锌缺乏对小鼠脑发育及功能影响的实验研究
作者：王福 赵法 郭俊生
单位：王福(海军医学第海军卫生学教研室)；赵法(第二军医大学卫生勤务学第军队卫生学教研室，上海 200433)；郭俊生(第二军医大学卫生勤务学第军队卫生学教研室，上海 200433)
关键词：锌缺乏；脑发育；学习记忆
第二军医大学学报000113 摘 要：目的：观察发育期(孕期和哺乳期)锌缺乏小鼠子代(成年)学习能力、海马长时程增强(LTP)、脑组织金属硫蛋白(MT)及其mRNA的表达情况，初步探讨发育期锌缺乏影响脑功能及发育的机制。方法：将80只刚怀孕ICR雌鼠随机分为5组：严重缺锌、轻度缺锌、适锌、高锌对喂及高锌组，饲料含锌量分别为1，5，30，100及100 mg/kg。各组小鼠在孕期和哺乳期均饲喂实验饲料，仔鼠断奶(出生第20天)后改饲喂普通饲料。70 d龄后，采用条件性回避反应模型测试仔鼠学习能力，然后在其海马脑片上进行诱导LTP的实验；采用Western blot和Northern blot技术检测其脑组织中MT蛋白及MT-ⅠmRNA表达情况。 结果：轻度缺锌组仔鼠达到学会标准所需次数明显多于高锌组(P<0.005)，而其脑片上诱导的LTP却显著低于高锌组(P<0.005)；脑组织中MT蛋白及MT-ⅠmRNA表达量的顺序为严重缺锌组<轻度缺锌组<适锌组<高锌对喂组<高锌组。 结论：发育期锌缺乏不但可造成学习能力下降、海马突触可塑性受损，同时还可使脑组织中MT蛋白及其mRNA表达降低；MT蛋白转录水平受阻可能是锌缺乏引发脑功能损伤的重要分子机制之一。
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中图分类号：R 591.1 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0038-04
Effect of zinc deficiency on development and function of mice brain
ZHAO Fa-Ji
(Department of Public of Health, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
GUO Jun-Sheng(Department of Public of Health, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
WANG Fu-Di
(Department of Navy Hygiene, Faculty of Navy Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective： To determine the mechanisms of zinc on brain development and function, we observed the learning ability, hippocampal long-term potentiation and brain metallothionein (MT) and mRNA expression in mice whose maternal were fed with zinc deficiency diets during pregnancy and lactation. Methods: The learning ability, hippocampal long-term potentiation, brain MT and mRNA expression at postnatal day 70 were examined with shuttle box, electric physiology, Western blot and Northern blot respectively, whose dams were fed with zinc-deficient diets during pregnancy and lactation. Results: The numbers of trials needed to reach the learning criterion for marginally zinc deficient group (5 mg/kg) offsprings were much more than that of high zinc supplementation group (100 mg/kg) offsprings. Long-term potentiation induced from brain slices of marginally zinc deficient group offsprings was smaller than that induced from high zinc supplementation group offsprings. The order of brain MT and mRNA expression level was severe zinc deficiency group (1 mg/kg) < marginal zinc deficiency group < adequate zinc supply group (30 mg/kg) < high zinc pair-fed group (100 mg/kg)< high zinc supplementation. Conclusion: Zinc deficiency results not only in injury of learning ability and decrease of hippocampal synaptic plasticity, but also inhibition of MT and mRNA expression. The inhibition of MT transcription may be one of important mechanisms of the impairment to brain development and function.
, 百拇医药
KEY WORDS：zinc deficiency; brain development; learning▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 38-41]
金属硫蛋白(MT)是低相对分子质量(6 000～7 000)的锌结合蛋白质。Ebadi等[1]研究发现大鼠脑MT在发育过程中表达量发生改变，提示其在脑的发育中可能具有重要生理功能。胚胎期和哺乳期是动物脑发育及功能形成的重要时期，不良因素的影响可导致脑功能严重缺损。有研究报道动物孕期严重锌缺乏(饲料含锌水平为1 mg/kg )将导致子代大脑先天畸形，孕后期至哺乳后期锌缺乏可引起小鼠被动回避反应迟缓及记忆能力的下降[2]。但有关锌缺乏损伤脑发育的机制目前还不十分清楚。一些研究资料发现如实验动物只在发育期饲喂缺锌饲料，动物成年时脑内锌水平并不低于饲喂正常锌水平饲料的动物，但学习记忆能力明显受损，提示锌缺乏引发脑功能损伤的原因不能用脑内锌水平改变来解释[2]。那么这种脑功能损伤是否与脑内重要锌离子稳态调节蛋白MT的表达量变化有关？为了探讨这个问题，我们观察了在母鼠孕期和哺乳期饲喂不同锌水平饲料的仔鼠的学习能力、海马脑片长时程增强(LTP)变化以及脑组织中MT及其Ⅰ型异构体(MT-Ⅰ)mRNA表达情况，为阐明缺锌影响脑发育的机制提供有意义的实验资料。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物 成年雌性ICR小鼠80只，由中国科学院实验动物中心提供，体质量21～24 g。在动物房普通饲料饲养适应1周。雌雄合笼，次日晨查有阴道栓即确认该雌鼠怀孕。怀孕母鼠按体质量随机分5组：严重缺锌组(SZD)、轻度缺锌组(MZD)、适锌组(AZS)、高锌对喂组(HZP)及高锌组(HZS)，饲料含锌量分别为1，5，30，100及100 mg/kg。HZP组和HZS组母鼠喂饲的饲料相同，含锌水平均为100 mg/kg；但控制HZP组的喂饲量，使其与SZD组母鼠的喂饲量相等。因为严重低锌膳食可使动物食欲降低、摄食减少，设定HZP组是为排除因喂饲量不同而造成的对动物生长发育的干扰，使实验结果只受锌水平影响[2]。各组动物在妊娠开始至出生后第20天(20 d龄，P20)进食不同锌水平实验饲料，21 d龄(P21)至成年(70 d龄，P70)各组实验动物均改喂正常饲料。记录实验动物饲养期内体质量增长情况。在P70时对轻度缺锌组和高锌组仔鼠进行学习能力及海马LTP的测试；收集P70各实验组仔鼠脑组织，每组6只，进行MT蛋白及MT-ⅠmRNA检测。动物饲养在塑料笼具内，自由饮用双蒸水，照明周期为12 h/d，室温为21～25℃。
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1.2 实验饲料 动物饲以参照美国营养协会报告的AIN-93G配方配制而成的纯化饲料[3]。配方中酪蛋白经EDTA-Na2漂洗数次，以清除锌离子。配方不加入锌源为严重缺锌饲料(饲料含锌量1 mg/kg)，其他各组饲料按不同要求加入ZnCO3，使饲料锌水平分别达到5，30和100 mg/kg。饲料贮存于-20℃备用。
1.3 行为训练及海马电生理记录 行为训练在穿梭箱内进行[4]。该装置有两个室：一个室内小鼠接受电击，另一个没有电击。一盏40 W电灯作为条件刺激，在灯光刺激后的5 s给予电击(40 V DC)，每分钟测试1次。多次训练后小鼠能在灯光刺激后的5 s内跑到另一室以逃避电击，为条件性回避反应。如果连续10次测试中出现9次条件性回避反应，即认为小鼠已经学会。行为检测结束后，小鼠在乙醚麻醉状态下剪头，取其右侧海马的中段，切成400 μm的脑片，进行脑片LTP诱导测定[5]。
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1.4 MT蛋白的免疫印迹检测[6] 取各组动物全脑，按照1∶2(m/V)加入组织提取液( 含EDTA 20 mmol/L, EGTA 10 mmol/L, PMSF 1 mmol/L, urea 2 mmol/L, DTT 1 mmol/L, Aprotinin 0.2 μg/ml的缓冲液，pH 7.6)，冰浴超声匀浆，1.5×104 r/min 4℃离心5 min，取上清液进行乙醇沉淀2次，Lowry法测定样品液蛋白量。进行SDS-PAGE(15%)分离，将蛋白电转移至尼龙膜(Amersham)；封闭液室温封闭1 h，封闭液即含1%小牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和0.5%正常羊血清(Gibco)的磷酸盐缓冲液；将封闭液倒净，加上稀释于封闭液中的第一抗体(兔抗大鼠MT，1∶500, Zymed)，4℃过夜；用漂洗液(即磷酸缓冲液中加入0.02% Tween-20和 0.5% BSA)洗膜10×3 min，洗去第一抗体，加入二抗(AP标记羊抗兔IgG, 1∶500，Zymed)，室温下反应1 h；漂洗液洗膜10×2 min，洗去二抗，加NBT-BCIP显色液(75 mg/ml NBT, 50 mg/ml BCIP, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2, 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 9.5，NBT，BCIP均为Sigma产品)避光反应，待所需条带清晰出现即终止反应，终止溶液为：20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.9。对尼龙膜进行拍照，并对条带进行密度扫描分析。
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1.5 MT-ⅠmRNA的Northern 杂交检测 大鼠肝MT-ⅠcDNA由美国Nebraska大学医学院Ebadi教授馈赠。用PSTⅠ酶切割含有大鼠肝MT-ⅠcDNA的pBR322质粒，进行α-32P-dATP标记。按常规方法进行操作。将杂交膜用吸水纸吸干后压片，-80℃ 48 h。冲洗X线片，并进行密度扫描。
1.6 统计学处理 对行为学训练及脑片LTP诱导结果采用t检验。
2 结果
2.1 锌缺乏对实验仔鼠体质量增长的影响 各组实验仔鼠的体质量增长速度以HZS组最快，SZD组最慢，其体质量增长的速度依次为HZS组>HZP组>AZS组>MZD组>SZD组；成年时(P70)各组体质量分别为(36.57±6.57)，(34.48±5.41)，(32.37±3.50)，(27.11±2.65)及(22.19±3.21)g，SZD组和MZD组P70体质量分别为HZS组的60.7%和74.1%。可见发育期锌缺乏可造成动物体质量增长缓慢。
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2.2 锌缺乏对实验仔鼠学习记忆的影响 孕期及哺乳期MZD组仔鼠达到学会标准所需的次数为(45.0±5.9,n＝7)明显多于HZS组的次数(34.7±3.9，n＝11)，两组比较有显著性差别(P<0.01)。
2.3 锌缺乏对实验仔鼠海马脑片LTP的影响 母鼠孕期及哺乳期MZD组(n＝5)仔鼠海马脑片上诱导的LTP仅为(36.8±9.8)%，而HZS组(n＝6)的LTP为(70.5±14.9)% ，明显高于MZD组(P<0.01)。该结果表明，母鼠孕期及哺乳期轻度锌缺乏即能影响仔鼠海马的突触可塑性，而突触可塑性被认为是学习记忆的神经基础。因此仔鼠学习能力的低下可能与突触可塑性的下降有关。
2.4 锌缺乏对实验仔鼠脑组织MT表达的影响 各实验组仔鼠脑组织均有相对分子质量约为6 200的MT印迹出现(图1A)，MT表达量的相对值分别为1(SZD组)，2.41(MZD组)，4.03(AZS组)，4.74(HZP组)及5.15(HZS组)，其MT表达量的顺序表现为SZD组
2.5 锌缺乏对实验仔鼠脑组织MT-Ⅰ mRNA表达的影响 各组实验仔鼠脑组织均有较强烈的MT-Ⅰ mRNA杂交条带出现(图1B)，但各组MT-Ⅰ mRNA的表达量明显不同，即表现出HZS组>HZP组>AZS组>MZD组>SZD组，HZS组MT-Ⅰ mRNA表达的相对值是MZD组的3.63倍，是SZD组的5.78倍。提示动物发育期饲喂缺锌饲料可使其成年脑MT-Ⅰ mRNA的表达量明显减少。
图1 发育期锌缺乏对成年仔鼠脑MT表达量(A)和脑MT-Ⅰ mRNA表达量(B)的影响
Fig 1 MT level (A) and MT-Ⅰ mRNA level (B) in adult mice with zinc deficiency during development
1: Severe zinc deficiency group (1 mg/kg); 2: Marginally zinc deficiency group (5 mg/kg); 3: Adequate zinc
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supply group (30 mg/kg); 4: High zinc pair-fed group (100 mg/kg); 5: High zinc supplement group (100 mg/kg)
3 讨论
微量元素锌主要是以通过与酶结合的“Zn2+代谢库”、与酶以外蛋白质结合的“Zn2+结构库”以及突触内含有的“Zn2+囊泡库”等3种形式存在于神经系统中。且锌离子在脑内存在区域性分布差异，其浓度以海马、视网膜、小脑及脑垂体为高。提示锌离子在脑中可能发挥重要作用，为此许多学者开辟了锌与脑功能和发育的研究[3]。本工作证实母鼠在孕期和哺乳期饲喂轻度缺锌饲料，会引起仔鼠出现学习记忆能力(穿梭箱法)的下降，提示发育期(孕期和哺乳期)是锌缺乏造成学习记忆能力低下的关键时期。
孕期缺锌而哺乳期以后饲喂含正常锌水平饲料可以使海马的锌离子含量恢复正常[7]，那么此时的大脑海马是否有功能改变？为此我们对母鼠锌缺乏的仔鼠海马CA1区诱导的LTP进行了检测，发现母鼠孕期和哺乳期轻度锌缺乏的仔鼠海马CA1区可诱导的LTP明显低于高锌组仔鼠脑片所诱导的反应，并发现轻度缺锌仔鼠学习能力的低下与海马CA1区的LTP降低有平行关系，即在学习能力好的小鼠海马CA1区诱导的LTP较高，说明母鼠孕期和哺乳期轻度缺锌的仔鼠学习能力的低下很可能是由于这一时期的缺锌影响了海马的发育，从而使海马的突触可塑性降低，可见预防孕哺期锌缺乏的重要性。
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以往一些研究及我们行为学和电生理部分研究表明，发育期锌缺乏可造成动物学习记忆能力的下降。因为哺乳期以后饲喂正常锌饲料可使动物海马锌离子含量恢复正常[7]，故这种脑功能的损伤并不是由于成年时脑中锌水平低下造成，而可能是由于发育期缺锌造成中枢神经系统发育的受损，如我们近期研究发现锌缺乏可引起胚胎发育过程中表达于神经上皮细胞的巢蛋白(nestin)、表达于神经元的神经微丝蛋白(NF)以及表达于星形胶质细胞的胶质酸性纤维蛋白(GFAP)等表达量改变(待发表)。Oteiza等[8]研究发现发育期轻度缺锌大鼠脑微管聚合作用降低。以上研究结果提示，发育期锌缺乏在生物体中枢神经系统发育早期已形成不可逆的器质性或功能性损伤。为进一步验证这个推理，我们检测了成年实验仔鼠脑组织中MT及其mRNA(MT-Ⅰ mRNA)的表达情况。结果发现发育期锌缺乏可造成动物成年时脑MT及mRNA表达量明显下降，这种低表达量的MT可能与其生物体功能的损伤存在联系。一些学者认为脑MT是脑内“锌库”，中枢神经系统中锌离子在调节兴奋性和抑制性氨基酸受体离子通道等方面具有重要作用，如Westbrook等[9]认为锌是极重要的内源性谷氨酸受体调节剂；Forsythe等[10]发现海马神经元中锌能阻滞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的兴奋性突触后电势。脑MT通过稳定锌浓度影响海马中氨基丁酸(GABA)的合成和NMDA受体的作用，从而参与海马苔藓纤维的突触传递活动，进而与脑功能间建立联系。脑中MT量下降，其调节锌离子稳态的能力必然受到影响，这可能是发育期锌缺乏损伤脑功能的重要机制所在。研究结果还提示锌在转录水平即调控脑MT的表达。
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大量实验表明锌主要是在转录水平通过基因调节蛋白对基因的特异表达进行调控的。目前发现含锌基因调节蛋白的锌结合位点至少有锌指(zinc finger)、锌簇(zinc cluster)和锌扭(zinc twist)三类结构。锌和蛋白质间的相互作用有助于解释锌在生物系统的重要功能。脑MT基因的表达与调控有着自己的许多特性，对脑MT基因表达调控及其与膳食锌关系的深入研究，必将揭示出脑MT及其锌在脑中的重要功能。本研究脑组织MT及其mRNA表达下降是发育期锌缺乏损伤脑发育及功能的重要机制之一，但缺锌-中枢神经系统发育-脑MT表达下降-脑功能受损之间的详细机制有待进一步实验研究。■
致谢 中国科学院上海生理研究所梅镇彤研究员、马晓峰博士及段书慧女士在行为实验及电生理检测方面给予了大力协助，特此谢忱。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770643)；全军“九五”青年基金资助项目(98Q043)
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作者简介：王福
(1968～)，男(汉族)，博士，讲师
参考文献：
[1]Ebadi M. Biochemical alteration of a metallothionein-like protein in developing rat brain[J]. Biol Trace Elem Res,1986,11(2)：117-128.
[2]Golub MS, Keen CL, Gershwin ME, et al. Developmental zinc deficiency and behavior[J]. J Nutr, 1995, 125(8 s):2263s-2271s.
[3]Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutration Ad Hoc Writing Committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J]. J Nutr, 1993,123(11):1939-1951.
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[6]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 金冬雁，黎孟枫, 译. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社, 1992. 869-897.
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[8]Oteiza PI, Hurley LS, Lonnerdal B,et al. Effects of marginal zinc deficiency on microtubule polymerization in the developing rat brain[J]. Biol Trace Elem Res, 1990,24(1): 13-23.
[9]Westbrook GH , Mayer ML. Micromolar concentration of Zn2+ antagonize NMDA and GABA responses of hippocampal neurons[J]. Nature,1987, 328(6131):640-643.
[10] Forsythe ID, Westbrook GI, Mayer ML. Modulation of excitatory synaptic transmission by glycine and zinc in cultures of mouse hippocampal neurons[J]. J Neurosci, 1988, 8(5):3733-3741.
收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-12-15, http://www.100md.com
单位：王福(海军医学第海军卫生学教研室)；赵法(第二军医大学卫生勤务学第军队卫生学教研室，上海 200433)；郭俊生(第二军医大学卫生勤务学第军队卫生学教研室，上海 200433)
关键词：锌缺乏；脑发育；学习记忆
第二军医大学学报000113 摘 要：目的：观察发育期(孕期和哺乳期)锌缺乏小鼠子代(成年)学习能力、海马长时程增强(LTP)、脑组织金属硫蛋白(MT)及其mRNA的表达情况，初步探讨发育期锌缺乏影响脑功能及发育的机制。方法：将80只刚怀孕ICR雌鼠随机分为5组：严重缺锌、轻度缺锌、适锌、高锌对喂及高锌组，饲料含锌量分别为1，5，30，100及100 mg/kg。各组小鼠在孕期和哺乳期均饲喂实验饲料，仔鼠断奶(出生第20天)后改饲喂普通饲料。70 d龄后，采用条件性回避反应模型测试仔鼠学习能力，然后在其海马脑片上进行诱导LTP的实验；采用Western blot和Northern blot技术检测其脑组织中MT蛋白及MT-ⅠmRNA表达情况。 结果：轻度缺锌组仔鼠达到学会标准所需次数明显多于高锌组(P<0.005)，而其脑片上诱导的LTP却显著低于高锌组(P<0.005)；脑组织中MT蛋白及MT-ⅠmRNA表达量的顺序为严重缺锌组<轻度缺锌组<适锌组<高锌对喂组<高锌组。 结论：发育期锌缺乏不但可造成学习能力下降、海马突触可塑性受损，同时还可使脑组织中MT蛋白及其mRNA表达降低；MT蛋白转录水平受阻可能是锌缺乏引发脑功能损伤的重要分子机制之一。
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中图分类号：R 591.1 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0038-04
Effect of zinc deficiency on development and function of mice brain
ZHAO Fa-Ji
(Department of Public of Health, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
GUO Jun-Sheng(Department of Public of Health, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
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WANG Fu-Di
(Department of Navy Hygiene, Faculty of Navy Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ABSTRACT：Objective： To determine the mechanisms of zinc on brain development and function, we observed the learning ability, hippocampal long-term potentiation and brain metallothionein (MT) and mRNA expression in mice whose maternal were fed with zinc deficiency diets during pregnancy and lactation. Methods: The learning ability, hippocampal long-term potentiation, brain MT and mRNA expression at postnatal day 70 were examined with shuttle box, electric physiology, Western blot and Northern blot respectively, whose dams were fed with zinc-deficient diets during pregnancy and lactation. Results: The numbers of trials needed to reach the learning criterion for marginally zinc deficient group (5 mg/kg) offsprings were much more than that of high zinc supplementation group (100 mg/kg) offsprings. Long-term potentiation induced from brain slices of marginally zinc deficient group offsprings was smaller than that induced from high zinc supplementation group offsprings. The order of brain MT and mRNA expression level was severe zinc deficiency group (1 mg/kg) < marginal zinc deficiency group < adequate zinc supply group (30 mg/kg) < high zinc pair-fed group (100 mg/kg)< high zinc supplementation. Conclusion: Zinc deficiency results not only in injury of learning ability and decrease of hippocampal synaptic plasticity, but also inhibition of MT and mRNA expression. The inhibition of MT transcription may be one of important mechanisms of the impairment to brain development and function.
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KEY WORDS：zinc deficiency; brain development; learning▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 38-41]
金属硫蛋白(MT)是低相对分子质量(6 000～7 000)的锌结合蛋白质。Ebadi等[1]研究发现大鼠脑MT在发育过程中表达量发生改变，提示其在脑的发育中可能具有重要生理功能。胚胎期和哺乳期是动物脑发育及功能形成的重要时期，不良因素的影响可导致脑功能严重缺损。有研究报道动物孕期严重锌缺乏(饲料含锌水平为1 mg/kg )将导致子代大脑先天畸形，孕后期至哺乳后期锌缺乏可引起小鼠被动回避反应迟缓及记忆能力的下降[2]。但有关锌缺乏损伤脑发育的机制目前还不十分清楚。一些研究资料发现如实验动物只在发育期饲喂缺锌饲料，动物成年时脑内锌水平并不低于饲喂正常锌水平饲料的动物，但学习记忆能力明显受损，提示锌缺乏引发脑功能损伤的原因不能用脑内锌水平改变来解释[2]。那么这种脑功能损伤是否与脑内重要锌离子稳态调节蛋白MT的表达量变化有关？为了探讨这个问题，我们观察了在母鼠孕期和哺乳期饲喂不同锌水平饲料的仔鼠的学习能力、海马脑片长时程增强(LTP)变化以及脑组织中MT及其Ⅰ型异构体(MT-Ⅰ)mRNA表达情况，为阐明缺锌影响脑发育的机制提供有意义的实验资料。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 成年雌性ICR小鼠80只，由中国科学院实验动物中心提供，体质量21～24 g。在动物房普通饲料饲养适应1周。雌雄合笼，次日晨查有阴道栓即确认该雌鼠怀孕。怀孕母鼠按体质量随机分5组：严重缺锌组(SZD)、轻度缺锌组(MZD)、适锌组(AZS)、高锌对喂组(HZP)及高锌组(HZS)，饲料含锌量分别为1，5，30，100及100 mg/kg。HZP组和HZS组母鼠喂饲的饲料相同，含锌水平均为100 mg/kg；但控制HZP组的喂饲量，使其与SZD组母鼠的喂饲量相等。因为严重低锌膳食可使动物食欲降低、摄食减少，设定HZP组是为排除因喂饲量不同而造成的对动物生长发育的干扰，使实验结果只受锌水平影响[2]。各组动物在妊娠开始至出生后第20天(20 d龄，P20)进食不同锌水平实验饲料，21 d龄(P21)至成年(70 d龄，P70)各组实验动物均改喂正常饲料。记录实验动物饲养期内体质量增长情况。在P70时对轻度缺锌组和高锌组仔鼠进行学习能力及海马LTP的测试；收集P70各实验组仔鼠脑组织，每组6只，进行MT蛋白及MT-ⅠmRNA检测。动物饲养在塑料笼具内，自由饮用双蒸水，照明周期为12 h/d，室温为21～25℃。
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1.2 实验饲料 动物饲以参照美国营养协会报告的AIN-93G配方配制而成的纯化饲料[3]。配方中酪蛋白经EDTA-Na2漂洗数次，以清除锌离子。配方不加入锌源为严重缺锌饲料(饲料含锌量1 mg/kg)，其他各组饲料按不同要求加入ZnCO3，使饲料锌水平分别达到5，30和100 mg/kg。饲料贮存于-20℃备用。
1.3 行为训练及海马电生理记录 行为训练在穿梭箱内进行[4]。该装置有两个室：一个室内小鼠接受电击，另一个没有电击。一盏40 W电灯作为条件刺激，在灯光刺激后的5 s给予电击(40 V DC)，每分钟测试1次。多次训练后小鼠能在灯光刺激后的5 s内跑到另一室以逃避电击，为条件性回避反应。如果连续10次测试中出现9次条件性回避反应，即认为小鼠已经学会。行为检测结束后，小鼠在乙醚麻醉状态下剪头，取其右侧海马的中段，切成400 μm的脑片，进行脑片LTP诱导测定[5]。
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1.4 MT蛋白的免疫印迹检测[6] 取各组动物全脑，按照1∶2(m/V)加入组织提取液( 含EDTA 20 mmol/L, EGTA 10 mmol/L, PMSF 1 mmol/L, urea 2 mmol/L, DTT 1 mmol/L, Aprotinin 0.2 μg/ml的缓冲液，pH 7.6)，冰浴超声匀浆，1.5×104 r/min 4℃离心5 min，取上清液进行乙醇沉淀2次，Lowry法测定样品液蛋白量。进行SDS-PAGE(15%)分离，将蛋白电转移至尼龙膜(Amersham)；封闭液室温封闭1 h，封闭液即含1%小牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和0.5%正常羊血清(Gibco)的磷酸盐缓冲液；将封闭液倒净，加上稀释于封闭液中的第一抗体(兔抗大鼠MT，1∶500, Zymed)，4℃过夜；用漂洗液(即磷酸缓冲液中加入0.02% Tween-20和 0.5% BSA)洗膜10×3 min，洗去第一抗体，加入二抗(AP标记羊抗兔IgG, 1∶500，Zymed)，室温下反应1 h；漂洗液洗膜10×2 min，洗去二抗，加NBT-BCIP显色液(75 mg/ml NBT, 50 mg/ml BCIP, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2, 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 9.5，NBT，BCIP均为Sigma产品)避光反应，待所需条带清晰出现即终止反应，终止溶液为：20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.9。对尼龙膜进行拍照，并对条带进行密度扫描分析。
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1.5 MT-ⅠmRNA的Northern 杂交检测 大鼠肝MT-ⅠcDNA由美国Nebraska大学医学院Ebadi教授馈赠。用PSTⅠ酶切割含有大鼠肝MT-ⅠcDNA的pBR322质粒，进行α-32P-dATP标记。按常规方法进行操作。将杂交膜用吸水纸吸干后压片，-80℃ 48 h。冲洗X线片，并进行密度扫描。
1.6 统计学处理 对行为学训练及脑片LTP诱导结果采用t检验。
2 结果
2.1 锌缺乏对实验仔鼠体质量增长的影响 各组实验仔鼠的体质量增长速度以HZS组最快，SZD组最慢，其体质量增长的速度依次为HZS组>HZP组>AZS组>MZD组>SZD组；成年时(P70)各组体质量分别为(36.57±6.57)，(34.48±5.41)，(32.37±3.50)，(27.11±2.65)及(22.19±3.21)g，SZD组和MZD组P70体质量分别为HZS组的60.7%和74.1%。可见发育期锌缺乏可造成动物体质量增长缓慢。
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2.2 锌缺乏对实验仔鼠学习记忆的影响 孕期及哺乳期MZD组仔鼠达到学会标准所需的次数为(45.0±5.9,n＝7)明显多于HZS组的次数(34.7±3.9，n＝11)，两组比较有显著性差别(P<0.01)。
2.3 锌缺乏对实验仔鼠海马脑片LTP的影响 母鼠孕期及哺乳期MZD组(n＝5)仔鼠海马脑片上诱导的LTP仅为(36.8±9.8)%，而HZS组(n＝6)的LTP为(70.5±14.9)% ，明显高于MZD组(P<0.01)。该结果表明，母鼠孕期及哺乳期轻度锌缺乏即能影响仔鼠海马的突触可塑性，而突触可塑性被认为是学习记忆的神经基础。因此仔鼠学习能力的低下可能与突触可塑性的下降有关。
2.4 锌缺乏对实验仔鼠脑组织MT表达的影响 各实验组仔鼠脑组织均有相对分子质量约为6 200的MT印迹出现(图1A)，MT表达量的相对值分别为1(SZD组)，2.41(MZD组)，4.03(AZS组)，4.74(HZP组)及5.15(HZS组)，其MT表达量的顺序表现为SZD组
2.5 锌缺乏对实验仔鼠脑组织MT-Ⅰ mRNA表达的影响 各组实验仔鼠脑组织均有较强烈的MT-Ⅰ mRNA杂交条带出现(图1B)，但各组MT-Ⅰ mRNA的表达量明显不同，即表现出HZS组>HZP组>AZS组>MZD组>SZD组，HZS组MT-Ⅰ mRNA表达的相对值是MZD组的3.63倍，是SZD组的5.78倍。提示动物发育期饲喂缺锌饲料可使其成年脑MT-Ⅰ mRNA的表达量明显减少。
图1 发育期锌缺乏对成年仔鼠脑MT表达量(A)和脑MT-Ⅰ mRNA表达量(B)的影响
Fig 1 MT level (A) and MT-Ⅰ mRNA level (B) in adult mice with zinc deficiency during development
1: Severe zinc deficiency group (1 mg/kg); 2: Marginally zinc deficiency group (5 mg/kg); 3: Adequate zinc
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supply group (30 mg/kg); 4: High zinc pair-fed group (100 mg/kg); 5: High zinc supplement group (100 mg/kg)
3 讨论
微量元素锌主要是以通过与酶结合的“Zn2+代谢库”、与酶以外蛋白质结合的“Zn2+结构库”以及突触内含有的“Zn2+囊泡库”等3种形式存在于神经系统中。且锌离子在脑内存在区域性分布差异，其浓度以海马、视网膜、小脑及脑垂体为高。提示锌离子在脑中可能发挥重要作用，为此许多学者开辟了锌与脑功能和发育的研究[3]。本工作证实母鼠在孕期和哺乳期饲喂轻度缺锌饲料，会引起仔鼠出现学习记忆能力(穿梭箱法)的下降，提示发育期(孕期和哺乳期)是锌缺乏造成学习记忆能力低下的关键时期。
孕期缺锌而哺乳期以后饲喂含正常锌水平饲料可以使海马的锌离子含量恢复正常[7]，那么此时的大脑海马是否有功能改变？为此我们对母鼠锌缺乏的仔鼠海马CA1区诱导的LTP进行了检测，发现母鼠孕期和哺乳期轻度锌缺乏的仔鼠海马CA1区可诱导的LTP明显低于高锌组仔鼠脑片所诱导的反应，并发现轻度缺锌仔鼠学习能力的低下与海马CA1区的LTP降低有平行关系，即在学习能力好的小鼠海马CA1区诱导的LTP较高，说明母鼠孕期和哺乳期轻度缺锌的仔鼠学习能力的低下很可能是由于这一时期的缺锌影响了海马的发育，从而使海马的突触可塑性降低，可见预防孕哺期锌缺乏的重要性。
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以往一些研究及我们行为学和电生理部分研究表明，发育期锌缺乏可造成动物学习记忆能力的下降。因为哺乳期以后饲喂正常锌饲料可使动物海马锌离子含量恢复正常[7]，故这种脑功能的损伤并不是由于成年时脑中锌水平低下造成，而可能是由于发育期缺锌造成中枢神经系统发育的受损，如我们近期研究发现锌缺乏可引起胚胎发育过程中表达于神经上皮细胞的巢蛋白(nestin)、表达于神经元的神经微丝蛋白(NF)以及表达于星形胶质细胞的胶质酸性纤维蛋白(GFAP)等表达量改变(待发表)。Oteiza等[8]研究发现发育期轻度缺锌大鼠脑微管聚合作用降低。以上研究结果提示，发育期锌缺乏在生物体中枢神经系统发育早期已形成不可逆的器质性或功能性损伤。为进一步验证这个推理，我们检测了成年实验仔鼠脑组织中MT及其mRNA(MT-Ⅰ mRNA)的表达情况。结果发现发育期锌缺乏可造成动物成年时脑MT及mRNA表达量明显下降，这种低表达量的MT可能与其生物体功能的损伤存在联系。一些学者认为脑MT是脑内“锌库”，中枢神经系统中锌离子在调节兴奋性和抑制性氨基酸受体离子通道等方面具有重要作用，如Westbrook等[9]认为锌是极重要的内源性谷氨酸受体调节剂；Forsythe等[10]发现海马神经元中锌能阻滞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的兴奋性突触后电势。脑MT通过稳定锌浓度影响海马中氨基丁酸(GABA)的合成和NMDA受体的作用，从而参与海马苔藓纤维的突触传递活动，进而与脑功能间建立联系。脑中MT量下降，其调节锌离子稳态的能力必然受到影响，这可能是发育期锌缺乏损伤脑功能的重要机制所在。研究结果还提示锌在转录水平即调控脑MT的表达。
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大量实验表明锌主要是在转录水平通过基因调节蛋白对基因的特异表达进行调控的。目前发现含锌基因调节蛋白的锌结合位点至少有锌指(zinc finger)、锌簇(zinc cluster)和锌扭(zinc twist)三类结构。锌和蛋白质间的相互作用有助于解释锌在生物系统的重要功能。脑MT基因的表达与调控有着自己的许多特性，对脑MT基因表达调控及其与膳食锌关系的深入研究，必将揭示出脑MT及其锌在脑中的重要功能。本研究脑组织MT及其mRNA表达下降是发育期锌缺乏损伤脑发育及功能的重要机制之一，但缺锌-中枢神经系统发育-脑MT表达下降-脑功能受损之间的详细机制有待进一步实验研究。■
致谢 中国科学院上海生理研究所梅镇彤研究员、马晓峰博士及段书慧女士在行为实验及电生理检测方面给予了大力协助，特此谢忱。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770643)；全军“九五”青年基金资助项目(98Q043)
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作者简介：王福
(1968～)，男(汉族)，博士，讲师参考文献：
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收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-12-15, http://www.100md.com