Pharma-Cell试剂盒检测90份结直肠癌患者和乳腺癌患者血清，结果与ABC-ELISA法无统计学差异(P>0.05)。结论：抗P53蛋白抗体在肿瘤患者中检出率显著高于正常人群，它可以作为一种新的肿瘤标志物，对肿瘤的诊断起到辅助作用。
, 百拇医药
中图分类号：R 730.45 文献标识码： A
文章编号：0258-879X(2000)01-0053-03
Development of ABC-ELISA method for detecting anti-P53-antibodies and its primary clinical application
GUO Pin-E
(Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
SHEN Qian
, 百拇医药 (Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WU Yue-Qin (Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective: To develop ABC-ELISA for detecting antibodies of P53 protein (P53-Abs) and evaluate the significance of P53 with the pathalogical stage and the prognosis of tumor. Methods: Serum P53-Abs were detected in 240 tumor patients and 100 normal adults by ABC-ELISA. Expression of P53 in the solid tumor was examined by immunohistochemisty. Results: The positive rate of serum P53-Abs from the normal subjects was ≤2%. The positive rates of serum P53-Abs from the patients with tumors were obviously different according to the origin of tumor and its pathological stage. The positive rates of colorectal cacinoma, lung cancer, breast cancer, stomach cancer,primary liver cancer were 22%,34%,25%,36%,32%，respectively. Expression of P53 in 20 solid tumor specimens was assessed by immunohistochemistry and the positive rate was 60%.We also detected serum p53-Abs in 90 patients with colorectal cacinoma and breast cancer by Pharma-Cell detecting kit.There was no significant difference between these 2 methods(P>0.05). Conclusion：This study shows that the positive rate of P53-Abs expression in solid tumor is significant higher than that in normal adult. It may become a new diagnostic indicator of tumor.
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KEY WORDS：antibodies, anti-P53; fluorescent antibody technique; tumor marker▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 53-55]
肿瘤是严重危害人类健康的恶性疾病。在我国，肿瘤的发病率逐年升高，已成为我国男性死亡的第二大因素，女性死亡的第三大因素。因此肿瘤的早期诊断、治疗和预后判断一直是临床医师密切关注的焦点。近年来发现P53抑癌基因的突变在恶性肿瘤中最为常见，其肿瘤突变率可达40%～80%[1，2]。P53抑癌基因的突变常引起P53蛋白空间构象的改变，以致它的半衰期从原来的20 min延长到几小时，造成突变P53蛋白在细胞内大量积聚。这种突变的P53蛋白失去了抑制细胞生长的功能，因而与肿瘤的发生密切相关，并诱导机体产生抗P53蛋白的特异性抗体[3]。本研究用合成的P53多肽为抗原，建立敏感的亲和素-生物素抗P53蛋白抗体的ELISA法。同时对临床上常见肿瘤患者进行了检测，并结合临床病理资料，探讨P53蛋白抗体检测对诊断和疗效观察的意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源 取自临床上经病理检查证实的肿瘤患者血清240份，其中结直肠癌50份、胃癌50份、乳腺癌40份、肺癌50份、原发性肝癌50份；正常人血清100份，贮存于-20℃，待用。
1.2 P53抗原多肽 选择P53蛋白N端25个氨基酸为合成抗原，由美国赛百盛公司合成，纯度>98%。进行同源性比较，其同源性为100%。
1.3 生物素标记P53多肽抗原 亲和素购自华美生物试剂公司；酯化生物素由中国人民解放军海军医学研究所提供。按1 mg酯化生物素与1 mg P53抗原的比例混匀，放37℃水箱1 h，装入透析袋用PBS缓冲液透析，每隔2～3 h换水，共5次。取出分装保存备用。
1.4 亲和素-生物素抗P53蛋白抗体ELISA法的建立 (1)0.1 mol/L NaHCO3溶解亲和素至终质量浓度为5 μg/ml，包被聚苯乙烯板微孔,每孔100 μl,置37℃孵育箱，待液体蒸发干后取出，用0.05%吐温20 PBS缓冲液洗涤6次，拍干。用2%BSA封闭已包被的反应板，37℃ 1 h，洗涤备用。加入5 μg/ml生物素化P53抗原多肽，每孔50 μl,放室温摇床上摇动1 h，再用PBS缓冲液洗涤5次，拍干。加入1∶200稀释的患者血清，稀释液含1%BSA,1%PEG, 3% NaCl, 37℃水浴25 min，洗涤。再加入1∶3 000稀释的HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(购自上海生物制品所),37℃水浴20 min，洗涤5次。加入TMB显色剂，显色5 min，加入2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm波长测D值。(2)检测100份正常人血清抗P53蛋白抗体，波长450 nm，测得平均D值为0.20，s为0.06，以D+2 s(即0.32)为cut off 值,SD(患者样品)≥ ND(阴性对照)+2 s为阳性。
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1.5 Pharma-Cell试剂盒检测 结直肠癌(50份)和乳腺癌(40份)患者的血清，操作和阳性结果判定按说明书进行。
1.6 免疫组化检测 肿瘤细胞内P53蛋白和CEA抗原表达由我院病理科常规完成。选择50份结直肠癌患者肿瘤细胞进行免疫组化染色和血清CEA抗原检测。
1.7 病理分析 选择30份抗P53蛋白抗体阳性患者进行病理资料分析。
1.8 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 血清抗P53蛋白抗体的检测结果 由表1可以看出，各组肿瘤检测结果与正常对照组比较差异非常显著(P<0.01)。
表1 血清抗P53蛋白抗体检测结果
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Tab 1 P53 antibodies in sera of patients
with various cancer types
Group
n
Positive
Negative
Positive rate(%)
Colon cancer
50
11
39
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22**
Lung cancer
50
17
33
34**
Breast cancer
40
10
30
25**
Stomach cancer
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50
18
32
36**
Primary liver cancer
50
16
34
32**
Normal control
100
2
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98
2
**P<0.01 vs normal control2.2 两种检测方法的结果比较 用Pharma-Cell 公司的抗P53-ABS试剂盒检测直肠癌患者血清50份，乳腺癌患者血清40份，两者阳性率均为20%。检测结果与建立的ABC-ELISA法检测结果(22%和25%)相比较，无显著性差异(P>0.05)。但是,ABC-ELISA法3份阳性标本,进口试剂检测为阴性;2份阴性标本进口试剂检测为阳性(表2)。
表2 ABC-ELISA 法和进口试剂盒检测结果比较
Tab 2 The comparison of 2 methods between
ABC-ELISA and import kit
, 百拇医药
Import kit
ABC-ELISA(n)
Positive
Negative
Total
Positive
18
2
20
Negative
3
67
70
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Total
21
69
90
2.3 免疫组化分析 取抗P53抗体阳性8例和阴性12例患者肿瘤组织进行免疫组化分析，观察肿瘤细胞P53蛋白的表达和积聚情况,结果见表3。
表3 免疫组化和抗P53抗体检测结果的比较
Tab 3 Relationship between serum anti-P53 antibodies
and P53 expression in primary cancer tissue
[n, (%)]
, 百拇医药
Mutant P53 expression
in primary tumor
Serum anti-P53 antibodies test
Positive
Negative
Total
Positive
7 (35)
5 (25)
12(60)
Negative
, 百拇医药
1 (5)
7 (35)
8(40)
Total
8(40)
12 (60)
20(100)
2.4 免疫组化染色结果 对50份结直肠癌患者肿瘤细胞进行免疫组化染色，结果显示肿瘤细胞内CEA抗原阳性率为60%，ELISA法检测血清中CEA阳性率为35%。
2.5 病理资料分析 30份抗P53蛋白抗体阳性患者病理资料分析显示：19份肿瘤细胞呈低分化或已转移，8份肿瘤细胞呈中度分化，3份肿瘤细胞呈高中度分化。
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3 讨论
P53抑癌基因突变引起肿瘤发生是目前医学研究的热点，P53基因编码的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53蛋白可通过使细胞生长停止在G1期或诱导细胞凋亡等机制抑制肿瘤细胞增殖。人类肿瘤中P53基因突变95%以上发生在高度保守区(中间部分)，以175，248，249，273和282位点突变率最高，不同种类肿瘤其突变类型不同[4]。P53蛋白抗原决定簇位于其分子的N端和C端。研究表明：98%的抗P53抗体与P53蛋白的N端结合，而与C端结合的只有48%。本研究用人工合成的P53蛋白N端25个氨基酸作为抗原，建立了较敏感的亲和素-生物素ELISA法。为了减少非特异性，还将封闭液改成2%BSA，将稀释液中加入1%BSA，1%PEG和3% NaCl，大大减低了非特异性。本实验方法较为简便，易于操作，能够适合批量标本的检测，可以作为肿瘤高危人群的筛选。
用我们建立的ABC-ELISA法检测了240份肿瘤患者和100份正常人血清的抗P53蛋白抗体，结果显示正常人抗P53抗体的阳性率≤2%，而肿瘤患者的阳性率可随肿瘤发生部位的不同而有所差异，阳性率从22%～36%不等(表1)。同时用Pharma-Cell试剂盒进行检测，结直肠癌和乳腺癌患者血清抗P53蛋白抗体阳性率均为20%，与ABC-ELISA法检测结果相比无统计学意义(P>0.05)。但是，ABC-ELISA检测3份阳性样本，进口试剂检测为阴性；2份阴性样本进口试剂检测为阳性(表2)。由于进口试剂是基因重组P53蛋白为抗原，故这种现象的出现是否由于方法不同所引起，还是选用P53蛋白抗原性有差异，有待探讨。
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选择抗P53抗体阳性8例和阴性12例患者的肿瘤细胞进行免疫组化分析，肿瘤细胞内P53蛋白表达阳性率为60%(表3)，而正常细胞内P53蛋白表达阳性率<0.5%[5，6]。20份样本中7份免疫组化和血清抗P53抗体同时阳性，5份肿瘤细胞P53蛋白表达阳性而血清中抗P53抗体阴性；1份血清抗P53抗体阳性，而免疫组化肿瘤细胞P53蛋白表达阴性。由此可见，不是所有肿瘤细胞P53蛋白聚集都能诱导机体产生抗P53抗体。Winter等[7]指出仅有P53基因外显子5～6出现点突变时，编码的P53蛋白才具有免疫原性，诱导机体产生抗P53蛋白抗体。同时报道仅有30%～40%的突变P53蛋白产生抗P53抗体。此外本研究中1例血清抗P53抗体阳性，肿瘤组织却未能检出P53蛋白的过度表达和积聚，其原因目前尚不清楚，是否P53基因突变确实存在，但由于实验方法或取样等问题而未能检测到，或者其突变型的P53蛋白由于某种原因没有聚集，免疫组化不能检测到，均有待于进一步研究。通过对30份阳性标本进行临床病理资料分析，发现抗P53抗体在肿瘤发生的各个阶段都能检测到，但在肿瘤极低分化及分化不良且已转移的病例中血清抗P53抗体阳性率要高于高分化的未转移的患者，表明抗P53抗体的检测对肿瘤预后的判断有一定的参考价值。本实验中我们还对50例直肠癌患者血清进行了CEA抗原的检测和免疫组化资料分析，免疫组化显示肿瘤细胞内CEA抗原的阳性率为60%，与P53蛋白的免疫组化阳性率相同，而血清中CEA抗体的检测阳性率仅为35%，我们发现这两种肿瘤的突变之间无相关性，此结果与Shibata等[8]相一致。因此，抗P53抗体虽然是一种非特异性指标，进一步研究可望和CEA一起成为一种新的肿瘤标志物，起到辅助诊断的作用。■
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作者简介：郭品娥(1962～)，女(汉族)，技师
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收稿日期：1999-09-15
修回日期：1999-12-20, http://www.100md.com