血清TTV-DNA检测及TTV肝炎临床特点初探
作者：张瑞 张绪清 顾长海 黄燕萍 王海涛
单位：张瑞(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；张绪清(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；顾长海(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；黄燕萍(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；王海涛(军事医学科学院，北京 100850)
关键词：输血传播病毒；多聚酶链反应；肝炎；病毒性
第三军医大学学报000127
提要 目的：了解输血传播病毒(TTV)在非甲～庚型肝炎中的感染状况，探讨其在肝炎发病中的作用和地位。方法：采用套式PCR法检测血标本中的TTV-DNA。结果：检测了30例非甲～庚型肝炎病人，其中血清TTV-DNA阳性者11例，阳性率36.7%。结论：TTV感染与ALT异常有极为密切的关系，可能是导致非甲～庚型肝炎重要病原。
, 百拇医药
中图法分类号 R394；R512.6 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0091-03
Detection of TTV-DNA and serum clinical characteristics of TTV hepatitis
ZHANG Rui,ZHANG Xu-qing,GU Chang-hai,HUANG Yang-ping,WANG Hai-tao
(Infectious Diseases Research Center of PLA,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chong qing 400038)
Abstract Objective:To investigate the transfusion transmitted virus (TTV) infection in the patients with non-A-G hepatitis.Mehtods:TTV-DNA in serum was detected by nest PCR.Results:The serum TTV-DNA was positive in 11 of 30 (36.7%) patients with non-A-G hepatitis.Conclusion:TTV infection was closely correlated with elevated aminotransferase and TTV may be one of the major causes of non-A-G hepatitis in China.
, 百拇医药
Key words TTV; polymerase chain reaction; hepatitis; virous
1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并将之命名为输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV)。初步研究表明，这种病毒可能是一种新的输血后非甲～庚型肝炎的致病病原[1]。1999年4月已有报道在我国人群中也存在TTV感染[2]。为了解TTV感染在非甲～庚型肝炎发病中的作用与地位，我们对近期收集的部分非甲～庚型肝炎血清进行了TTV-DNA/PCR检测，现将研究报告如下。
1 材料与方法
1.1 血清采集
采集1996年4月至1998年7月部分非甲～庚型肝炎病人(西南医院住院病人)血清标本30例。
, http://www.100md.com
1.2 检测指标及检测方法
1.2.1 排除甲型～庚型肝炎病毒感染的方法 用ELISA法和RT-PCR检测排除甲型～庚型肝炎病毒感染所用的ELISA试剂均购自美国Abbott公司。PCR试剂为军事医学科学院五所提供。
1.2.2 套式PCR检测血清TTV-DNA的方法 ①DNA提取：采用STG试剂提取血清病毒DNA(试剂购自美国BiotronicsTech.Corp公司)。取50μlSTG缓冲液混匀，100℃变性5min，13000×g离心10min，挑除变性蛋白，加90μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水10μl溶解备用。②套式PCR检测TTV-DNA：P1/P2为外引物，序列分别为P1:5′-CCAGGAGCA-TATACAGAC-3′；P2：5′-TGTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3′；P3/P4为内引物，序列分别为P3：5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAAC-3′；P4：5′-AACAGGCACATTACTACTACC-3′。第1轮PCR反应条件：取模板4μl、10×PCRbuffer3μl、dNTPs0.8μmol/L、P1/P20.1μmol/L,30μl反应体积，94℃预变性180s，94℃40s,55℃40s,72℃，45s,扩增35个循环；取第1次PCR产物2μl作模板，10×PCRbufer3μl反应体积进行第2次扩增，循环条件为：94℃40s，55℃40s,72℃40s,扩增30个循环。取2次PCR产物10μl，用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。每次PCR均设阳性及阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 TTV-DNA的检测
采用以上方法用套式PCR扩增的产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下见在380bp外可见目的带，见图1。
图1 二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig1 2nd round PCR products showed in electrophoresis
agarose gels
Negative control;2:Positive control;5:HBV-DNA marker(PEG-TZF)；3、4、6：Positiveserum
, 百拇医药
2.2 受检测非甲～庚肝炎中的阳性率
对此30例非甲～庚型肝炎的血清标本，用PCR检测TTV-DNA其中1例阳性，阳性率为36.7%。
2.3 TTV肝炎患者中的临床情况
从本11例TTV阳性的病人来看，其中4例为急性黄疸型肝炎，1例为急性无黄疸型肝炎，3例为慢性肝炎，2例为瘀胆型肝炎，1例为慢性重型肝炎。其临床及实验室情况见表1。
表1 TTV阳性肝炎临床及实验室情况
Fig1 Clinical characteristic and liver function test in patient with TTV positive hepatits
Age
, http://www.100md.com
Sex
Precursory
symton
History of
transfusion
ALT
(IU/L)
TB
(μmol/L)
A/G
PT
Range
, http://www.100md.com 22～66
8/3
3
0
115～438
19～687
0.95～1.48
13～26
Mean
54.9
-
27.3%*
0
, http://www.100md.com
270.6
242.8
1.22
14.6
*:Percentage; TB:Total bilirubin;PT:Prothrombin time;A/G:ratio of albumin and globulin; ALT:alanine transaminase
从上表可见，我们所测的11例TTV阳性病人中，平均年龄为54.9岁，3例起病时有明确的“上感”样症状，无1例有明确的输血史。其肝功能检查ALT平均为270.6IU/L，TB平均为242.8μmol/L，A/G比值平均1.22,PT平均为14.6s。
3 讨论
, http://www.100md.com
现有的研究表明，70%的非甲～庚型肝炎病例原因不明[3～5]。1997年底日本学者发现了一种单链DNA病毒，研究表明与血清转氨酶异常有密切关系，今年初我国已证实国人中也存在TTV[2]。
TTV主要有二个读码框架(ORF)，分别编码770和220个氨基酸，其基因组长约3.7kb。TTV与已知动物单链DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科，如鸡贫血病毒)和绒状细小病毒科(如人细小病毒B19，腺联病毒AAV)。从已知的资料来看，TTV更象细小病毒[6]。多数报道认为TTV与输血后肝炎相关，TTV-DNA在暴发性肝炎中的检出率明显高于无症状献血员，有一系列的证据支持TTV具有诱发肝炎的能力[7]。在日本的急性和慢性非甲～庚型肝炎患者中TTV-DNA阳性率为50%。在输血后非甲～庚型肝炎病人中阳性率更高，在献血员中TTV-DNA检出率约为12%。我国的研究表明在非甲～庚型肝炎TTV-DNA阳性率为30%～60%。我们报道为36.6%，在此范围中。这些都提示TTV感染极有可能是导致非甲～庚型肝炎的重要病原。
, 百拇医药
通过分析我们这11例TTV-DNA阳性的肝炎患者，可初步归纳以下几点：①病型多。11例阳性患者中4例为普通型急性黄疸型肝炎，1例为急性无黄疸型肝炎，3例为慢性肝炎，2例为瘀胆型肝炎，1例为慢性重型肝炎。②发病年龄似乎偏大。从年龄上看其波动范围22～66岁，平均54.9岁。③重度黄疸多。此类病人TB波动范围19～687μmol/L，平均242.8μmol/L。④PT基本正常。除1例PT26′/13′外其余均在正常范围，平均14.6s。⑤无明确的输血史，TTV可以经过血源性途径感染传播，而我们检查的11例TTV阳性病人中均无明确的输血史，这提示TTV感染存在接触传播或消化道传播等途径。
作者简介：张瑞(1963.4)，女，浙江省渠州市人，博士，主治医师，主要从事乙型肝炎病毒变异与免疫发病机制的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68754293
参考文献
[1]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttrans-fusion hepatitis of unknown etiology[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241(1):92-97.
, 百拇医药
[2]周育森，何忠平，董京芳.中国人TTV部分基因克隆及序列测定[J].军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81-83.
[3]Leary T P,Muerhoff S A,Simons J N,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis[J].J Med Virol,1996,48(1):60-67.
[4]Linnen J,Jr Wages J,Zhang-Keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:A transfu-sion-transmissible agent [J].Science,1996,271(5248):505-508.
, http://www.100md.com
[5]周育森，陈薇，王海涛，等.中国庚型肝炎病毒(HGV)全基因结构特点及HGV感染的地理分布[J].微生物学通报，1997，24(5)：27-31.
[6]Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with pos-ttransfusion hepatitis of unknown etiology[J].Hepatology Research,1998,10(10):1-16.
[7]Glavits R,Ratz F,Palya V,et al.Pathological and immuno-logical study of goose embryos and goslings inoculated with an attenuated strain of Derzsy′ s disease virus[J].Acta Vet Hung,1991,39(1～2)：39-47.
收稿日期：1998-12-20
修回日期：1999-09-16, 百拇医药
单位：张瑞(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；张绪清(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；顾长海(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；黄燕萍(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心，重庆 400038)；王海涛(军事医学科学院，北京 100850)
关键词：输血传播病毒；多聚酶链反应；肝炎；病毒性
第三军医大学学报000127
提要 目的：了解输血传播病毒(TTV)在非甲～庚型肝炎中的感染状况，探讨其在肝炎发病中的作用和地位。方法：采用套式PCR法检测血标本中的TTV-DNA。结果：检测了30例非甲～庚型肝炎病人，其中血清TTV-DNA阳性者11例，阳性率36.7%。结论：TTV感染与ALT异常有极为密切的关系，可能是导致非甲～庚型肝炎重要病原。
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中图法分类号 R394；R512.6 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0091-03
Detection of TTV-DNA and serum clinical characteristics of TTV hepatitis
ZHANG Rui,ZHANG Xu-qing,GU Chang-hai,HUANG Yang-ping,WANG Hai-tao
(Infectious Diseases Research Center of PLA,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chong qing 400038)
Abstract Objective:To investigate the transfusion transmitted virus (TTV) infection in the patients with non-A-G hepatitis.Mehtods:TTV-DNA in serum was detected by nest PCR.Results:The serum TTV-DNA was positive in 11 of 30 (36.7%) patients with non-A-G hepatitis.Conclusion:TTV infection was closely correlated with elevated aminotransferase and TTV may be one of the major causes of non-A-G hepatitis in China.
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Key words TTV; polymerase chain reaction; hepatitis; virous
1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并将之命名为输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV)。初步研究表明，这种病毒可能是一种新的输血后非甲～庚型肝炎的致病病原[1]。1999年4月已有报道在我国人群中也存在TTV感染[2]。为了解TTV感染在非甲～庚型肝炎发病中的作用与地位，我们对近期收集的部分非甲～庚型肝炎血清进行了TTV-DNA/PCR检测，现将研究报告如下。
1 材料与方法
1.1 血清采集
采集1996年4月至1998年7月部分非甲～庚型肝炎病人(西南医院住院病人)血清标本30例。
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1.2 检测指标及检测方法
1.2.1 排除甲型～庚型肝炎病毒感染的方法 用ELISA法和RT-PCR检测排除甲型～庚型肝炎病毒感染所用的ELISA试剂均购自美国Abbott公司。PCR试剂为军事医学科学院五所提供。
1.2.2 套式PCR检测血清TTV-DNA的方法 ①DNA提取：采用STG试剂提取血清病毒DNA(试剂购自美国BiotronicsTech.Corp公司)。取50μlSTG缓冲液混匀，100℃变性5min，13000×g离心10min，挑除变性蛋白，加90μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水10μl溶解备用。②套式PCR检测TTV-DNA：P1/P2为外引物，序列分别为P1:5′-CCAGGAGCA-TATACAGAC-3′；P2：5′-TGTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3′；P3/P4为内引物，序列分别为P3：5′-ACAGACAGAGGAGAAGGCAAC-3′；P4：5′-AACAGGCACATTACTACTACC-3′。第1轮PCR反应条件：取模板4μl、10×PCRbuffer3μl、dNTPs0.8μmol/L、P1/P20.1μmol/L,30μl反应体积，94℃预变性180s，94℃40s,55℃40s,72℃，45s,扩增35个循环；取第1次PCR产物2μl作模板，10×PCRbufer3μl反应体积进行第2次扩增，循环条件为：94℃40s，55℃40s,72℃40s,扩增30个循环。取2次PCR产物10μl，用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。每次PCR均设阳性及阴性对照。
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2 结果
2.1 TTV-DNA的检测
采用以上方法用套式PCR扩增的产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下见在380bp外可见目的带，见图1。
图1 二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig1 2nd round PCR products showed in electrophoresis
agarose gels
Negative control;2:Positive control;5:HBV-DNA marker(PEG-TZF)；3、4、6：Positiveserum
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2.2 受检测非甲～庚肝炎中的阳性率
对此30例非甲～庚型肝炎的血清标本，用PCR检测TTV-DNA其中1例阳性，阳性率为36.7%。
2.3 TTV肝炎患者中的临床情况
从本11例TTV阳性的病人来看，其中4例为急性黄疸型肝炎，1例为急性无黄疸型肝炎，3例为慢性肝炎，2例为瘀胆型肝炎，1例为慢性重型肝炎。其临床及实验室情况见表1。
表1 TTV阳性肝炎临床及实验室情况
Fig1 Clinical characteristic and liver function test in patient with TTV positive hepatits
Age
, http://www.100md.com
Sex
Precursory
symton
History of
transfusion
ALT
(IU/L)
TB
(μmol/L)
A/G
PT
Range
, http://www.100md.com 22～66
8/3
3
0
115～438
19～687
0.95～1.48
13～26
Mean
54.9
-
27.3%*
0
, http://www.100md.com
270.6
242.8
1.22
14.6
*:Percentage; TB:Total bilirubin;PT:Prothrombin time;A/G:ratio of albumin and globulin; ALT:alanine transaminase
从上表可见，我们所测的11例TTV阳性病人中，平均年龄为54.9岁，3例起病时有明确的“上感”样症状，无1例有明确的输血史。其肝功能检查ALT平均为270.6IU/L，TB平均为242.8μmol/L，A/G比值平均1.22,PT平均为14.6s。
3 讨论
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现有的研究表明，70%的非甲～庚型肝炎病例原因不明[3～5]。1997年底日本学者发现了一种单链DNA病毒，研究表明与血清转氨酶异常有密切关系，今年初我国已证实国人中也存在TTV[2]。
TTV主要有二个读码框架(ORF)，分别编码770和220个氨基酸，其基因组长约3.7kb。TTV与已知动物单链DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科，如鸡贫血病毒)和绒状细小病毒科(如人细小病毒B19，腺联病毒AAV)。从已知的资料来看，TTV更象细小病毒[6]。多数报道认为TTV与输血后肝炎相关，TTV-DNA在暴发性肝炎中的检出率明显高于无症状献血员，有一系列的证据支持TTV具有诱发肝炎的能力[7]。在日本的急性和慢性非甲～庚型肝炎患者中TTV-DNA阳性率为50%。在输血后非甲～庚型肝炎病人中阳性率更高，在献血员中TTV-DNA检出率约为12%。我国的研究表明在非甲～庚型肝炎TTV-DNA阳性率为30%～60%。我们报道为36.6%，在此范围中。这些都提示TTV感染极有可能是导致非甲～庚型肝炎的重要病原。
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通过分析我们这11例TTV-DNA阳性的肝炎患者，可初步归纳以下几点：①病型多。11例阳性患者中4例为普通型急性黄疸型肝炎，1例为急性无黄疸型肝炎，3例为慢性肝炎，2例为瘀胆型肝炎，1例为慢性重型肝炎。②发病年龄似乎偏大。从年龄上看其波动范围22～66岁，平均54.9岁。③重度黄疸多。此类病人TB波动范围19～687μmol/L，平均242.8μmol/L。④PT基本正常。除1例PT26′/13′外其余均在正常范围，平均14.6s。⑤无明确的输血史，TTV可以经过血源性途径感染传播，而我们检查的11例TTV阳性病人中均无明确的输血史，这提示TTV感染存在接触传播或消化道传播等途径。
作者简介：张瑞(1963.4)，女，浙江省渠州市人，博士，主治医师，主要从事乙型肝炎病毒变异与免疫发病机制的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68754293
参考文献
[1]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttrans-fusion hepatitis of unknown etiology[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241(1):92-97.
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[2]周育森，何忠平，董京芳.中国人TTV部分基因克隆及序列测定[J].军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81-83.
[3]Leary T P,Muerhoff S A,Simons J N,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis[J].J Med Virol,1996,48(1):60-67.
[4]Linnen J,Jr Wages J,Zhang-Keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:A transfu-sion-transmissible agent [J].Science,1996,271(5248):505-508.
, http://www.100md.com
[5]周育森，陈薇，王海涛，等.中国庚型肝炎病毒(HGV)全基因结构特点及HGV感染的地理分布[J].微生物学通报，1997，24(5)：27-31.
[6]Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with pos-ttransfusion hepatitis of unknown etiology[J].Hepatology Research,1998,10(10):1-16.
[7]Glavits R,Ratz F,Palya V,et al.Pathological and immuno-logical study of goose embryos and goslings inoculated with an attenuated strain of Derzsy′ s disease virus[J].Acta Vet Hung,1991,39(1～2)：39-47.
收稿日期：1998-12-20
修回日期：1999-09-16, 百拇医药