创伤-失血性休克对机体免疫功能的影响
作者：刘靖华 陈惠孙 胡德耀 刘良明 刘怀琼
单位：刘靖华(第三军医大学：附属西南医院麻醉科，重庆 400038)；陈惠孙(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘怀琼(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：创伤；失血性休克；免疫
第三军医大学学报000124
提要 目的：探讨创伤-失血性休克对机体免疫功能的影响。方法：以大鼠闭合性骨折合并失血性休克为模型，于创伤-失血性休克及其复苏后2h、1、2、3、7d处死动物，分离并纯化脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞，检测脾淋巴细胞增殖能力、IL-2释放、IL-2Rα表达和腹腔巨噬细胞的吞噬能力、MHCⅡ抗原表达及TNF-α的分泌。结果：①创伤-失血性休克后脾淋巴细胞增殖能力降低，IL-2释放和IL-2R表达减少；②腹腔巨噬细胞的吞噬功能减弱，MHCⅡ抗原表达和TNF-α释放减少。上述变化在伤后7d尚未恢复到正常水平。结论：创伤-失血性休克后机体免疫功能受到广泛影响，淋巴细胞和巨噬细胞的功能受损，并持续较长的时间。
, 百拇医药
中图法分类号 R605.971;R641 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0081-04
Effects of traumatic-hemorrhagic shock on immune function in rats
LIU Jing-hua,CHEN Hui-sun,HU De-yao,LIU Liang-ming,LIU Huai-qiong
(Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract Objective:To investigate the effects of traumatic-hemorrhagic shock on immune function.Methods:Splenocytes and peritoneal macrophages were harvested at the 2nd h and on the 1st,2nd,3rd and 7th d after the model of closed bone fracture and hemorrhagic shock were established in rats.Then splenocyte proliferation capacity,interleukin 2 release,interleukin 2 receptor expression,peritoneal macrophage phagocytosis,antigen presentation function and TNF-α release were determined.Results:All these indexes were decreased after operation as compared with those in the control group.Conclusion:Traumatic-hemorrhagic shock induces a marked depression of immune function and the alterations persist for at least 1 week.
, 百拇医药
Key words trauma; hemorrhagic shock; immunity
研究表明，严重创伤或休克后机体的免疫功能处于紊乱状态，使继发感染的发生及其死亡大为增加。但在临床上，严重创伤往往与失血性休克同时发生。创伤合并失血性休克对机体的免疫功能影响程度如何目前鲜见报道。本实验以大鼠失血性休克合并闭合性骨折及复苏为模型，观察了创伤-失血性休克后脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的变化规律。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar雄性大鼠，体重200～280g，由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。
1.2 模型
乙醚麻醉大鼠后，分别经颈内动脉和颈外静脉插管。插管完毕并待动物清醒后，钳夹折断其右后肢(无明显出血)，然后经颈内动脉放血，10min内使血压下降到(35±5)mmHg。维持60min后复苏，复苏液为失血及两倍于失血的林格氏液。
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1.3 试剂
ConA和LPS(Escherichia coli,0111∶B4)购自Sigma公司，小鼠抗大鼠CD25抗体(进口分装)购自北京中山公司，OX6和OX17(分别为小鼠抗大小I-A和I-E抗原的单克隆抗体)购自Serotec公司，TNF-α检测试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室。
1.4 脾细胞的分离[1]
无菌获取脾脏，用剪刀反复剪切至糊状，然后用不锈钢网筛(100目)滤过。离心1000r/min、10min后弃上清，用低渗休克法溶解红细胞[2]。最后用RPMI1640培养液悬浮细胞。台盼蓝染色，细胞活力>95%。
1.5 腹腔巨噬细胞的分离
, http://www.100md.com 过量乙醚处死大鼠，腹腔内注入无菌预冷的PBS30～50ml，按摩腹部1min，吸出腹腔液，1000r/min离心10min，用RPMI1640培养液悬浮细胞，于37°C、5%CO2培养箱中培养2h，洗去未贴壁细胞，轻轻刮下贴壁的巨噬细胞，调细胞浓度为1×106/ml备用。经瑞氏染色法鉴定Mφ细胞纯度>90%；台盼蓝染色，细胞存活率>95%。
1.6 脾淋巴细胞增殖能力测定[2]
取无菌制备的大鼠脾淋巴细胞悬液，并调细胞浓度为1×106/ml。于96孔无菌培养板内每孔加入细胞液0.1ml，含有或不含有ConA的RPMI培养液0.1ml(ConA终浓度5μg/ml)，一式三孔。于37°C、5%CO2培养箱中培养48h，加入3H-TdR20μl(0.25μCi/ml)/孔，继续培养16h。用多头细胞收集仪收获细胞，用液闪仪测其放射性(Bq)。
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1.7 IL-2活性测定(细胞法)[2]
24孔培养板上每孔加入脾细胞悬液1ml，ConA50μl(终浓度10μg/ml)，于37°C，5%CO2培养中培养24h，离心。收集的上清-70°C保存，为IL-2待测样本；细胞用于IL-2R测定。
取生长良好的CTLL-2细胞，调细胞浓度为1×105/ml。于96孔无菌细胞培养板上每孔分别加入：CTLL-2细胞0.1ml，IL-2标准样品或待测样本0.1ml，于37°C，5%CO2培养中培养48h。加入3H-TdR20μl(0.25μCi/ml)/孔，继续培养8h，以多头细胞收集仪收获细胞测其Bq值，并以标准品计算样本中IL-2活性。
1.8 IL-2受体测定(ELISA法)[3]
, 百拇医药
于96孔培养板(经多聚赖氨酸预处理)中每孔加入细胞悬液100μl，于37°C，5%CO2培养箱中培养4h后取出。每孔再加入0.5%戊二醛PBS液100μl，固定1h后，PBS洗2遍。然后加入甘氨酸(100mmol/L)PBS(含0.1%BSA)溶液200μl/孔，室温下30min后弃去甘氨酸溶液，PBS洗2遍。加入封闭液(1%BSA+1%Tween20PBS)100μl/孔，4°C过夜。PBS淋洗后加入封闭液稀释的一抗(小鼠抗大鼠CD25，1∶200)50μl/孔，室温下1h。PBS淋洗3次。然后加入二抗(羊抗小鼠HPR-IgG,1∶1000)，室温下1h。PBS淋洗3次。加入ELISA基质液200μl/孔，37°C15min后加入2mol/L硫酸50μl/孔终止反应，酶标仪读数。波长为492nm。
1.9 腹腔巨噬细胞MHCⅡ类抗原表达的测定[4]
取腹腔巨噬细胞悬液1ml，加入OX6、OX17(荧光素标记)各10μl，4°C避光放置30min，其间混悬细胞1次。用PBS洗涤细胞2次，上流式细胞仪进行测定。
, 百拇医药
1.10 TNF-α的测定
按试剂盒说明书操作。
1.11 腹腔巨噬细胞吞噬能力测定[5]
大鼠腹腔注入10%鸡红细胞1ml,30min后处死大鼠，分离腹腔巨噬细胞。吸0.5ml滴于载玻片上，37°C孵育30min，用生理盐水洗掉未贴片的细胞，晾干。用1∶1丙酮-甲醇液固定，姬姆萨-瑞氏染色液染色，在高倍镜下或油镜下观察计数，计算吞噬率。
1.12 统计学处理
实验所得数据以
表示，采用t检验进行统计学处理。
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2 结果
2.1 创伤-失血性休克后脾淋巴细胞增殖能力、IL-2产生及IL-2Rα表达的变化
与正常对照组大鼠相比，创伤-失血性休克及其复苏后大鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的增殖反应显著受损，IL-2释放减少，细胞膜IL-2Rα表达受抑，以伤后第1天最为明显(P<0.01),在随后几天各项指标缓慢回升，伤后第7天仍未恢复到正常水平(P<0.05),见表1。
表1 创伤失血性休克后脾淋巴细胞功能的变化(n=6)
Tab1 Changes of splenocyte function following trauma-hemorrhagic shock(n=6) Group
Proliferation(×34.8 Bq)
, 百拇医药
IL-2(U/ml)
IL-2Rα(D492)
Control
5724.5±438.25
7.83±0.75
0.340±0.027
Post T-HS
2 h
3366.5±241.48**
5.15±0.39**
0.226±0.015**
, 百拇医药
1 d
2902.0±272.01**
2.13±0.45**
0.129±0.009**
2 d
3215.5±148.11**
4.46±0.49**
0.071±0.005**
3 d
3295.8±279.19**
, 百拇医药
5.45±0.39**
0.115±0.005**
7 d
4677.5±343.56*
6.76±0.30*
0.311±0.007*
T-HS Trauma-hemorrhagic shock;*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
2.2 创伤-失血性休克后巨噬细胞吞噬功能、MHCⅡ抗原表达(I-A、I-E)及TNF-α水平的变化
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与正常对照组大鼠相比，创伤-失血性休克复苏后巨噬细胞的吞噬能力、MHCⅡ抗原表达(I-A、I-E)及其在脂多糖(LPS)刺激下TNF-α的分泌均受到显著抑制。其中巨噬细胞的吞噬能力于伤后2h最低(P<0.01)，2d后恢复正常0.05)。I-A、I-E阳性细胞数于伤后1d最少，TNF的释放于伤后1d最低。伤后第7天上述各项指标尚未恢复到正常水平，见表2。
表2 创伤失血性休克后腹腔巨噬细胞功能的变化(n=6)
Tab1 Changes of splenocyte function following trauma-hemorrhagic shock(n=6) Group
Phagocytosis(%)
I-A(%)
I-E(%)
, 百拇医药
TNF-α(U/ml)
Control
33.4±1.76
71.32±1.22
68.77±1.58
281.17±25.6
Post T-HS
16.13±2.59**
54.43±7.14**
52.32±7.03**
150.67±20.7**
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2 h
28.4±3.18*
38.27±5.99**
35.68±5.97**
130.67±10.2**
1 d
33.23±4.44
46.71±6.22**
44.02±5.92**
160.83±17.2**
, 百拇医药
2 d
31.7±2.69
58.40±3.25**
55.67±3.14**
170.33±22.3**
3 d
32.15±4.23
63.58±4.55*
60.87±4.70**
168.57±17.2**
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T-HS Trauma-hemorrhagic shock;*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
3 讨论
既往的研究多采用单纯创伤(如开腹、骨折等)或失血性休克动物模型，但在临床上创伤与失血性休克往往是密不可分。因此采用创伤合并失血性休克的动物模型更能模拟临床实际情况。本实验发现，创伤-失血性休克后大鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能均受到明显抑制，表现在脾淋巴细胞的增殖能力降低，IL-2产生及IL-2Rα表达减少，巨噬细胞吞噬功能减弱，MHCⅡ类抗原表达受抑，TNF-α释放减少。其中，巨噬细胞吞噬功能于伤后2h最低，48h恢复；其它指标在伤后24～48h最低，伤后第7天各项指标有所恢复，但未达到正常水平。以往的研究发现，单纯失血性休克或创伤动物其免疫功能抑制持续3～5d恢复正常[6]，而本实验大多数指标在伤后第7天仍未恢复正常，提示创伤复合失血性休克后免疫抑制持续的时间较单纯创伤或失血性休克要长。最近，Xu等[7]也发现创伤(开腹)合并失血性休克(30mmHg维持60min)后第7天大鼠脾淋巴细胞增殖能力及其IL-4、IL-3分泌、腹腔巨噬细胞IL-1、IL-6、TNF-α的分泌均处于抑制状态，伤后第10天恢复正常，支持本实验结果。另外，临床研究也表明，多发伤的病人其免疫功能抑制的时间多在1周以上[8]。
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淋巴细胞的活化增殖是发挥免疫应答的必要条件，因而淋巴细胞增殖反应被认为是反映淋巴细胞功能的主要指标之一。由于IL-2的产生与IL-2R表达对T细胞活化并进入增殖状态至关重要，休克后IL-2产生减少、IL-2受体表达降低可能是淋巴细胞增殖受抑的主要原因。IL-2产生及其受体表达降低的原因尚不清楚。有研究发现，休克后T辅助细胞(Th)亚群发生改变，Th1分泌IL-2、INF-γ减少，而Th2分泌IL-2、IL-10增多，增多的IL-10可直接抑制T、B细胞活性或通过抑制巨噬细胞抗原提呈能力及其协同因子(如IL-1)分泌的间接途径抑制淋巴细胞功能[8]。
吞噬功能正常是巨噬细胞发挥非特异性免疫防御反应的重要保证。休克早期巨噬细胞吞噬功能受抑，使机体的防御能力受到削弱，这可能是造成创伤失血性休克后机体对感染易感性增加的重要原因之一。Kondo等[9]也发现休克复苏后早期(24h)肝脏网状内皮吞噬系统对大肠杆菌的吞噬和杀灭能力均受到抑制。巨噬细胞吞噬清除能力下降除与血清调理素水平(如纤维连结蛋白、C3b)有关外，与巨噬细胞本身的变化(如其表面受体Fc、C3b表达减少)也有关[9]。
, 百拇医药
巨噬细胞既作为吞噬细胞参与非特异性免疫反应，又作为抗原提呈细胞参与特异性免疫反应。巨噬细胞将摄取的外来抗原加工后以MHC-Ⅱ(Ia)复合体形式表达于细胞表面，被T细胞表面受体识别，将抗原信号传递给T细胞，从而启动特异性免疫反应。同时巨噬细胞还分泌适量的细胞因子(如IL-1、IL-6等)作为协同信号刺激T细胞活化。本实验发现休克后腹腔巨噬细胞抗原提呈能力下降，细胞因子分泌减少，这可能是淋巴细胞功能受抑制的原因之一，也是休克后机体易于感染的另一重要原因[10]。
总之，创伤合并失血性休克后机体免疫功能受到广泛影响，淋巴细胞和巨噬细胞的功能受损，并持续较长的时间。与以往的单纯创伤或失血性休克动物模型相比，本实验结果更符合临床的实际情况，因而更具有临床参考价值。本实验结果还为进一步研究创伤-失血性休克后免疫功能改变的发生机制，探讨相应的免疫调理措施提供了重要线索。
基金项目：全军“九五”指令性课题(96L041)
, 百拇医药
作者简介：刘靖华(1965.5)，女，陕西省富平县人，博士，主治医师，主要从事创伤与免疫方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754146
参考文献
[1]B.米舍尔S.施吉[美].细胞免疫学方法选编[M].北京：人民卫生出版社，1986.20-22.
[2]Stephan R N,Kupper T S,Geha A S,et al.Hemorrhage with-out tissue trauma produces immunosuppression and enhances susceptibility to sepsis[J].Arch Surg,1987,122(1):62-69.
[3]陈永硕.现代实用免疫细胞化学技术[M].上海：上海科学技术出版社，1997.98-101.
, 百拇医药
[4]Ayala A,Perrin M M,Chaudry I H.Defective macrophage antigen presentation following hemorrhage is associated with the loss of MHC class Ⅱ (Ia) antigens[J].Immunology,1990,70 (1)： 33-38.
[5]巴德年.当代免疫学技术与应用.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.152-154.
[6]Ayala A,Perrin M M,Wagner M A,et al.Enhanced suscepti-bility to sepsis following simple hemorrhage depression of Fc and C3b receptor-mediated phagocytosis[J].Arch Surg,1990,125 (1):70-75.
, http://www.100md.com
[7]Xu Y X,Ayala A,Chaudry I H.Prolonged immunodepression after trauma and hemorrhagic shock[J].J Trauma,1998,44(2):335-341.
[8]Abaham E,Chang Y H.Hemorrhage-induced alterations in function and cytokine production of T cells and T cell subpopula-tions[J].Clin Exp Immunol,1992,90(5):497-502.
[9]Kondo S,Wang D,Mayumi T,et al.Effects of hemorrhagic shock and resuscitation upon hepatic phagocytic clearance and killing of circulating macroorganisms[J].Shock,1996,5(2):106-111.
[10]Stephan D S,Ayala A,Harkema J M,et al.Mechanism of immunosuppression following hemorrhage:defective antigen presentation by macrophages[J].J Surg Res,1989,46(6):553-556.
收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-09-28, 百拇医药
单位：刘靖华(第三军医大学：附属西南医院麻醉科，重庆 400038)；陈惠孙(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘怀琼(附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：创伤；失血性休克；免疫
第三军医大学学报000124
提要 目的：探讨创伤-失血性休克对机体免疫功能的影响。方法：以大鼠闭合性骨折合并失血性休克为模型，于创伤-失血性休克及其复苏后2h、1、2、3、7d处死动物，分离并纯化脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞，检测脾淋巴细胞增殖能力、IL-2释放、IL-2Rα表达和腹腔巨噬细胞的吞噬能力、MHCⅡ抗原表达及TNF-α的分泌。结果：①创伤-失血性休克后脾淋巴细胞增殖能力降低，IL-2释放和IL-2R表达减少；②腹腔巨噬细胞的吞噬功能减弱，MHCⅡ抗原表达和TNF-α释放减少。上述变化在伤后7d尚未恢复到正常水平。结论：创伤-失血性休克后机体免疫功能受到广泛影响，淋巴细胞和巨噬细胞的功能受损，并持续较长的时间。
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中图法分类号 R605.971;R641 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0081-04
Effects of traumatic-hemorrhagic shock on immune function in rats
LIU Jing-hua,CHEN Hui-sun,HU De-yao,LIU Liang-ming,LIU Huai-qiong
(Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract Objective:To investigate the effects of traumatic-hemorrhagic shock on immune function.Methods:Splenocytes and peritoneal macrophages were harvested at the 2nd h and on the 1st,2nd,3rd and 7th d after the model of closed bone fracture and hemorrhagic shock were established in rats.Then splenocyte proliferation capacity,interleukin 2 release,interleukin 2 receptor expression,peritoneal macrophage phagocytosis,antigen presentation function and TNF-α release were determined.Results:All these indexes were decreased after operation as compared with those in the control group.Conclusion:Traumatic-hemorrhagic shock induces a marked depression of immune function and the alterations persist for at least 1 week.
, 百拇医药
Key words trauma; hemorrhagic shock; immunity
研究表明，严重创伤或休克后机体的免疫功能处于紊乱状态，使继发感染的发生及其死亡大为增加。但在临床上，严重创伤往往与失血性休克同时发生。创伤合并失血性休克对机体的免疫功能影响程度如何目前鲜见报道。本实验以大鼠失血性休克合并闭合性骨折及复苏为模型，观察了创伤-失血性休克后脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的变化规律。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar雄性大鼠，体重200～280g，由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。
1.2 模型
乙醚麻醉大鼠后，分别经颈内动脉和颈外静脉插管。插管完毕并待动物清醒后，钳夹折断其右后肢(无明显出血)，然后经颈内动脉放血，10min内使血压下降到(35±5)mmHg。维持60min后复苏，复苏液为失血及两倍于失血的林格氏液。
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1.3 试剂
ConA和LPS(Escherichia coli,0111∶B4)购自Sigma公司，小鼠抗大鼠CD25抗体(进口分装)购自北京中山公司，OX6和OX17(分别为小鼠抗大小I-A和I-E抗原的单克隆抗体)购自Serotec公司，TNF-α检测试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室。
1.4 脾细胞的分离[1]
无菌获取脾脏，用剪刀反复剪切至糊状，然后用不锈钢网筛(100目)滤过。离心1000r/min、10min后弃上清，用低渗休克法溶解红细胞[2]。最后用RPMI1640培养液悬浮细胞。台盼蓝染色，细胞活力>95%。
1.5 腹腔巨噬细胞的分离
, http://www.100md.com 过量乙醚处死大鼠，腹腔内注入无菌预冷的PBS30～50ml，按摩腹部1min，吸出腹腔液，1000r/min离心10min，用RPMI1640培养液悬浮细胞，于37°C、5%CO2培养箱中培养2h，洗去未贴壁细胞，轻轻刮下贴壁的巨噬细胞，调细胞浓度为1×106/ml备用。经瑞氏染色法鉴定Mφ细胞纯度>90%；台盼蓝染色，细胞存活率>95%。
1.6 脾淋巴细胞增殖能力测定[2]
取无菌制备的大鼠脾淋巴细胞悬液，并调细胞浓度为1×106/ml。于96孔无菌培养板内每孔加入细胞液0.1ml，含有或不含有ConA的RPMI培养液0.1ml(ConA终浓度5μg/ml)，一式三孔。于37°C、5%CO2培养箱中培养48h，加入3H-TdR20μl(0.25μCi/ml)/孔，继续培养16h。用多头细胞收集仪收获细胞，用液闪仪测其放射性(Bq)。
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1.7 IL-2活性测定(细胞法)[2]
24孔培养板上每孔加入脾细胞悬液1ml，ConA50μl(终浓度10μg/ml)，于37°C，5%CO2培养中培养24h，离心。收集的上清-70°C保存，为IL-2待测样本；细胞用于IL-2R测定。
取生长良好的CTLL-2细胞，调细胞浓度为1×105/ml。于96孔无菌细胞培养板上每孔分别加入：CTLL-2细胞0.1ml，IL-2标准样品或待测样本0.1ml，于37°C，5%CO2培养中培养48h。加入3H-TdR20μl(0.25μCi/ml)/孔，继续培养8h，以多头细胞收集仪收获细胞测其Bq值，并以标准品计算样本中IL-2活性。
1.8 IL-2受体测定(ELISA法)[3]
, 百拇医药
于96孔培养板(经多聚赖氨酸预处理)中每孔加入细胞悬液100μl，于37°C，5%CO2培养箱中培养4h后取出。每孔再加入0.5%戊二醛PBS液100μl，固定1h后，PBS洗2遍。然后加入甘氨酸(100mmol/L)PBS(含0.1%BSA)溶液200μl/孔，室温下30min后弃去甘氨酸溶液，PBS洗2遍。加入封闭液(1%BSA+1%Tween20PBS)100μl/孔，4°C过夜。PBS淋洗后加入封闭液稀释的一抗(小鼠抗大鼠CD25，1∶200)50μl/孔，室温下1h。PBS淋洗3次。然后加入二抗(羊抗小鼠HPR-IgG,1∶1000)，室温下1h。PBS淋洗3次。加入ELISA基质液200μl/孔，37°C15min后加入2mol/L硫酸50μl/孔终止反应，酶标仪读数。波长为492nm。
1.9 腹腔巨噬细胞MHCⅡ类抗原表达的测定[4]
取腹腔巨噬细胞悬液1ml，加入OX6、OX17(荧光素标记)各10μl，4°C避光放置30min，其间混悬细胞1次。用PBS洗涤细胞2次，上流式细胞仪进行测定。
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1.10 TNF-α的测定
按试剂盒说明书操作。
1.11 腹腔巨噬细胞吞噬能力测定[5]
大鼠腹腔注入10%鸡红细胞1ml,30min后处死大鼠，分离腹腔巨噬细胞。吸0.5ml滴于载玻片上，37°C孵育30min，用生理盐水洗掉未贴片的细胞，晾干。用1∶1丙酮-甲醇液固定，姬姆萨-瑞氏染色液染色，在高倍镜下或油镜下观察计数，计算吞噬率。
1.12 统计学处理
实验所得数据以
表示，采用t检验进行统计学处理。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 创伤-失血性休克后脾淋巴细胞增殖能力、IL-2产生及IL-2Rα表达的变化
与正常对照组大鼠相比，创伤-失血性休克及其复苏后大鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的增殖反应显著受损，IL-2释放减少，细胞膜IL-2Rα表达受抑，以伤后第1天最为明显(P<0.01),在随后几天各项指标缓慢回升，伤后第7天仍未恢复到正常水平(P<0.05),见表1。
表1 创伤失血性休克后脾淋巴细胞功能的变化(n=6)
Tab1 Changes of splenocyte function following trauma-hemorrhagic shock(n=6) Group
Proliferation(×34.8 Bq)
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IL-2(U/ml)
IL-2Rα(D492)
Control
5724.5±438.25
7.83±0.75
0.340±0.027
Post T-HS
2 h
3366.5±241.48**
5.15±0.39**
0.226±0.015**
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1 d
2902.0±272.01**
2.13±0.45**
0.129±0.009**
2 d
3215.5±148.11**
4.46±0.49**
0.071±0.005**
3 d
3295.8±279.19**
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5.45±0.39**
0.115±0.005**
7 d
4677.5±343.56*
6.76±0.30*
0.311±0.007*
T-HS Trauma-hemorrhagic shock;*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
2.2 创伤-失血性休克后巨噬细胞吞噬功能、MHCⅡ抗原表达(I-A、I-E)及TNF-α水平的变化
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与正常对照组大鼠相比，创伤-失血性休克复苏后巨噬细胞的吞噬能力、MHCⅡ抗原表达(I-A、I-E)及其在脂多糖(LPS)刺激下TNF-α的分泌均受到显著抑制。其中巨噬细胞的吞噬能力于伤后2h最低(P<0.01)，2d后恢复正常0.05)。I-A、I-E阳性细胞数于伤后1d最少，TNF的释放于伤后1d最低。伤后第7天上述各项指标尚未恢复到正常水平，见表2。
表2 创伤失血性休克后腹腔巨噬细胞功能的变化(n=6)
Tab1 Changes of splenocyte function following trauma-hemorrhagic shock(n=6) Group
Phagocytosis(%)
I-A(%)
I-E(%)
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TNF-α(U/ml)
Control
33.4±1.76
71.32±1.22
68.77±1.58
281.17±25.6
Post T-HS
16.13±2.59**
54.43±7.14**
52.32±7.03**
150.67±20.7**
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2 h
28.4±3.18*
38.27±5.99**
35.68±5.97**
130.67±10.2**
1 d
33.23±4.44
46.71±6.22**
44.02±5.92**
160.83±17.2**
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2 d
31.7±2.69
58.40±3.25**
55.67±3.14**
170.33±22.3**
3 d
32.15±4.23
63.58±4.55*
60.87±4.70**
168.57±17.2**
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T-HS Trauma-hemorrhagic shock;*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
3 讨论
既往的研究多采用单纯创伤(如开腹、骨折等)或失血性休克动物模型，但在临床上创伤与失血性休克往往是密不可分。因此采用创伤合并失血性休克的动物模型更能模拟临床实际情况。本实验发现，创伤-失血性休克后大鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能均受到明显抑制，表现在脾淋巴细胞的增殖能力降低，IL-2产生及IL-2Rα表达减少，巨噬细胞吞噬功能减弱，MHCⅡ类抗原表达受抑，TNF-α释放减少。其中，巨噬细胞吞噬功能于伤后2h最低，48h恢复；其它指标在伤后24～48h最低，伤后第7天各项指标有所恢复，但未达到正常水平。以往的研究发现，单纯失血性休克或创伤动物其免疫功能抑制持续3～5d恢复正常[6]，而本实验大多数指标在伤后第7天仍未恢复正常，提示创伤复合失血性休克后免疫抑制持续的时间较单纯创伤或失血性休克要长。最近，Xu等[7]也发现创伤(开腹)合并失血性休克(30mmHg维持60min)后第7天大鼠脾淋巴细胞增殖能力及其IL-4、IL-3分泌、腹腔巨噬细胞IL-1、IL-6、TNF-α的分泌均处于抑制状态，伤后第10天恢复正常，支持本实验结果。另外，临床研究也表明，多发伤的病人其免疫功能抑制的时间多在1周以上[8]。
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淋巴细胞的活化增殖是发挥免疫应答的必要条件，因而淋巴细胞增殖反应被认为是反映淋巴细胞功能的主要指标之一。由于IL-2的产生与IL-2R表达对T细胞活化并进入增殖状态至关重要，休克后IL-2产生减少、IL-2受体表达降低可能是淋巴细胞增殖受抑的主要原因。IL-2产生及其受体表达降低的原因尚不清楚。有研究发现，休克后T辅助细胞(Th)亚群发生改变，Th1分泌IL-2、INF-γ减少，而Th2分泌IL-2、IL-10增多，增多的IL-10可直接抑制T、B细胞活性或通过抑制巨噬细胞抗原提呈能力及其协同因子(如IL-1)分泌的间接途径抑制淋巴细胞功能[8]。
吞噬功能正常是巨噬细胞发挥非特异性免疫防御反应的重要保证。休克早期巨噬细胞吞噬功能受抑，使机体的防御能力受到削弱，这可能是造成创伤失血性休克后机体对感染易感性增加的重要原因之一。Kondo等[9]也发现休克复苏后早期(24h)肝脏网状内皮吞噬系统对大肠杆菌的吞噬和杀灭能力均受到抑制。巨噬细胞吞噬清除能力下降除与血清调理素水平(如纤维连结蛋白、C3b)有关外，与巨噬细胞本身的变化(如其表面受体Fc、C3b表达减少)也有关[9]。
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巨噬细胞既作为吞噬细胞参与非特异性免疫反应，又作为抗原提呈细胞参与特异性免疫反应。巨噬细胞将摄取的外来抗原加工后以MHC-Ⅱ(Ia)复合体形式表达于细胞表面，被T细胞表面受体识别，将抗原信号传递给T细胞，从而启动特异性免疫反应。同时巨噬细胞还分泌适量的细胞因子(如IL-1、IL-6等)作为协同信号刺激T细胞活化。本实验发现休克后腹腔巨噬细胞抗原提呈能力下降，细胞因子分泌减少，这可能是淋巴细胞功能受抑制的原因之一，也是休克后机体易于感染的另一重要原因[10]。
总之，创伤合并失血性休克后机体免疫功能受到广泛影响，淋巴细胞和巨噬细胞的功能受损，并持续较长的时间。与以往的单纯创伤或失血性休克动物模型相比，本实验结果更符合临床的实际情况，因而更具有临床参考价值。本实验结果还为进一步研究创伤-失血性休克后免疫功能改变的发生机制，探讨相应的免疫调理措施提供了重要线索。
基金项目：全军“九五”指令性课题(96L041)
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作者简介：刘靖华(1965.5)，女，陕西省富平县人，博士，主治医师，主要从事创伤与免疫方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68754146
参考文献
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收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-09-28, 百拇医药