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编号:10215075
三个封闭群小鼠线粒体DNAPCR-RFLP分析
http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第1期
     作者:戴纪刚 魏泓 肖颖彬 张国强

    单位:戴纪刚(第三军医大学:附属新桥医院胸外科,重庆 400037);魏泓(实验动物中心,重庆 400038);肖颖彬(第三军医大学:附属新桥医院胸外科,重庆 400037);张国强(第三军医大学:附属新桥医院胸外科,重庆 400037)

    关键词:封闭群小鼠;mtDNA;PCR-RFLP;多态性

    第三军医大学学报000109

    提要 目的:分析KM等3个封闭群小鼠线粒体DNA(mtDNA)的多态性,探讨实验小鼠的遗传监测方法。方法:PCR-RFLP技术,即PCR技术结合限制性内切酶片段长度多态分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)。结果:mtDNAD-Loop、tRNA1基因、ND3基因片段经HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRV、HindⅢ、HpaⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ、NdeⅡ、XhoⅠ、XbaⅠ、AluⅠ、RsaⅠ、StuⅠ、DraⅠ、AvaⅠ、HaeⅡ16种内切酶分别消化后,KM、NIH、ICR等小鼠品系内、品系间均表现出相同的酶切图谱,且与近交系小鼠BALB/C完全相同,未发现多态性。结论:KM、NIH、ICR小鼠与绝大多数实验小鼠一样,遗传背景较为狭窄,不同品系小鼠间遗传背景的差异远远低于动物种属间的差异。
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    中图法分类号 R342.3;R394 文献标识码 A

    文章编号:1000-5404(2000)01-0029-04

    Analysis of mitochondrial DNA in 3 closed colonies of mice

    DAI Ji-gang,WEI Hong,XIAO Yin-bin,ZHANG Guo-qiang

    (Department of Thoratic Surgery of Xinqiao Hospital,Chongqing 400037)

    Abstract Objective:To study the polymorphism of mitochondrial DNA in 3 closed colonies of mice.Methods:PCR-RFLP.Results:After the cleavage with 16 restriction endonucleases including HaeⅢ,HinfⅠ,EcoRV,HindⅢ,HpaⅠ,BamHⅠ,ApaⅠ,NdeⅡ,XhoⅠ,XbaⅠ,AluⅠ,RsaⅠ,StuⅠ,DraⅠ,AvaⅠ,HaeⅡ,all the restriction patterns of the D-loop of mitochondrial DNA,tRNAⅠ fragment and ND3 fragment were identical in the 3 colonies of KM,NIH and ICR and were the same as those of BALB/c strain of mouse.Polymorphism of mitochondrial DNA was not found.Conclusion:The genetic background of KM,NIH and ICR mice,similar to that of most of laboratory mice,is limited and the diversity of genetic background of different strains of laboratory mice is far fewer than the interspecies diversities of other animals.
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    Key words closed colony mouse;mitochondrial DNA;PCR-RFLP;polymorphism

    线粒体DNA是染色体外的遗传物质,它的限制性内切酶图谱在不同的种系、亚种间具有多态性。这种多态性反映出不同种间、亚种间的遗传差异及进化关系。随着分子生物技术的迅速发展,mtDNA基因精细结构的不断揭示,分析mtDNA特定基因或特定区域的变异以便能更为精确地找出变异已成为当前mtDNA研究热点。mtDNA为环状双链的DAN分子,由基因编码区和非编码区组成。mtDNA的非编码区,即D-Loop,占全部mtDNA分子的6%左右,在mtDNA的转录和复制中起重要作用,为mtDNA分子内的高变异笥区。为了解KM、NIH、ICR等小鼠mtDNA的多态性,探讨实验小鼠的遗传监测方法,我们扩增了KM、NIH、ICR等3个封闭群小鼠mtDNA的D-Loop、tRNA1、ND3基因片段,并对其进行了品系内、品系间限制性内切酶片段长度多态性分析。
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    1 材料与方法

    1.1 动物来源及试剂

    KM、NIH、ICR3个封闭群小鼠各10只,BALB/C小鼠1只,由第三军医大学实验动物中心提供;限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、HpaⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ、NdeⅡ、XhoⅠ、XbaⅠ、AluⅠ、RsaⅠ、StuⅠ、DraⅠ、AvaⅠ、HaeⅡ购自德国宝灵曼公司和美国Promega公司;多聚酶链反应(PCR)试剂盒系德国Roch公司产品;其它生化试剂系国产分析。

    1.2 总DNA的提取

    按常规酶解法提取上述鼠肝脏细胞总DNA,其中包括mtDNA,各取0.5μg作PCR模板。

    1.3 PCR扩增

    所用引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成,见表1。
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    表1 引物序列及扩增片段长度

    Tab1 primer sequences and the lengths of the amplified fragments Amplified fragments

    Fragment length(bp)

    Location

    Primer sequences

    D-Loop

    1100

    L chain(15294-15320)

    5'-ATAAACATTACTCTGGTCTTGTAAACC-3'
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    H chain(98-72)

    5'-ATTAATAAGGCCAGGACCAAACC3'

    tRNA1 fragment

    1126

    L chain(3401-3419)

    5'-CGGCCCATTCGCGTTATTC-3'

    H chain(4527-4508)

    5'-AGGTTGAGTAGAGTGAGGGA-3'

    ND3 fragment

    534
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    L chain(9364-9385)

    5'-ACGTCTCCATTTATTGATGAGG-3'

    H chain(9897-9876)

    5'-GAGGTTGAAGAAGGTAGATGGC-3'

    建立100μl反应体系,内含0.5μl总DNA为模板,先经94°C变性5min,加入1μl(4U/μl)的Taq酶循环30个周期(每个周期94°C30s、55°C1min、72°C1min),最终72°C延长10min。

    1.4 PCR产物限制性内切酶消化

    逐一取扩增产物5μl,分别加入2u的限制性内切酶和1.2μl10×酶切缓冲液,加灭菌水至12μl,37°C温育过夜。
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    1.5 电泳分析

    用1%的琼脂糖凝胶,电泳液为1×TBE缓冲液,以3V/cm电泳1~2h,紫外灯下观察并拍照。酶切片段长度测定以华美公司标准Marker(以PBR322为底物,HindⅢ等6种酶水解)酶切片段为分子量标准,利用电泳迁移率与分子量对数间的线性关系,测得各酶切片段分子量。

    2 结果

    2.1 PCR扩增结果

    KM、NIH、ICR、BALB/C小鼠样品均扩增出长1100bp的mtDNAD环片段、长1126bp的tRNA1基因片段、长534bp的ND3基因片段,未发现其长度多态性,见图1。

    图1 1、2、3、4:KM、NIH、ICR、BALB/C小鼠;M:PCR标准Marker;Ⅰ:mtDNAD-Loop扩增
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    结果;Ⅱ:ND3基因片段扩增结果;Ⅲ:tRNA1基因片段扩增结果

    Fig1 1,2,3,4:KM,NIH,ICR and BALB/c mice respectively;M:Standard marker of PCR;

    I:Amplified product of mtDNA D-loop;Ⅱ:Amplified product of ND3 fragment;

    Ⅲ:Amplified product of tRNA1 fragment

    2.2 mtDNAD环、tRNA基因、ND3基因片段限制性内切酶酶切分析

    用HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、HpaⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ、NdeⅡ、XhoⅠ、XbaⅠ、AluⅠ、RsaⅠ、StuⅠ、DraⅠ、AvaⅠ、HaeⅡ等16种内切酶分别对KM、NIH、ICR小鼠不同个体的mtDNAD-Loop、tRNA1基因、ND3基因片段进行了完全酶解。结果发现其品系内、品系间均表现出相同的酶切图谱,且与BALB/C小鼠完全相同,未发现多态性。见图2及表2。
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    图2 1、2、3、4:分别为KM、NIH、ICR、BALB/C小鼠;M:PCR标准Marker;Ⅰ:mtDNAD-Loop

    HinfⅠ酶切结果;Ⅱ:tRNA1基因片段StuⅠ酶切结果;Ⅲ:ND3基因片段HinfⅠ酶切结果

    Fig2 1,2,3,4 are KM,NIH,ICR,BALB/c mice,respectively;M:Standard marker of PCR;

    Ⅰ:Product of mtDNA D-loop digested with Hinf Ⅰ;Ⅱ:Product of tRNA1 fragent digested

    with StuⅠ;Ⅲ:Product of ND3 fragment digested with Hinf Ⅰ
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    表2 鼠mtDNA D-Loop、tRNA1、ND3基因片段限制性内切酶图谱

    Tab2 mouse mtDNA D-Loop,tRNA1,ND3 fragment Restriction patterns Enayme

    D-Loop(1100 bp)

    tRNA1 fragment(1126 bp)

    ND3 fragment(534 bp)

    Endonuclease sites

    Fragment length

    Endonuclease sites
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    Fragment length

    Endonuclease sites

    Fragment length

    HaeⅢ

    4

    456,445,122,…

    4

    470,290,136,…

    1

    392,142

    H inf Ⅰ

    1
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    700,400

    0

    1126

    4

    253,84,…

    Apa Ⅰ

    1

    655,445

    1

    658,469

    0

    534

    Alu Ⅰ
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    4

    545,269,102,…

    3

    655,318,135,…

    1

    310,224

    BamH Ⅰ

    0

    1100

    2

    710,252,164

    0

    534
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    Dra Ⅰ

    0

    1100

    1

    634,493

    1

    451,83

    Stu Ⅰ

    0

    1100

    2

    605,297,225

    1
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    391,143

    Nde Ⅱ

    2

    845,118,37

    0

    1126

    0

    534

    Rsa Ⅰ

    6

    720,178,125,…

    4

    192,259,228
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    2

    353,103,78

    Xba Ⅰ

    1

    680,420

    0

    1126

    0

    534

    There are no endonulease sites by EcoRV、HindⅢ、HpaⅠ、HaeⅡ、XhoⅠ、AvaⅠrestriction enzyme

    3 讨论
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    高等动物mtDNA是共价闭合的双链DNA,分子量大小为16.5kb左右。mtDNA基因组织结构简单、稳定,且遵循母系遗传方式,在遗传过程中不发生重组。利用限制性内切酶处理mtDNA,得到的限制性内切酶片段长度多态(RFLP)或限制性内切酶图谱既具有相对的种属稳定性,又能够反映种属间的进化关系,因而成为动物种属鉴定和系统演化研究的一种有效的遗传标记。mtDNA限制性内切酶片段长度多态分析,目前已广泛地应用于动物起源和遗传分化的研究,成为一种有效地遗传监测方法[1]。但这一方法需要新鲜或冻存的组织材料,且制备mtDNA所需细胞量大、操作程序复杂,这在很大程度上限制了该方法的应用。随着PCR技术的诞生和发展,使得我们从陈旧组织(如切片、标本)、微量组织、甚至化石材料中提取并直接扩增DNA成为可能。采用PCR技术结合RFLP分析,不仅避免了实验材料的限制,而且还可有目的地选择性扩增mtDNA突变频率高的特定区域或特定基因,更为精确地分析mtDNA的变异。这对于研究动物遗传、进化无疑具有重要意义[2,3]
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    实验用小鼠是目前使用最为广泛的实验动物,主要分为近交系小鼠和封闭群小鼠等。近交系小鼠由于其特殊的繁育过程,最终导致品系内个体除雌雄间存在着有无Y染色体的差别外其余遗传构成的多样性完全消失,即在同一近交系中不同个体的基因型(除雌雄间由Y染色体决定外)在个体间完全相同;而不同近交系间,由于始建时个体来源不同,所以最终品系间存在基因型的不同。而封闭群小鼠是在封闭条件下,不从外部引种,群体内随机交配繁殖,培育5年以上形成的群体遗传特性保持相对稳定而个体间存在一定遗传差异的小鼠群体[4]。了解和分析实验用小鼠mtDNA的多态性,探讨实验用小鼠的遗传质量监测方法,更好地保证其遗传质量具有重要意义。关于近交系小鼠mtDNA多态性的研究已有报道。Ferris等[5]对9种近交系小鼠及多种野生鼠mtDNA限制性酶切分析发现,野生鼠之间mtDNA具有丰富的多态性;而BALB/C等9种近交系小鼠出现了完全相同的酶切图谱,并且与欧洲亚种M.m.domesticus的酶切图谱一致。Yonekawa等[6,7]人对Mus musculus的各个亚种及BALB/C、AKR、C57BL等主要实验小鼠品系进行了mtDNA的限制性内切酶片段长度多态分析,结果发现:BALB/C、AKR、C57BL等50余种主要实验小鼠品系mtDNA内切酶图谱完全相同,且与M.m.domesticus内切酶图谱一致;其余个别品系如RR小鼠mtDNA内切酶图谱与M.m.brevirostis相同。但迄今为止,对封闭群的研究鲜见报道。我们用PCR-RFLP技术对KM、NIH、ICR等3个封闭群小鼠mtDNA的D-Loop、tRNA1、ND3基因片段进行了分析,结果发现其品系内、品系间均表现出相同的酶图谱,且与BALB/C小鼠完全相同,未发现多态性。结果表明KM、NIH、ICR小鼠与绝大多数实验小鼠一样,遗传背景较为狭窄,不同品系小鼠间遗传背景的差异远远低于动物种属间的差异。也正因为如此,对实验小鼠来说,mtDNA限制性内工酶片段长度多态分析不是一种有效的遗传监测手段。因此有必要发展和探索一些多态性丰富、更精确的方法来对实验小鼠进行遗传监测。
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    基金项目:国家自然科学基金资助项目(39600079;39900173);全军“九五”医药卫生科研基金资助项目(96M083);重庆市攻关项目

    作者简介:戴纪刚(1972.11),男,湖南省娄底市人,硕士研究生,住院医师,主要从事肿瘤遗传学方面的研究,发表论文10余篇。电话:(023)67660997

    参考文献

    [1]张亚平,施立明.动物线粒体DNA多态性的研究概况[J].动物学研究,1992,13(3):289-295.

    [2]Smith M F,Patton J L.Variation in mitochondrial cytochrome b sequence in natural population of South American akodontine rodents[J].Mol Biol Evol,1991,8(11):85-103.
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    [3]Davoli R,Costosi A,Costs N,et al.HincⅡ and HaeⅢ RFLPs in the porcine mtDNA D-loop region[J].Anim Genet,1995,26(7):201-213.

    [4]魏泓.医学实验动物学[M].成都:四川科学技术出版社,1998.24-54.

    [5]Ferris S D,Sage Rd,Wilson A C.Evidence from mtDNA sequnces that common laboratory strains of inbred mice are descended from a single female[J].Nature,1982,295(14): 163-168.

    [6]Yonekawa H K,Moriwaki O,Gotoh N,et al.Origins of labaratory mice deduced from restriction patterns of mitochondrial DNA[J].Differentiation,1982,22(5):222-226.

    [7]Ferris S D,Sage R D,Prager E M,et al.Mitochondrial DNA evolution in mice[J].Genetics,1983,105(12):681-721.

    收稿日期:1999-06-30

    修回日期:1999-09-13, 百拇医药