黑素瘤抑制蛋白在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达
作者：谢渭芬 高勇 贺祥 李舰 朱 陈伟忠 林勇
单位：谢渭芬(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；高勇(长征医院肿瘤科)贺祥(第二军医大学科研部)；李舰(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)； 朱(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；陈伟忠(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；林勇(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；软骨衍生维甲酸敏感性蛋白；小鼠；转基因；乳腺
第二军医大学学报000110 摘 要：目的：检测黑素瘤抑制蛋白(MIA/CD-RAP)在小鼠胚胎乳腺组织中的表达。方法：剖腹分离出10.5～16.5 d的MIA/CD-RAP启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)转基因小鼠胚胎，利用X-gal全胚胎染色观察转基因的组织和细胞染色，并以免疫组织化学染色检测内源性MIA/CD-RAP蛋白在胚胎乳腺组织中的表达。结果：MIA/CD-RAP在孕期11.5 d的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达，至13.5 d表达明显增强，而后逐渐减弱，至16.5 d消失。结论：MIA/CD-RAP可能在乳腺的早期发育和乳腺癌发生中起重要作用。
, 百拇医药
中图分类号： Q 786 文献标示码： A
文章编号：0258-879X(2000)01-0029-02
Expression of melanoma inhibitory protein in mammary buds of transgenic mice
XIE Wei-Fen
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LI Jian
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Liang
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
CHEN Wei-Zhong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LIN Yong(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
GAO Yong
(Department of Oncology, Changzheng Hospital)
HE Xiang
(Department of Science and Research, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To investigate the expression of melanoma inhibitory protein (MIA) in mammary buds of transgenic mice. Methods: Transgenic embryos were collected from day 10.5 to 16.5 by Cesarean section. The transgene expression was detected by whole mount-staining with X-gal. Immunohistochemistry was carried out to detect endogenous MIA/CD-RAP expression in mammary buds. Results: MIA/CD-RAP expression in mammary epithelial cells began on day 11.5 p.c. and continued throughout day 15.5 p.c., with the strongest expression observed on day 13.5 p.c. Conclusion: MIA/CD-RAP may play an important role in the early organogenesis of mammary gland and carcinogenesis of breast cancer.
, 百拇医药
KEY WORDS：melanoma inhibitory protein; cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein; mice, transgenic; mammary gland▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 29-30]
黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory protein; melanoma inhibitory activity, MIA) 是从恶性黑素瘤细胞培养液上清中提取的一种分泌性蛋白[1]，由130个氨基酸组成。其鼠同源体为软骨衍生性维甲酸敏感性蛋白(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein, CD-RAP)[2]。研究表明，MIA/CD-RAP 在正常乳腺、怀孕期和哺乳期乳腺组织中未见表达，而在乳腺癌组织中大量表达，表明MIA/CD-RAP可能对乳腺癌的发生起重要作用[3～6]。 本研究在成功制备MIA/CD-RAP启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)转基因小鼠的基础上[7]，进一步分析MIA/CD-RAP在胚胎乳腺组织中的表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 转基因小鼠全胚胎染色 为观察MIA融合基因2.2lacZ在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达情况，将雄性转基因小鼠与B6SJL雌性野生型小鼠杂交，以出现阴道精栓为孕期0.5 d。剖腹分离出10.5～16.5 d的胚胎,经PBS冲洗后，用4%多聚甲醛于4℃固定20～40 min。参照Bonnerot和Nicolas法[8]，于30℃用X-gal (Sigma)全胚胎染色过夜，将阳性胚胎经PBS冲洗3次后照相。
1.2 组织细胞染色 为观察转基因的细胞表达，将上述照相后的阳性胚胎用4%多聚甲醛继续固定12 h。乙醇脱水后石蜡包埋，并切成5～10 μm厚的切片，伊红衬染。
1.3 免疫组织化学染色 参照Bosserhoff等[5]方法并加以改良，以检测内源性MIA在乳腺组织中的表达。取13.5 d的小鼠胚胎乳腺组织石蜡切片，0.4%胃蛋白酶消化5～10 min。加抗MIA抗血清(Boehringer Mannheim)后，以常规ABC法检测。阴性对照：20%正常兔血清取代一抗。
, 百拇医药
2 结果
2.1 2.2lacZ融合基因在乳腺组织中的表达 X-gal染色发现，孕期10.5 d的转基因小鼠胚胎未见乳腺染色；在11.5 d，可见乳腺胚基轻度染色；至13.5 d，乳腺转基因表达最强，染色最深(图1,图见插页2)；而后乳腺染色逐渐减弱，至16.5 d乳腺染色消失。
图1 MIA/CD-RAP启动子融合基因(2.2lacZ)在
13.5 d转基因鼠胚胎中的表达
Fig 1 The expression of 2.2lacZ fusion gene in
transgenic embryo at day 13.5 p.c.
, 百拇医药
The β-galactosidase activity was observed in mammary buds (arrow)
2.2 转基因的细胞表达 组织切片清楚显示，孕期11.5～15.5 d的转基因小鼠胚胎乳腺上皮细胞均被染色。其中13.5 d的乳腺组织，其上皮细胞染色呈强阳性(图2，图见插页2)，进一步证实全胚胎染色的结果。
图2 MIA/CD-RAP启动子融合基因(2.2lacZ)在
13.5 d转基因鼠乳腺上皮细胞中的表达
Fig 2 The expression of 2.2lacZ fusion gene in mammary
, http://www.100md.com epithelial cells from a 13.5-day transgenic
embryo stained with X-gal (10×10)
2.3 内源性MIA在乳腺组织的表达 免疫组织化学染色显示，13.5 d的胚胎乳腺上皮细胞胞质内染色阳性，周围组织未见染色(图3，图见插页2)。所有阴性对照均无阳性反应。
图3 MIA/CD-RAP在小鼠胚胎乳腺上皮细胞中的免疫定位(10×20)
Fig 3 Immunolocalization of MIA/CD-RAP in mammary bud from a 13.5-day p.c. embryo (10×20)
, 百拇医药
MIA/CD-RAP was presented in the cytoplasm of epithelial cells
3 讨论
在正常小鼠发育中，乳嵴(mammary ridge)于孕期第11天开始出现于腹中线两侧。乳腺芽胚(mammary buds)由上皮细胞组成并突入间质。在乳腺芽胚阶段，雌雄小鼠以相同方式发育。雌鼠乳腺芽胚上皮细胞于出生前迅速增生并形成乳腺索(mammary cord)。而雄鼠在孕期15 d后，其乳腺芽胚中心的间质凝缩，细胞死亡[9]。本研究首次发现，MIA/CD-RAP在孕期11.5 d的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达，13.5 d时表达明显增强，而后逐渐减弱，至16.5 d时消失。MIA/CD-RAP在胚胎乳腺组织中表达的时间与乳腺芽胚的发育相吻合，提示MIA/CD-RAP可能对乳腺的早期发育起一定的作用，而与后期的细胞增生和乳腺索的形成无关。
, http://www.100md.com
迄今为止，有关乳腺癌的发生机制尚未明确。有研究提示某些癌基因或抑癌基因的表达异常可能与乳腺癌的发生有关。Bosserhoff 等[3]研究发现，MIA/CD-RAP可促进肿瘤转移，血清MIA/CD-RAP 水平与恶性黑素瘤患者的预后有关。Lu等[4]研究发现，化学诱导的大鼠乳腺癌组织中MIA/CD-RAP大量表达，而在正常乳腺、怀孕期和哺乳期乳腺组织中未检测到MIA/CD-RAP。最近Bosserhoff等[6]检测了20例人乳腺癌标本，发现肿瘤细胞中均有MIA/CD-RAP的表达。本实验发现MIA/CD-RAP在胚胎早期乳腺发育中短暂表达，在胚胎后期表达消失，提示MIA/CD-RAP可能是一个类似甲胎蛋白的幼稚蛋白或癌基因蛋白，在乳腺早期发育中发挥作用，当某种因素诱发乳腺癌发生时，MIA/CD-RAP被重新激活，进一步促进肿瘤的发生和转移。对此值得进一步探讨。■
基金项目：国家“863”计划资助项目(102-10-04-03)
, 百拇医药
作者简介：谢渭芬(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Blesch A, Bosserhoff AK, Apfel R, et al. Cloning of a novel malignant melanoma-derived growth-regulatory protein, MIA[J]. Cancer Res, 1994,54(21):5695-5701.
[2]Dietz UH, Sandell LJ. Cloning of a retinoic acid-sensitive mRNA expressed in cartilage and during chondrogenesis[J]. J Biol Chem, 1996,271(6):3311-3316.
[3]Bosserhoff AK, Kaufmann M, Kaluza B, et al. Melanoma-inhibiting activity, a novel serum marker for progression of malignant melanoma[J]. Cancer Res, 1997,57(15):3149-3153.
, http://www.100md.com
[4]Lu J, Pei H, Kaeck M, et al. Gene expression changes associated with chemically induced rat mammary carcinogenesis[J]. Mol Carcinog, 1997,20(2):204-215.
[5]Bosserhoff AK, Kondo S, Moser M, et al. Mouse CD-RAP/MIA gene: structure, chromosomal localization, and expression in cartilage and chondrosarcoma[J]. Dev Dyn, 1997,208(4):516-525.
[6]Bosserhoff AK，Moser M, Hein R, et al. In situ expression patterns of melanoma-inhibiting activity (MIA) in melanomas and breast cancers[J]. J Pathol, 1999,187(4):446-454.
, 百拇医药
[7]谢渭芬，李 舰，高 勇，等. 黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性[J]. 第二军医大学学报,2000,21(1):27-28.
[8]Bonnerot C, Nicolas JF. Application of lacZ gene fusions to postimplantation development[J]. Methods Enzymol, 1993,225:451-469.
[9]Gilbert SF ed. Developmental biology[M]. 4th ed. Massachusetts: Sinauer Associates, Inc, 1994.115-130.
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-11-12, 百拇医药
单位：谢渭芬(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；高勇(长征医院肿瘤科)贺祥(第二军医大学科研部)；李舰(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)； 朱(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；陈伟忠(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)；林勇(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200032)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；软骨衍生维甲酸敏感性蛋白；小鼠；转基因；乳腺
第二军医大学学报000110 摘 要：目的：检测黑素瘤抑制蛋白(MIA/CD-RAP)在小鼠胚胎乳腺组织中的表达。方法：剖腹分离出10.5～16.5 d的MIA/CD-RAP启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)转基因小鼠胚胎，利用X-gal全胚胎染色观察转基因的组织和细胞染色，并以免疫组织化学染色检测内源性MIA/CD-RAP蛋白在胚胎乳腺组织中的表达。结果：MIA/CD-RAP在孕期11.5 d的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达，至13.5 d表达明显增强，而后逐渐减弱，至16.5 d消失。结论：MIA/CD-RAP可能在乳腺的早期发育和乳腺癌发生中起重要作用。
, 百拇医药
中图分类号： Q 786 文献标示码： A
文章编号：0258-879X(2000)01-0029-02
Expression of melanoma inhibitory protein in mammary buds of transgenic mice
XIE Wei-Fen
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LI Jian
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Liang
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
CHEN Wei-Zhong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LIN Yong(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
GAO Yong
(Department of Oncology, Changzheng Hospital)
HE Xiang
(Department of Science and Research, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To investigate the expression of melanoma inhibitory protein (MIA) in mammary buds of transgenic mice. Methods: Transgenic embryos were collected from day 10.5 to 16.5 by Cesarean section. The transgene expression was detected by whole mount-staining with X-gal. Immunohistochemistry was carried out to detect endogenous MIA/CD-RAP expression in mammary buds. Results: MIA/CD-RAP expression in mammary epithelial cells began on day 11.5 p.c. and continued throughout day 15.5 p.c., with the strongest expression observed on day 13.5 p.c. Conclusion: MIA/CD-RAP may play an important role in the early organogenesis of mammary gland and carcinogenesis of breast cancer.
, 百拇医药
KEY WORDS：melanoma inhibitory protein; cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein; mice, transgenic; mammary gland▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 29-30]
黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory protein; melanoma inhibitory activity, MIA) 是从恶性黑素瘤细胞培养液上清中提取的一种分泌性蛋白[1]，由130个氨基酸组成。其鼠同源体为软骨衍生性维甲酸敏感性蛋白(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein, CD-RAP)[2]。研究表明，MIA/CD-RAP 在正常乳腺、怀孕期和哺乳期乳腺组织中未见表达，而在乳腺癌组织中大量表达，表明MIA/CD-RAP可能对乳腺癌的发生起重要作用[3～6]。 本研究在成功制备MIA/CD-RAP启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)转基因小鼠的基础上[7]，进一步分析MIA/CD-RAP在胚胎乳腺组织中的表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 转基因小鼠全胚胎染色 为观察MIA融合基因2.2lacZ在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达情况，将雄性转基因小鼠与B6SJL雌性野生型小鼠杂交，以出现阴道精栓为孕期0.5 d。剖腹分离出10.5～16.5 d的胚胎,经PBS冲洗后，用4%多聚甲醛于4℃固定20～40 min。参照Bonnerot和Nicolas法[8]，于30℃用X-gal (Sigma)全胚胎染色过夜，将阳性胚胎经PBS冲洗3次后照相。
1.2 组织细胞染色 为观察转基因的细胞表达，将上述照相后的阳性胚胎用4%多聚甲醛继续固定12 h。乙醇脱水后石蜡包埋，并切成5～10 μm厚的切片，伊红衬染。
1.3 免疫组织化学染色 参照Bosserhoff等[5]方法并加以改良，以检测内源性MIA在乳腺组织中的表达。取13.5 d的小鼠胚胎乳腺组织石蜡切片，0.4%胃蛋白酶消化5～10 min。加抗MIA抗血清(Boehringer Mannheim)后，以常规ABC法检测。阴性对照：20%正常兔血清取代一抗。
, 百拇医药
2 结果
2.1 2.2lacZ融合基因在乳腺组织中的表达 X-gal染色发现，孕期10.5 d的转基因小鼠胚胎未见乳腺染色；在11.5 d，可见乳腺胚基轻度染色；至13.5 d，乳腺转基因表达最强，染色最深(图1,图见插页2)；而后乳腺染色逐渐减弱，至16.5 d乳腺染色消失。
图1 MIA/CD-RAP启动子融合基因(2.2lacZ)在
13.5 d转基因鼠胚胎中的表达
Fig 1 The expression of 2.2lacZ fusion gene in
transgenic embryo at day 13.5 p.c.
, 百拇医药
The β-galactosidase activity was observed in mammary buds (arrow)
2.2 转基因的细胞表达 组织切片清楚显示，孕期11.5～15.5 d的转基因小鼠胚胎乳腺上皮细胞均被染色。其中13.5 d的乳腺组织，其上皮细胞染色呈强阳性(图2，图见插页2)，进一步证实全胚胎染色的结果。
图2 MIA/CD-RAP启动子融合基因(2.2lacZ)在
13.5 d转基因鼠乳腺上皮细胞中的表达
Fig 2 The expression of 2.2lacZ fusion gene in mammary
, http://www.100md.com epithelial cells from a 13.5-day transgenic
embryo stained with X-gal (10×10)
2.3 内源性MIA在乳腺组织的表达 免疫组织化学染色显示，13.5 d的胚胎乳腺上皮细胞胞质内染色阳性，周围组织未见染色(图3，图见插页2)。所有阴性对照均无阳性反应。
图3 MIA/CD-RAP在小鼠胚胎乳腺上皮细胞中的免疫定位(10×20)
Fig 3 Immunolocalization of MIA/CD-RAP in mammary bud from a 13.5-day p.c. embryo (10×20)
, 百拇医药
MIA/CD-RAP was presented in the cytoplasm of epithelial cells
3 讨论
在正常小鼠发育中，乳嵴(mammary ridge)于孕期第11天开始出现于腹中线两侧。乳腺芽胚(mammary buds)由上皮细胞组成并突入间质。在乳腺芽胚阶段，雌雄小鼠以相同方式发育。雌鼠乳腺芽胚上皮细胞于出生前迅速增生并形成乳腺索(mammary cord)。而雄鼠在孕期15 d后，其乳腺芽胚中心的间质凝缩，细胞死亡[9]。本研究首次发现，MIA/CD-RAP在孕期11.5 d的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达，13.5 d时表达明显增强，而后逐渐减弱，至16.5 d时消失。MIA/CD-RAP在胚胎乳腺组织中表达的时间与乳腺芽胚的发育相吻合，提示MIA/CD-RAP可能对乳腺的早期发育起一定的作用，而与后期的细胞增生和乳腺索的形成无关。
, http://www.100md.com
迄今为止，有关乳腺癌的发生机制尚未明确。有研究提示某些癌基因或抑癌基因的表达异常可能与乳腺癌的发生有关。Bosserhoff 等[3]研究发现，MIA/CD-RAP可促进肿瘤转移，血清MIA/CD-RAP 水平与恶性黑素瘤患者的预后有关。Lu等[4]研究发现，化学诱导的大鼠乳腺癌组织中MIA/CD-RAP大量表达，而在正常乳腺、怀孕期和哺乳期乳腺组织中未检测到MIA/CD-RAP。最近Bosserhoff等[6]检测了20例人乳腺癌标本，发现肿瘤细胞中均有MIA/CD-RAP的表达。本实验发现MIA/CD-RAP在胚胎早期乳腺发育中短暂表达，在胚胎后期表达消失，提示MIA/CD-RAP可能是一个类似甲胎蛋白的幼稚蛋白或癌基因蛋白，在乳腺早期发育中发挥作用，当某种因素诱发乳腺癌发生时，MIA/CD-RAP被重新激活，进一步促进肿瘤的发生和转移。对此值得进一步探讨。■
基金项目：国家“863”计划资助项目(102-10-04-03)
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作者简介：谢渭芬(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Blesch A, Bosserhoff AK, Apfel R, et al. Cloning of a novel malignant melanoma-derived growth-regulatory protein, MIA[J]. Cancer Res, 1994,54(21):5695-5701.
[2]Dietz UH, Sandell LJ. Cloning of a retinoic acid-sensitive mRNA expressed in cartilage and during chondrogenesis[J]. J Biol Chem, 1996,271(6):3311-3316.
[3]Bosserhoff AK, Kaufmann M, Kaluza B, et al. Melanoma-inhibiting activity, a novel serum marker for progression of malignant melanoma[J]. Cancer Res, 1997,57(15):3149-3153.
, http://www.100md.com
[4]Lu J, Pei H, Kaeck M, et al. Gene expression changes associated with chemically induced rat mammary carcinogenesis[J]. Mol Carcinog, 1997,20(2):204-215.
[5]Bosserhoff AK, Kondo S, Moser M, et al. Mouse CD-RAP/MIA gene: structure, chromosomal localization, and expression in cartilage and chondrosarcoma[J]. Dev Dyn, 1997,208(4):516-525.
[6]Bosserhoff AK，Moser M, Hein R, et al. In situ expression patterns of melanoma-inhibiting activity (MIA) in melanomas and breast cancers[J]. J Pathol, 1999,187(4):446-454.
, 百拇医药
[7]谢渭芬，李 舰，高 勇，等. 黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性[J]. 第二军医大学学报,2000,21(1):27-28.
[8]Bonnerot C, Nicolas JF. Application of lacZ gene fusions to postimplantation development[J]. Methods Enzymol, 1993,225:451-469.
[9]Gilbert SF ed. Developmental biology[M]. 4th ed. Massachusetts: Sinauer Associates, Inc, 1994.115-130.
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-11-12, 百拇医药