重组人Ⅸ因子逆转录病毒载体在肌细胞中的表达
作者：王雪松 王健民
单位：王雪松(第二军医大学长海医院呼吸科，上海 200433)；王健民(血液科)；(血液科)
关键词：血友病；基因治疗；逆转录病毒载体；成肌细胞
第二军医大学学报000111 摘要：目的：观察肌细胞特异性表达hFⅨ重组逆转录病毒载体(RV-hFⅨ)体外转染成肌细胞后的表达效果。方法：采用产病毒细胞株pdLⅨm1β A200Me1/PA317和pdLⅨm2β A200Me1/PA317培养上清，体外转染原代人胎、联合免疫缺陷(SCID)小鼠及C57鼠成肌细胞，ELISA法检测细胞培养上清中hFⅨ分泌水平。结果：不同来源成肌细胞经两种载体转染后均有hFⅨ蛋白分泌，其中人胎成肌细胞表达优于鼠源成肌细胞，106个细胞，24 h表达最高值为(792±49) ng。成肌细胞分化后hFⅨ分泌水平高于分化前。结论：RV-hFⅨ体外转染成肌细胞后可表达较高量的目的蛋白。
, 百拇医药
中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0031-03
Expression of recombinant human factor Ⅸ gene in muscle cells in vitro
WANG Xue-Song
( Department of Respiration，Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433，China)
WANG Jian-Min
(Department of Hematology)
, 百拇医药
(Department of Hematology)
ABSTRACT：Objective: To observe the expression of muscle-specific RV-hFⅨ in myoblasts and myotubes. Methods: After primary myoblasts were obtained,they were transfected with RV-hFⅨ pdLⅨm1βA200Me1 and pdLⅨm2βA200Me1. The hFⅨ protein secreted by the transfected cells in the medium were assayed by enzyme-linked immunosordent assay with monocolonal anti-human hFⅨ antibody. Results：Recombinant protein were secreted by myoblasts transfected with RV-hFⅨ, the transfected human fetal ones were the best among myoblasts isolated from 3 sourses，which produced (792±49) ng hFⅨ/106 cells per 24 h. Conclusion: Myoblasts transfected with RV-hFⅨ can effectively secrete hFⅨ protein.
, 百拇医药
KEY WORDS：hemophilia ；gene therapy； retrovirus vector； myoblast▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 31-33]
自从1991年Dhawan等[1]提出成肌细胞途径基因治疗的设想后，成肌细胞因具有多方面的优点成为广受关注的靶细胞[2]。本研究选用含有肌细胞特异性增强子的逆转录病毒载体，以鼠成肌细胞作为对照，研究了以原代培养的人(胎)成肌细胞作为靶细胞进行基因治疗血友病乙的可行性。
1 材料和方法
1.1 试剂 鼠抗hFⅨ单克隆抗体(AHⅨ-5041,Haematologic Technologies Inc.)；标记有辣根过氧化物酶的兔抗hFⅨ多克隆抗体[3]、标准血清由本实验室提供。
, http://www.100md.com
1.2 细胞 pdLⅨm1βA200Me1/PA317细胞株、pdLⅨm2βA200Me1/PA317细胞株均由本实验室提供[4]；人胎成肌细胞、SCID小鼠成肌细胞、C57鼠成肌细胞参照下文方法分离培养。
1.3 仪器和用品 DG3200酶联免疫检测仪，华东电子管厂制造；聚氯乙烯酶标板，购自华美公司。
1.4 原代成肌细胞的分离和培养 无菌分离水囊引产(2 h内)胎儿、SCID小鼠及C57幼鼠骨骼肌组织，置于成肌细胞增殖培养液中，4℃放置3～4 d后，剪成1～2 mm3大小颗粒，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃孵箱中消化30～40 min，终止胰酶反应，180目铜网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清，以10 ml成肌细胞增殖培养液稀释预培养于玻璃培养皿中30 min，待大部分成纤维细胞贴壁后，取上清细胞悬液1 ml转入明胶包被的塑料培养皿中，置37℃, 5% CO2孵箱中，培育单克隆成肌细胞。
, 百拇医药
1.5 产病毒细胞的培养及含病毒培养上清的收集 转入逆转录病毒载体的PA317细胞经培养扩增后，以1×107细胞接种于直径10 cm培养皿，加10 ml培养液，待细胞长满，每24 h更换新鲜培养液，同时收集上清，离心、沉淀去除细胞碎片及杂质，病毒悬液用于转染肌细胞或置-70℃储存备用。
1.6 转染 成肌细胞以1×105个/孔接种于6孔板，在5% CO2，37℃条件下培养24 h，换以病毒悬液2 ml，加入polybrene使其终质量浓度为8 μg/ml，轻轻混匀。转染24 h，每组3个复孔。转染完毕后，更换增殖培养液每孔2 ml，每日换液，留取上清待检。2 h后，应用马血清诱导分化3 d，更换增殖培养液后，收集24 h培养上清。
1.7 hFⅨ浓度测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)测定分化前后细胞培养液中hFⅨ浓度[5]。
, 百拇医药
1.8 统计学处理 所有定量指标以
±s表示，采用方差分析进行显著性检验。
2 结果
2.1 pdLⅨm1βA200Me1载体转染效果 3种成肌细胞分化前后hFⅨ的分泌水平(每106个细胞每24 h)分别为：胎成肌细胞为(551±65)，(585±70) ng；SCID小鼠为(69±21)， (64±20) ng；C57鼠为(85±34)，(238±40) ng，其中人胎成肌细胞表达量最高(P<0.01)。
2.2 pdLⅨm2βA200Me1载体转染胎肌细胞效果 转染后加诱导分化液前，第1，2天hFⅨ表达水平(每106个细胞每24 h)分别为(417±17)，(476±33) ng； 2%马血清诱导分化期间，第3，4，5天hFⅨ表达水平为(241±99)，(182±17)，(135±17) ng；诱导分化后(第6天)hFⅨ表达水平为(792±49) ng，分化后表达水平明显高于分化前(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 两种载体转染人胎成肌细胞效果比较 两种载体转染人胎成肌细胞后，均获得一定量的hFⅨ表达，分化后均高于分化前，载体pdLⅨm1βA200Me1分化前后为(每106个细胞每24 h) (551±65)及(585±70) ng，无显著性差别。两种载体在细胞分化前无显著差别，而细胞分化后，载体pdLⅨm2βA200 Me1表达水平明显高于载体pdLⅨm1βA200Me1，而且分化后(792±49) ng明显高于分化前(475±33) ng (P<0.01)。
3 讨论
优化表达载体是建立长效基因治疗方法的关键，本实验所用载体来源于Moloney小鼠白血病病毒，去除了3′长末端重复序列(LTR)中的增强子并插入hFⅨ表达单位，其转录方向与LTR转录方向相反。该表达单位包括hFⅨ微型基因(m1或m2为hFⅨ cDNA并插入不同长度hFⅨ第一内含子片段)、1个肌肌酸激酶增强子(Me1)、一个βA200启动子，及hFⅨ基因加多聚腺苷酸尾信号片段。
, 百拇医药
本实验所用两种载体(pdLⅨm1βA200Me1及pdLⅨm2βA200Me1)中，均引入了肌肌酸激酶增强子，目的是增强细胞分化后的表达效率。在体内自然的情况下，只有当成肌细胞分化为肌细胞后，Me增强子才发挥作用[6]，从而使肌肌酸激酶在成肌细胞不表达或含量极低，在分化后的肌细胞中含量则很高。由实验结果看，以pdLⅨm1βA200Me1转染胎、SCID小鼠及C57小鼠成肌细胞后，分化后表达高于或接近于分化前；以pdLⅨm2βA200Me1转染胎肌细胞后，分化后明显高于分化前，说明该增强子的引入明显提高了细胞分化后的目的蛋白分泌，并保证了外源基因表达的持续性。
导入基因的同源性在一定程度上影响着目的基因的转录、翻译、及蛋白质的翻译后加工、修饰以及分泌，在本实验中，转染后的人胎成肌细胞hFⅨ表达水平明显高于其他两鼠源成肌细胞，其原因可能就在于此。所以我们着重采用人胎成肌细胞为靶细胞，对两种不同构建的载体的表达水平进行了比较。
, 百拇医药
pdLⅨm2βA200Me1/PA317细胞培养上清转染人胎成肌细胞后，发现分化后明显高于分化前，而且明显高于载体pdLⅨm1βA200Me1的表达水平，表明m2微型基因较m1有明显的优越性。m1同m2的主要区别在于内含子长度，m2较m1短1.1 kb，在功能相同的情况下，在一定范围内目的基因较短，重组逆转录病毒载体的包装和感染效率较高。由于hFⅨ表达单位反向插入表达载体中，m1的内含子中存在潜在的polyA信号AATAAA，有可能产生不完整的病毒载体颗粒，故而表达水平较低(未发表资料)。提示为提高目的蛋白的表达，目的基因的修饰是非常重要的。
总之，本实验结果表明逆转录病毒载体(RV-hFⅨ)体外转染成肌细胞后可表达较高量的目的蛋白；载体结构的优化以及靶细胞选择是影响目的基因在靶细胞中表达效果的两个主要因素；为肌细胞途径基因治疗血友病乙的可行性提供了实验依据。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370321)；上海市科委留学回国人员启动基金资助项目(1997-24)
作者简介：王雪松(1969～)，女(汉族)，博士生
参考文献：
[1]Dhawan J, Pan LC, Paviath GK, et al. Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts[J]. Science,1991，254 (5037)：1509-1512.
[2]Kotoku K, Yao SN. Gene therapy by myoblast-mediated gene transfer[J]. Somat Gene Ther， 1995，8(1):121-126.
, http://www.100md.com
[3]Yao SN,Wilson JM,Nabel EG, et al. Expression of human factor Ⅸ in rat capillary endothelial cells: toward somatic gene therapy for hemophilia B[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88(18):8101-8105.
[4]Wang JM, Zheng H, Yuichi S, et al. Construction of human factor Ⅸ expression vectors in retroviral vector frames optimized for muscle cells[J]. Human Gene Therapy， 1996，7(14)：1743-1756.
[5]Kurachi S, Httomi Y, Furukawa M, et al. Role of intron I in expression of the human factor Ⅸ gene[J]. J Biol Chem，1995，270(10):5276-5281.
[6]Yao SN,Smitsh KJ, Kurachi K.Primary myoblast-mediated gene transfer: persistent expression of human factor Ⅸ in mice[J]. Gene Ther，1994，1(2):99-107.
收稿日期：1999-09-11
修回日期：1999-12-02, http://www.100md.com
单位：王雪松(第二军医大学长海医院呼吸科，上海 200433)；王健民(血液科)；(血液科)
关键词：血友病；基因治疗；逆转录病毒载体；成肌细胞
第二军医大学学报000111 摘要：目的：观察肌细胞特异性表达hFⅨ重组逆转录病毒载体(RV-hFⅨ)体外转染成肌细胞后的表达效果。方法：采用产病毒细胞株pdLⅨm1β A200Me1/PA317和pdLⅨm2β A200Me1/PA317培养上清，体外转染原代人胎、联合免疫缺陷(SCID)小鼠及C57鼠成肌细胞，ELISA法检测细胞培养上清中hFⅨ分泌水平。结果：不同来源成肌细胞经两种载体转染后均有hFⅨ蛋白分泌，其中人胎成肌细胞表达优于鼠源成肌细胞，106个细胞，24 h表达最高值为(792±49) ng。成肌细胞分化后hFⅨ分泌水平高于分化前。结论：RV-hFⅨ体外转染成肌细胞后可表达较高量的目的蛋白。
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中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0031-03
Expression of recombinant human factor Ⅸ gene in muscle cells in vitro
WANG Xue-Song
( Department of Respiration，Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433，China)
WANG Jian-Min
(Department of Hematology)
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(Department of Hematology)
ABSTRACT：Objective: To observe the expression of muscle-specific RV-hFⅨ in myoblasts and myotubes. Methods: After primary myoblasts were obtained,they were transfected with RV-hFⅨ pdLⅨm1βA200Me1 and pdLⅨm2βA200Me1. The hFⅨ protein secreted by the transfected cells in the medium were assayed by enzyme-linked immunosordent assay with monocolonal anti-human hFⅨ antibody. Results：Recombinant protein were secreted by myoblasts transfected with RV-hFⅨ, the transfected human fetal ones were the best among myoblasts isolated from 3 sourses，which produced (792±49) ng hFⅨ/106 cells per 24 h. Conclusion: Myoblasts transfected with RV-hFⅨ can effectively secrete hFⅨ protein.
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KEY WORDS：hemophilia ；gene therapy； retrovirus vector； myoblast▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 31-33]
自从1991年Dhawan等[1]提出成肌细胞途径基因治疗的设想后，成肌细胞因具有多方面的优点成为广受关注的靶细胞[2]。本研究选用含有肌细胞特异性增强子的逆转录病毒载体，以鼠成肌细胞作为对照，研究了以原代培养的人(胎)成肌细胞作为靶细胞进行基因治疗血友病乙的可行性。
1 材料和方法
1.1 试剂 鼠抗hFⅨ单克隆抗体(AHⅨ-5041,Haematologic Technologies Inc.)；标记有辣根过氧化物酶的兔抗hFⅨ多克隆抗体[3]、标准血清由本实验室提供。
, http://www.100md.com
1.2 细胞 pdLⅨm1βA200Me1/PA317细胞株、pdLⅨm2βA200Me1/PA317细胞株均由本实验室提供[4]；人胎成肌细胞、SCID小鼠成肌细胞、C57鼠成肌细胞参照下文方法分离培养。
1.3 仪器和用品 DG3200酶联免疫检测仪，华东电子管厂制造；聚氯乙烯酶标板，购自华美公司。
1.4 原代成肌细胞的分离和培养 无菌分离水囊引产(2 h内)胎儿、SCID小鼠及C57幼鼠骨骼肌组织，置于成肌细胞增殖培养液中，4℃放置3～4 d后，剪成1～2 mm3大小颗粒，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃孵箱中消化30～40 min，终止胰酶反应，180目铜网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清，以10 ml成肌细胞增殖培养液稀释预培养于玻璃培养皿中30 min，待大部分成纤维细胞贴壁后，取上清细胞悬液1 ml转入明胶包被的塑料培养皿中，置37℃, 5% CO2孵箱中，培育单克隆成肌细胞。
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1.5 产病毒细胞的培养及含病毒培养上清的收集 转入逆转录病毒载体的PA317细胞经培养扩增后，以1×107细胞接种于直径10 cm培养皿，加10 ml培养液，待细胞长满，每24 h更换新鲜培养液，同时收集上清，离心、沉淀去除细胞碎片及杂质，病毒悬液用于转染肌细胞或置-70℃储存备用。
1.6 转染 成肌细胞以1×105个/孔接种于6孔板，在5% CO2，37℃条件下培养24 h，换以病毒悬液2 ml，加入polybrene使其终质量浓度为8 μg/ml，轻轻混匀。转染24 h，每组3个复孔。转染完毕后，更换增殖培养液每孔2 ml，每日换液，留取上清待检。2 h后，应用马血清诱导分化3 d，更换增殖培养液后，收集24 h培养上清。
1.7 hFⅨ浓度测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)测定分化前后细胞培养液中hFⅨ浓度[5]。
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1.8 统计学处理 所有定量指标以
±s表示，采用方差分析进行显著性检验。2 结果
2.1 pdLⅨm1βA200Me1载体转染效果 3种成肌细胞分化前后hFⅨ的分泌水平(每106个细胞每24 h)分别为：胎成肌细胞为(551±65)，(585±70) ng；SCID小鼠为(69±21)， (64±20) ng；C57鼠为(85±34)，(238±40) ng，其中人胎成肌细胞表达量最高(P<0.01)。
2.2 pdLⅨm2βA200Me1载体转染胎肌细胞效果 转染后加诱导分化液前，第1，2天hFⅨ表达水平(每106个细胞每24 h)分别为(417±17)，(476±33) ng； 2%马血清诱导分化期间，第3，4，5天hFⅨ表达水平为(241±99)，(182±17)，(135±17) ng；诱导分化后(第6天)hFⅨ表达水平为(792±49) ng，分化后表达水平明显高于分化前(P<0.01)。
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2.3 两种载体转染人胎成肌细胞效果比较 两种载体转染人胎成肌细胞后，均获得一定量的hFⅨ表达，分化后均高于分化前，载体pdLⅨm1βA200Me1分化前后为(每106个细胞每24 h) (551±65)及(585±70) ng，无显著性差别。两种载体在细胞分化前无显著差别，而细胞分化后，载体pdLⅨm2βA200 Me1表达水平明显高于载体pdLⅨm1βA200Me1，而且分化后(792±49) ng明显高于分化前(475±33) ng (P<0.01)。
3 讨论
优化表达载体是建立长效基因治疗方法的关键，本实验所用载体来源于Moloney小鼠白血病病毒，去除了3′长末端重复序列(LTR)中的增强子并插入hFⅨ表达单位，其转录方向与LTR转录方向相反。该表达单位包括hFⅨ微型基因(m1或m2为hFⅨ cDNA并插入不同长度hFⅨ第一内含子片段)、1个肌肌酸激酶增强子(Me1)、一个βA200启动子，及hFⅨ基因加多聚腺苷酸尾信号片段。
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本实验所用两种载体(pdLⅨm1βA200Me1及pdLⅨm2βA200Me1)中，均引入了肌肌酸激酶增强子，目的是增强细胞分化后的表达效率。在体内自然的情况下，只有当成肌细胞分化为肌细胞后，Me增强子才发挥作用[6]，从而使肌肌酸激酶在成肌细胞不表达或含量极低，在分化后的肌细胞中含量则很高。由实验结果看，以pdLⅨm1βA200Me1转染胎、SCID小鼠及C57小鼠成肌细胞后，分化后表达高于或接近于分化前；以pdLⅨm2βA200Me1转染胎肌细胞后，分化后明显高于分化前，说明该增强子的引入明显提高了细胞分化后的目的蛋白分泌，并保证了外源基因表达的持续性。
导入基因的同源性在一定程度上影响着目的基因的转录、翻译、及蛋白质的翻译后加工、修饰以及分泌，在本实验中，转染后的人胎成肌细胞hFⅨ表达水平明显高于其他两鼠源成肌细胞，其原因可能就在于此。所以我们着重采用人胎成肌细胞为靶细胞，对两种不同构建的载体的表达水平进行了比较。
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pdLⅨm2βA200Me1/PA317细胞培养上清转染人胎成肌细胞后，发现分化后明显高于分化前，而且明显高于载体pdLⅨm1βA200Me1的表达水平，表明m2微型基因较m1有明显的优越性。m1同m2的主要区别在于内含子长度，m2较m1短1.1 kb，在功能相同的情况下，在一定范围内目的基因较短，重组逆转录病毒载体的包装和感染效率较高。由于hFⅨ表达单位反向插入表达载体中，m1的内含子中存在潜在的polyA信号AATAAA，有可能产生不完整的病毒载体颗粒，故而表达水平较低(未发表资料)。提示为提高目的蛋白的表达，目的基因的修饰是非常重要的。
总之，本实验结果表明逆转录病毒载体(RV-hFⅨ)体外转染成肌细胞后可表达较高量的目的蛋白；载体结构的优化以及靶细胞选择是影响目的基因在靶细胞中表达效果的两个主要因素；为肌细胞途径基因治疗血友病乙的可行性提供了实验依据。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370321)；上海市科委留学回国人员启动基金资助项目(1997-24)
作者简介：王雪松(1969～)，女(汉族)，博士生
参考文献：
[1]Dhawan J, Pan LC, Paviath GK, et al. Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts[J]. Science,1991，254 (5037)：1509-1512.
[2]Kotoku K, Yao SN. Gene therapy by myoblast-mediated gene transfer[J]. Somat Gene Ther， 1995，8(1):121-126.
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[3]Yao SN,Wilson JM,Nabel EG, et al. Expression of human factor Ⅸ in rat capillary endothelial cells: toward somatic gene therapy for hemophilia B[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88(18):8101-8105.
[4]Wang JM, Zheng H, Yuichi S, et al. Construction of human factor Ⅸ expression vectors in retroviral vector frames optimized for muscle cells[J]. Human Gene Therapy， 1996，7(14)：1743-1756.
[5]Kurachi S, Httomi Y, Furukawa M, et al. Role of intron I in expression of the human factor Ⅸ gene[J]. J Biol Chem，1995，270(10):5276-5281.
[6]Yao SN,Smitsh KJ, Kurachi K.Primary myoblast-mediated gene transfer: persistent expression of human factor Ⅸ in mice[J]. Gene Ther，1994，1(2):99-107.
收稿日期：1999-09-11
修回日期：1999-12-02, http://www.100md.com