神经生长因子对豚鼠噪声性听力损伤的保护作用
作者：阮芳铭 高文元 王海明 季红光 王福 肖建平 王兰英 潘祥福 刘长云
单位：阮芳铭(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)； 高文元(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；王海明(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；季红光(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；王福(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；肖建平(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)
关键词：神经生长因子；噪声；听阈；琥珀酸脱氢酶
第二军医大学学报000115 摘 要：目的：探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对噪声性听力损伤的保护作用。方法：以听阈、耳蜗酶组织化学检测等为指标, 观察豚鼠每天在115 dB(A)稳态噪声连续6 d的暴露(45 min/d)前，肌肉注射不同剂量的NGF对豚鼠皮层声诱发电位、听毛细胞琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase, SDH)活性的影响。结果：A[NGF:1 000 BU/(kg。d),im.], B[NGF:2 000 BU/(kg。d),im.]和C[NGF:3 000 BU/(kg。d),im.]3个实验组动物听阈偏移幅度均小于对照组[生理盐水:1 ml/(kg。d),im.],相差非常显著；实验B，C两组动物在噪声暴露后第3天听阈已基本恢复,而对照组动物在噪声暴露后第6天仍有(16.43±6.91) dB的阈移。3个实验组耳蜗毛细胞SDH活性减弱程度也比对照组明显为轻; 而实验B，C两组则无显著性差异，但它们又明显轻于实验A组。结论：NGF能减轻噪声对耳蜗及神经的损害，对听觉功能具有明显的保护作用。
, 百拇医药
中图分类号：R 135.8 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0045-05
Protective effects of nerve growth factor on noise-induced hearing damage in guinea pigs
RUAN Fang-Ming
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
GAO Wen-Yuan
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
WANG Hai-Ming
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
JI Hong-Guang
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WANG Fu-Di
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
XIAO Jian-Ping
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WANG Lang-Ying
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
PAN Xiang-Fu
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, http://www.100md.com
LIU Chang-Yun
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective: To study the protective effects of nerve growth factor(NGF) on noise-induced hearing damage in guinea pigs. Methods: Guinea pigs were exposed to white noise of 115 dB(A) for 6 days intermittently (45 min/d). At different post-exposure intervals, auditory thresholds were measured using auditory cortex evoked response to tone bursts. The activities of succinic dehydrogenase(SDH) of hair cells were examined with enzyme histochemical method. Results: The auditory threshold shifts in test group A [NGF: 1 000 BU/(kg。d),im.], B [NGF:2 000 BU/(kg。d),im.] and C [NGF:3 000 BU/(kg。d),im.] were significantly fewer than that in the control group [saline:1 ml/(kg。d),im.]. Threshold shifts almost recovered in group B and C 3 days after exposure; while a threshold shift of (16.43±6.91) dB was present 6 days after exposure in the control group. The SDH activities within hair cells were less diminished in the test group than that in the control. The extent of diminished SDH activities in group B and C was less than that in group A. Conclusion: NGF is able to reduce threshold shift, promote recovery of auditory threshold and enzyme activity in acoustic trauma. This factor can, to some extent, protect noise-induced hearing damage.
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KEY WORDS：nerve growth factor; noise; auditory threshold; succinic dehydrogenase▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 45-49]
噪声可致人耳听力损害,产生可恢复的暂时性阈移(temporary threshold shift, TTS)或不可恢复的永久性阈移(permanent threshold shift, PTS), 甚至造成噪声性耳聋。对于噪声性听力损失迄今尚无理想的防治方法。 本实验在豚鼠每天暴露噪声前肌肉注射不同剂量的神经生长因子(NGF)， 对其防止TTS转变为PTS及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 NGF:为雄性小鼠颌下腺提取物(2.5 s),比活性为10万BU/mg，第二军医大学神经生物学教研室提供；0.1%氯化硝基四氮唑蓝溶液，上海前进试剂厂产品；便携式听觉声音诱发电位仪(Traveler,美国)；B.K.1027型无规信号发生器(丹麦)。
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1.2 动物分组与处理 选择耳廓反射正常的健康杂色雄性豚鼠32只(第二军医大学实验动物中心提供,其中4只作为SDH染色正常对照),体质量(274.64±19.9) g;按体质量随机分为4组：对照组7只(14耳)、A组7只(14耳)、B组7只(14耳)和C组7只(14耳)。各组豚鼠在戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉和无菌条件下于双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极,牙科水泥固定,稳定1周后进行实验。
1.3 动物用药 每天在噪声暴露前15 min用药。对照组动物:肌肉注射生理盐水[1 ml/(kg。d)]；A组动物:肌肉注射NGF[1 000 BU/(kg。d)]；B组动物：肌肉注射NGF [2 000 BU/(kg。d)]；C组动物:肌肉注射NGF[3 000 BU/(kg。d)]。
1.4 噪声暴露 4组动物每天用药完毕后即行白噪声暴露。将动物置于小笼内(20 cm×20 cm×20 cm), 每笼1只,放入暴露舱(26 m3), 由B.K.1027型无规信号发生器产生20 Hz～20 kHz的白噪声,经GY2×275C型扩音机放大,由位于暴露舱四周的扬声器组向暴露舱播放。暴露时，用B.K.2107型频率分析仪进行连续监测。暴露强度为115 dB(A)，实测频谱见表1；动物暴露范围内声场不均匀度为±1 dB(A)。每日暴露1次, 每次45 min，连续暴露6 d。
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表1 115 dB(A)白噪声的倍频程频谱
Tab 1 Octave band frequency of white noise at 115 dB(A) Frequency (f/Hz)
63.5
125
250
500
1 000
2 000
4 000
8 000
16 000
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Intensity (LpN/dB)
94
98
101
103
105
104
103
98
87
1.5 听阈测试 动物清醒状态，半限制于测试笼中，置于隔声电屏蔽室内。用便携式听觉声音诱发电位仪(Traveler)测定皮层短声诱发电位；刺激声能量主要集中在2～4 kHz；由0.1 ms的方波输入扬声器产生,诱发生物电信号通过机内前级放大器放大1×104倍并进行信息处理。扫描时间100 ms,重复率1次/s，带通滤波10～300 Hz，叠加30次。短声以5 dB步级衰减，以刚能出现皮层电位的短声强度为皮层反应阈，简称听阈。扬声器正对豚鼠一侧耳, 与耳相距3 cm。对侧慢性电极为记录电极，额部近中线处鼻骨旁慢性电极为参考电极, 口腔上唇粘膜接地。各组动物在第一次噪声暴露前和噪声暴露全部结束后(1 h, 1 d, 2 d, 3 d和6 d )分别测试皮层听阈。
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1.6 耳蜗铺片酶组织化学检查 选择部分动物共20耳(其中对照组和3个实验组各4耳，另加不经给药和噪声暴露、听阈正常的动物4耳作为正常对照), 在4组动物完成最后一次听阈测试后(噪声暴露停止后第6天)，处死动物立即取出颞骨，打开听泡，进行琥珀酸脱氢酶(SDH)作用液染色[1]，光镜观察毛细胞SDH活性改变程度和部位，以及判断毛细胞缺失情况。
2 结果
2.1 听阈的变化 4组动物在噪声暴露前和噪声暴露结束后不同时间的听阈见表2;结果表明，对照组和3个实验组均有听力损失，表现为听阈上移，其中以对照组最为明显，实验A组次之(B组动物实验期间死亡1只)。按完全随机设计多个样本均数比较的方差分析表明，噪声暴露结束后1 h，1 d，2 d，3 d和6 d，3个实验组阈值与对照组相比，除噪声暴露后1 h A组与对照组相差不显著外，均有非常显著差异(P<0.01)，但B组与C组间阈值则无显著差别(P>0.05)；而A组与C组之间的阈值在暴露后1 h、第1天和第2天有显著差别(P<0.05)，在暴露后第3天和第6天，实验A组与实验B，C组之间则相差非常显著(P<0.01)。图1为4组动物在噪声暴露后阈移的恢复曲线示意图，可见，在噪声暴露后第3天，B，C两组听阈已接近正常，到第6天完全恢复至暴露前水平；但A组在噪声暴露后第3天和第6天分别还有(11.43±6.02)和(8.22±5.21) dB的阈移；而对照组在噪声暴露后第6天仍然有(16.43±6.91) dB的阈移。
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表2 噪声暴露后不同时间4组动物皮层听阈
Tab 2 Hearing threshold of 4 groups of animals at different time after noise exposure
(n=14,
±s, LpN/dB) Group
Before noise
exposure
Time of after noise exposure
1 h
1 d
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2 d
3 d
6 d
Control
7.50±2.59
42.86±8.71
36.43±7.70
30.71±5.84
27.50±5.46
23.93±6.84
A
7.14±2.57
, 百拇医药
38.21±6.96
27.86±5.45**
22.50±5.46**
18.57±6.02**
15.36±5.36**
B
6.67±2.46
28.75±3.11**△△
20.83±5.15**△
14.58±5.82**△△
, 百拇医药
7.92±3.34**△△
6.67±2.46**△△
C
7.50±2.59
32.50±4.27**△
22.14±5.79**△
15.71±5.14**△
8.93±2.89**△△
7.50±2.59**△△
, http://www.100md.com **P<0.01 vs control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs group A
图1 噪声暴露后不同时间平均
阈移的恢复曲线示意图
Fig 1 The mean recovery curves at different
time after noise exposure
○：Control group;●:Group A; ■: Group B; □: Group C
2.2 耳蜗毛细胞SDH活性变化 耳蜗基底膜铺片SDH染色观察结果显示：对照组动物三排外毛细胞(outer hair cells, OHCs)均有不同程度的SDH活性减弱或消失, 以耳蜗第一回末段最为严重, 内毛细胞胞质内SDH活性无明显减弱(图2A)；A组动物耳蜗第一回末段和第二回起始段外毛细胞SDH活性也明显下降(图2B)，多局限于第三排外毛细胞(OHC3)；而B,C两组动物耳蜗各回毛细胞SDH活性较清晰可见，并无明显缺失(图2C), 内、外毛细胞SDH活性及形态结构与正常对照耳比较, 其形态结构完整性基本相似，胞质内均充满蓝色颗粒。
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图2 不同组豚鼠耳蜗毛细胞琥珀酸脱氢酶活性表现
Fig 2 The activities of succinic dehydrogenase in cochlear hair cells from different groups
A：In the terminal pieces of the basal turn of the basilar membrane in the control group, the SDH activities of the all 3 rows of the outer hair cells (OHCs) were diminished or disappeared (×400)；B: In the initial pieces of the second turn of the basilar membrane in the group A, the SDH activities of the third row of OHCs were markedly decreased (×100)；C： In the initial pieces of the second turn of the basilar membrane in the group C, the SDH activites of OHCs were slightly diminished (×100)
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4组动物随机各选择4耳，光镜下于耳蜗第一回末段和第二回起始段分别取3个视野(40×10倍)，对尚有(正常)SDH活性的外毛细胞个数进行计数。经t检验，3个实验组[A：(390.75±5.97)个；B：(452.50±7.42)个；C: (449.50±5.97)个]与对照组(356.75±5.56)个相比较均有非常显著的差别 (P<0.01)；B，C组与A组比较相差也非常显著 (P<0.01)，而B组与C组之间则无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
噪声刺激能使耳蜗Corti器发生病变，但其原因仍不十分清楚，一般认为：噪声刺激时，耳蜗毛细胞代谢需要量增加,使耳蜗感受器细胞内一系列酶(SDH，ATPase等)活性下降，蛋白质、糖元及核酸合成减少，有氧代谢和乏氧代谢都降低；噪声还可使细胞核内的RNA合成减少。由于没有相当能量作保证，耳蜗Corti器就不能完成声-电换能[2,3]。因此，可以认为，能量代谢障碍是毛细胞变性和消失的重要原因或前兆。对于噪声性听力损伤的防治方法以往已在增加血流量、供给高能化合物及供氧、提高对噪声的耐受力等方面进行了研究[4,5]。但是，对于噪声引起的外周听觉感受器损伤而产生的噪声性耳聋，迄今尚无理想的防治方法。最近有研究表明，神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)对氨基甙类药物引起的听力损伤具有一定的保护作用[6,7]。
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现已清楚，NTFs是一类神经元细胞增殖、分化和存活所必需的因子。其主要作用包括促进神经细胞的分化、增生，促进神经突起的生长、损伤后的修复及增加靶细胞中RNA、蛋白质的合成，激活多种代谢酶，促进神经蛋白等骨架蛋白的胞内聚合作用等。目前认为，只有NGF家族成员对感觉、交感及某些中枢胆碱能神经元具有营养支持作用，对损伤神经元具有保护和修复作用[8]。本实验动物经稳态白噪声连续暴露6 d后，其听阈改变显示：4组动物普遍有听阈上移，在噪声暴露停止后的1 h内，对照组动物平均阈移为(35.36±9.09) dB，直到第6天平均阈移仍然有(16.43±6.91)dB；可以认为，在该组动物的阈移中已含有相当程度的PTS成分。但应用了NGF的3组实验动物，其听阈上移的幅度明显低于对照组(P<0.01)，它们所形成的阈移属于TTS。在噪声暴露停止后第3天，实验B，C两组听阈已基本恢复至暴露前的水平，但此时用药量最小的实验A组动物，其阈移恢复速度则不及实验B，C组。本实验表明：3个实验组动物毛细胞的病变程度明显轻于对照组，这可能是由于肌注NGF之后，提高了细胞抵抗噪声刺激的能力，并使细胞损伤能及时得以修复。NGF的这种作用可能主要是通过其与毛细胞及神经纤维上的特异性受体结合而激活细胞的蛋白激酶系统，使细胞内的cAMP增加，代谢活动增强。从噪声性听力损伤的代谢理论认为，噪声暴露后，内耳毛细胞对代谢的需求增加，可代偿性地通过血管扩张、血液流速增加、耗氧量增加等途径[2]，增加内耳的能量供应。本实验对照组动物耳蜗毛细胞SDH活性下降，说明毛细胞已经有能量代谢障碍。而实验组尤其是B，C两组动物SDH活性明显高于对照组，其病变程度则较轻。由于NGF可能对细胞的DNA及蛋白质合成有促进作用，这将为毛细胞代谢活动提供各种酶类，并为细胞及膜结构的修复提供结构蛋白，减少毛细胞的损伤或死亡。
, 百拇医药
血-迷路屏障是保证内耳特殊功能所必需的重要系统[9]。由于NGF作为多肽类生长因子，尽管在血浆中的半衰期较短，不利于其疗效的发挥，但有实验证明NGF在注射后1 h, 血浆中仍能检测出它的活性[10]。使用肌肉给药途径，NGF要最终到达内耳外淋巴液发挥其作用，血-迷路屏障可能是其必经之路。本实验由于动物在每天用药后即暴露于115 dB(A)的强噪声中，连续噪声对内耳不断产生进行性损害，这种损害与使用氨基甙类药物所造成的内耳损害可能有相同之处。因此, 同时对血-迷路屏障也会造成不同程度的损伤[9]，这可能更有利于NGF进入内耳淋巴液发挥其生物学效应。关于NGF对抗噪声性听力损伤的确切机制还了解甚少，本研究仅作一些初步的探讨，并为NGF的开发及进一步应用NTFs防治噪声性耳聋提供一点实验依据。■
致谢 本研究得到第二军医大学神经生物学教研室主任路长林教授的热忱指导，以及该室赵小林实验师、严进博士的热心帮助；同时，得到海军医学研究所梁振福、史秀凤副研究员和杨玉明硕士的大力帮助与指导，以及本校生理学教研室章岚讲师、图书馆邱君瑞馆员的具体帮助，特此一并致谢。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870203)
作者简介：阮芳铭(1958～)，男(汉族)，硕士，讲师
参考文献：
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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收稿日期：1999-09-05
修回日期：1999-12-20, 百拇医药
单位：阮芳铭(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)； 高文元(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；王海明(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；季红光(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；王福(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)；肖建平(第二军医大学海军医学第海军卫生学教研室，上海 200433)
关键词：神经生长因子；噪声；听阈；琥珀酸脱氢酶
第二军医大学学报000115 摘 要：目的：探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对噪声性听力损伤的保护作用。方法：以听阈、耳蜗酶组织化学检测等为指标, 观察豚鼠每天在115 dB(A)稳态噪声连续6 d的暴露(45 min/d)前，肌肉注射不同剂量的NGF对豚鼠皮层声诱发电位、听毛细胞琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase, SDH)活性的影响。结果：A[NGF:1 000 BU/(kg。d),im.], B[NGF:2 000 BU/(kg。d),im.]和C[NGF:3 000 BU/(kg。d),im.]3个实验组动物听阈偏移幅度均小于对照组[生理盐水:1 ml/(kg。d),im.],相差非常显著；实验B，C两组动物在噪声暴露后第3天听阈已基本恢复,而对照组动物在噪声暴露后第6天仍有(16.43±6.91) dB的阈移。3个实验组耳蜗毛细胞SDH活性减弱程度也比对照组明显为轻; 而实验B，C两组则无显著性差异，但它们又明显轻于实验A组。结论：NGF能减轻噪声对耳蜗及神经的损害，对听觉功能具有明显的保护作用。
, 百拇医药
中图分类号：R 135.8 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0045-05
Protective effects of nerve growth factor on noise-induced hearing damage in guinea pigs
RUAN Fang-Ming
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
GAO Wen-Yuan
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
WANG Hai-Ming
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
JI Hong-Guang
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WANG Fu-Di
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
XIAO Jian-Ping
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WANG Lang-Ying
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
PAN Xiang-Fu
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
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LIU Chang-Yun
(Department of Navy Hygienie, Faculty of Navy Medicine,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective: To study the protective effects of nerve growth factor(NGF) on noise-induced hearing damage in guinea pigs. Methods: Guinea pigs were exposed to white noise of 115 dB(A) for 6 days intermittently (45 min/d). At different post-exposure intervals, auditory thresholds were measured using auditory cortex evoked response to tone bursts. The activities of succinic dehydrogenase(SDH) of hair cells were examined with enzyme histochemical method. Results: The auditory threshold shifts in test group A [NGF: 1 000 BU/(kg。d),im.], B [NGF:2 000 BU/(kg。d),im.] and C [NGF:3 000 BU/(kg。d),im.] were significantly fewer than that in the control group [saline:1 ml/(kg。d),im.]. Threshold shifts almost recovered in group B and C 3 days after exposure; while a threshold shift of (16.43±6.91) dB was present 6 days after exposure in the control group. The SDH activities within hair cells were less diminished in the test group than that in the control. The extent of diminished SDH activities in group B and C was less than that in group A. Conclusion: NGF is able to reduce threshold shift, promote recovery of auditory threshold and enzyme activity in acoustic trauma. This factor can, to some extent, protect noise-induced hearing damage.
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KEY WORDS：nerve growth factor; noise; auditory threshold; succinic dehydrogenase▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 45-49]
噪声可致人耳听力损害,产生可恢复的暂时性阈移(temporary threshold shift, TTS)或不可恢复的永久性阈移(permanent threshold shift, PTS), 甚至造成噪声性耳聋。对于噪声性听力损失迄今尚无理想的防治方法。 本实验在豚鼠每天暴露噪声前肌肉注射不同剂量的神经生长因子(NGF)， 对其防止TTS转变为PTS及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 NGF:为雄性小鼠颌下腺提取物(2.5 s),比活性为10万BU/mg，第二军医大学神经生物学教研室提供；0.1%氯化硝基四氮唑蓝溶液，上海前进试剂厂产品；便携式听觉声音诱发电位仪(Traveler,美国)；B.K.1027型无规信号发生器(丹麦)。
, http://www.100md.com
1.2 动物分组与处理 选择耳廓反射正常的健康杂色雄性豚鼠32只(第二军医大学实验动物中心提供,其中4只作为SDH染色正常对照),体质量(274.64±19.9) g;按体质量随机分为4组：对照组7只(14耳)、A组7只(14耳)、B组7只(14耳)和C组7只(14耳)。各组豚鼠在戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉和无菌条件下于双侧皮层听区硬膜外手术埋植不锈钢丝慢性电极,牙科水泥固定,稳定1周后进行实验。
1.3 动物用药 每天在噪声暴露前15 min用药。对照组动物:肌肉注射生理盐水[1 ml/(kg。d)]；A组动物:肌肉注射NGF[1 000 BU/(kg。d)]；B组动物：肌肉注射NGF [2 000 BU/(kg。d)]；C组动物:肌肉注射NGF[3 000 BU/(kg。d)]。
1.4 噪声暴露 4组动物每天用药完毕后即行白噪声暴露。将动物置于小笼内(20 cm×20 cm×20 cm), 每笼1只,放入暴露舱(26 m3), 由B.K.1027型无规信号发生器产生20 Hz～20 kHz的白噪声,经GY2×275C型扩音机放大,由位于暴露舱四周的扬声器组向暴露舱播放。暴露时，用B.K.2107型频率分析仪进行连续监测。暴露强度为115 dB(A)，实测频谱见表1；动物暴露范围内声场不均匀度为±1 dB(A)。每日暴露1次, 每次45 min，连续暴露6 d。
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表1 115 dB(A)白噪声的倍频程频谱
Tab 1 Octave band frequency of white noise at 115 dB(A) Frequency (f/Hz)
63.5
125
250
500
1 000
2 000
4 000
8 000
16 000
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Intensity (LpN/dB)
94
98
101
103
105
104
103
98
87
1.5 听阈测试 动物清醒状态，半限制于测试笼中，置于隔声电屏蔽室内。用便携式听觉声音诱发电位仪(Traveler)测定皮层短声诱发电位；刺激声能量主要集中在2～4 kHz；由0.1 ms的方波输入扬声器产生,诱发生物电信号通过机内前级放大器放大1×104倍并进行信息处理。扫描时间100 ms,重复率1次/s，带通滤波10～300 Hz，叠加30次。短声以5 dB步级衰减，以刚能出现皮层电位的短声强度为皮层反应阈，简称听阈。扬声器正对豚鼠一侧耳, 与耳相距3 cm。对侧慢性电极为记录电极，额部近中线处鼻骨旁慢性电极为参考电极, 口腔上唇粘膜接地。各组动物在第一次噪声暴露前和噪声暴露全部结束后(1 h, 1 d, 2 d, 3 d和6 d )分别测试皮层听阈。
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1.6 耳蜗铺片酶组织化学检查 选择部分动物共20耳(其中对照组和3个实验组各4耳，另加不经给药和噪声暴露、听阈正常的动物4耳作为正常对照), 在4组动物完成最后一次听阈测试后(噪声暴露停止后第6天)，处死动物立即取出颞骨，打开听泡，进行琥珀酸脱氢酶(SDH)作用液染色[1]，光镜观察毛细胞SDH活性改变程度和部位，以及判断毛细胞缺失情况。
2 结果
2.1 听阈的变化 4组动物在噪声暴露前和噪声暴露结束后不同时间的听阈见表2;结果表明，对照组和3个实验组均有听力损失，表现为听阈上移，其中以对照组最为明显，实验A组次之(B组动物实验期间死亡1只)。按完全随机设计多个样本均数比较的方差分析表明，噪声暴露结束后1 h，1 d，2 d，3 d和6 d，3个实验组阈值与对照组相比，除噪声暴露后1 h A组与对照组相差不显著外，均有非常显著差异(P<0.01)，但B组与C组间阈值则无显著差别(P>0.05)；而A组与C组之间的阈值在暴露后1 h、第1天和第2天有显著差别(P<0.05)，在暴露后第3天和第6天，实验A组与实验B，C组之间则相差非常显著(P<0.01)。图1为4组动物在噪声暴露后阈移的恢复曲线示意图，可见，在噪声暴露后第3天，B，C两组听阈已接近正常，到第6天完全恢复至暴露前水平；但A组在噪声暴露后第3天和第6天分别还有(11.43±6.02)和(8.22±5.21) dB的阈移；而对照组在噪声暴露后第6天仍然有(16.43±6.91) dB的阈移。
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表2 噪声暴露后不同时间4组动物皮层听阈
Tab 2 Hearing threshold of 4 groups of animals at different time after noise exposure
(n=14,
±s, LpN/dB) GroupBefore noise
exposure
Time of after noise exposure
1 h
1 d
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2 d
3 d
6 d
Control
7.50±2.59
42.86±8.71
36.43±7.70
30.71±5.84
27.50±5.46
23.93±6.84
A
7.14±2.57
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38.21±6.96
27.86±5.45**
22.50±5.46**
18.57±6.02**
15.36±5.36**
B
6.67±2.46
28.75±3.11**△△
20.83±5.15**△
14.58±5.82**△△
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7.92±3.34**△△
6.67±2.46**△△
C
7.50±2.59
32.50±4.27**△
22.14±5.79**△
15.71±5.14**△
8.93±2.89**△△
7.50±2.59**△△
, http://www.100md.com **P<0.01 vs control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs group A
图1 噪声暴露后不同时间平均
阈移的恢复曲线示意图
Fig 1 The mean recovery curves at different
time after noise exposure
○：Control group;●:Group A; ■: Group B; □: Group C
2.2 耳蜗毛细胞SDH活性变化 耳蜗基底膜铺片SDH染色观察结果显示：对照组动物三排外毛细胞(outer hair cells, OHCs)均有不同程度的SDH活性减弱或消失, 以耳蜗第一回末段最为严重, 内毛细胞胞质内SDH活性无明显减弱(图2A)；A组动物耳蜗第一回末段和第二回起始段外毛细胞SDH活性也明显下降(图2B)，多局限于第三排外毛细胞(OHC3)；而B,C两组动物耳蜗各回毛细胞SDH活性较清晰可见，并无明显缺失(图2C), 内、外毛细胞SDH活性及形态结构与正常对照耳比较, 其形态结构完整性基本相似，胞质内均充满蓝色颗粒。
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图2 不同组豚鼠耳蜗毛细胞琥珀酸脱氢酶活性表现
Fig 2 The activities of succinic dehydrogenase in cochlear hair cells from different groups
A：In the terminal pieces of the basal turn of the basilar membrane in the control group, the SDH activities of the all 3 rows of the outer hair cells (OHCs) were diminished or disappeared (×400)；B: In the initial pieces of the second turn of the basilar membrane in the group A, the SDH activities of the third row of OHCs were markedly decreased (×100)；C： In the initial pieces of the second turn of the basilar membrane in the group C, the SDH activites of OHCs were slightly diminished (×100)
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4组动物随机各选择4耳，光镜下于耳蜗第一回末段和第二回起始段分别取3个视野(40×10倍)，对尚有(正常)SDH活性的外毛细胞个数进行计数。经t检验，3个实验组[A：(390.75±5.97)个；B：(452.50±7.42)个；C: (449.50±5.97)个]与对照组(356.75±5.56)个相比较均有非常显著的差别 (P<0.01)；B，C组与A组比较相差也非常显著 (P<0.01)，而B组与C组之间则无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
噪声刺激能使耳蜗Corti器发生病变，但其原因仍不十分清楚，一般认为：噪声刺激时，耳蜗毛细胞代谢需要量增加,使耳蜗感受器细胞内一系列酶(SDH，ATPase等)活性下降，蛋白质、糖元及核酸合成减少，有氧代谢和乏氧代谢都降低；噪声还可使细胞核内的RNA合成减少。由于没有相当能量作保证，耳蜗Corti器就不能完成声-电换能[2,3]。因此，可以认为，能量代谢障碍是毛细胞变性和消失的重要原因或前兆。对于噪声性听力损伤的防治方法以往已在增加血流量、供给高能化合物及供氧、提高对噪声的耐受力等方面进行了研究[4,5]。但是，对于噪声引起的外周听觉感受器损伤而产生的噪声性耳聋，迄今尚无理想的防治方法。最近有研究表明，神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)对氨基甙类药物引起的听力损伤具有一定的保护作用[6,7]。
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现已清楚，NTFs是一类神经元细胞增殖、分化和存活所必需的因子。其主要作用包括促进神经细胞的分化、增生，促进神经突起的生长、损伤后的修复及增加靶细胞中RNA、蛋白质的合成，激活多种代谢酶，促进神经蛋白等骨架蛋白的胞内聚合作用等。目前认为，只有NGF家族成员对感觉、交感及某些中枢胆碱能神经元具有营养支持作用，对损伤神经元具有保护和修复作用[8]。本实验动物经稳态白噪声连续暴露6 d后，其听阈改变显示：4组动物普遍有听阈上移，在噪声暴露停止后的1 h内，对照组动物平均阈移为(35.36±9.09) dB，直到第6天平均阈移仍然有(16.43±6.91)dB；可以认为，在该组动物的阈移中已含有相当程度的PTS成分。但应用了NGF的3组实验动物，其听阈上移的幅度明显低于对照组(P<0.01)，它们所形成的阈移属于TTS。在噪声暴露停止后第3天，实验B，C两组听阈已基本恢复至暴露前的水平，但此时用药量最小的实验A组动物，其阈移恢复速度则不及实验B，C组。本实验表明：3个实验组动物毛细胞的病变程度明显轻于对照组，这可能是由于肌注NGF之后，提高了细胞抵抗噪声刺激的能力，并使细胞损伤能及时得以修复。NGF的这种作用可能主要是通过其与毛细胞及神经纤维上的特异性受体结合而激活细胞的蛋白激酶系统，使细胞内的cAMP增加，代谢活动增强。从噪声性听力损伤的代谢理论认为，噪声暴露后，内耳毛细胞对代谢的需求增加，可代偿性地通过血管扩张、血液流速增加、耗氧量增加等途径[2]，增加内耳的能量供应。本实验对照组动物耳蜗毛细胞SDH活性下降，说明毛细胞已经有能量代谢障碍。而实验组尤其是B，C两组动物SDH活性明显高于对照组，其病变程度则较轻。由于NGF可能对细胞的DNA及蛋白质合成有促进作用，这将为毛细胞代谢活动提供各种酶类，并为细胞及膜结构的修复提供结构蛋白，减少毛细胞的损伤或死亡。
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血-迷路屏障是保证内耳特殊功能所必需的重要系统[9]。由于NGF作为多肽类生长因子，尽管在血浆中的半衰期较短，不利于其疗效的发挥，但有实验证明NGF在注射后1 h, 血浆中仍能检测出它的活性[10]。使用肌肉给药途径，NGF要最终到达内耳外淋巴液发挥其作用，血-迷路屏障可能是其必经之路。本实验由于动物在每天用药后即暴露于115 dB(A)的强噪声中，连续噪声对内耳不断产生进行性损害，这种损害与使用氨基甙类药物所造成的内耳损害可能有相同之处。因此, 同时对血-迷路屏障也会造成不同程度的损伤[9]，这可能更有利于NGF进入内耳淋巴液发挥其生物学效应。关于NGF对抗噪声性听力损伤的确切机制还了解甚少，本研究仅作一些初步的探讨，并为NGF的开发及进一步应用NTFs防治噪声性耳聋提供一点实验依据。■
致谢 本研究得到第二军医大学神经生物学教研室主任路长林教授的热忱指导，以及该室赵小林实验师、严进博士的热心帮助；同时，得到海军医学研究所梁振福、史秀凤副研究员和杨玉明硕士的大力帮助与指导，以及本校生理学教研室章岚讲师、图书馆邱君瑞馆员的具体帮助，特此一并致谢。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870203)
作者简介：阮芳铭(1958～)，男(汉族)，硕士，讲师
参考文献：
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[3]郑向阳，高文元，阮芳铭，等.甲状腺激素对噪声性听力损伤的保护作用[J]. 中华航海医学杂志, 1994,1(1):23-26.
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收稿日期：1999-09-05
修回日期：1999-12-20, 百拇医药