红细胞糖苷脂可以抑制在体外培养的人脑胶质瘤细胞突起的形成
作者：张健 张宗城 李鹏 张积仁
单位：张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；李鹏(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：脑胶质瘤；中性鞘糖脂；生长调控
第一军医大学学报000115 摘要：目的 探讨中性鞘糖脂在脑胶质瘤细胞生长调控中的作用。方法 用改良的Hakomori方法，提取正常脑组织和脑胶质瘤组织中的中性鞘糖脂，并经柱层析法进一步纯化其中的单一成分红细胞糖苷脂(globoside)和CDH，运用扫描电镜观察它们对胶质瘤细胞生长的影响。结果 正常脑组织高表达的红细胞糖苷脂可以抑制体外培养人脑胶质瘤细胞株细胞突起的形成，而脑胶质瘤相关CDH对脑胶质瘤细胞生长无明显影响。结论 中性鞘糖脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成，其作用与其结构相关。
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中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0044-04
Inhibition effect of globoside on the formation of the protuberance in human glioma cells by Globoside
ZhANG Jian, ZHANG Zong-cheng, LI Peng, ZHANG Ji-ren
(The Oncology Centre, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective The effects of neutral glycolipids (N-GSLs) on the growth of glioma cells were investigated. Methods The N-GSLs was extracted and purified from normal human brain and glioma tissue with the modified method of Hakomori, globoside and CDH from normal human brain and glioma tissue were further separated from the total N-GSLs by the method of column chromatography. The effects of globoside and CDH on the growth of glioma cells in vitro were observed with scanning electronic microscopy. Results Globoside from normal human brain can inhibit the formation of the protuberance of glioma cells while CDH has no such effect. Conclusions N-GSLs can inhibit the growth of glioma cells, and this ability is closely related to the structure of the N-GSLs.
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Key words: glioma of the brain; neutral glycosphingolipids; growth regulation
鞘糖脂是细胞表面糖萼(glycocalyx)的主要成分之一， 它们不仅在细胞的社会行为中具有重要意义，而且对细胞的增殖、分化、代谢等功能具有调控作用[1]。目前国内外这方面的研究多集中于神经节苷脂上[2]，且运用的糖脂大多从牛脑中分离纯化，我们在对人脑胶质瘤中性鞘糖脂的研究中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂(Globoside)表达为主，而CDH在胶质瘤组织中表达较强，为了了解正常及肿瘤相关鞘糖脂对肿瘤细胞的生长调控作用，本实验观察了正常脑组织红细胞糖苷脂及脑胶质瘤CDH对胶质瘤细胞株生长的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
SWO–38人脑星形胶质瘤细胞株[3]，购自暨南大学医学院病理教研室，本室传代培养。正常人脑组织(脑灰质)(取自因意外事故非疾病死亡之尸体，取标本时间距死亡<1 h)。手术切除标本，经病理证实为星型胶质细胞瘤Ⅲ～Ⅳ级。
1.2 主要实验试剂
RPMI-1640培养液：美国Gibco公司。胎牛血清：国产，55℃灭活30 min，分装，-20℃冷冻备用。中性糖脂抽提剂：甲醇、氯仿、醋酸钠为国产AR级试剂。高效薄层层析板(Gilica gel 60 HPTLC plates)：德国E Merck公司。硅胶H：国产。丙酮，乙酸异戊酯，锇酸等常规试剂为国产分析纯试剂。
1.3 实验方法
1.3.1 组织中性糖脂的提取(按改良的Hakomori的方法[4]) (1)标本的预处理：分别取上述正常脑及胶质瘤组织各20 g，以pH7.4，0.01 mol PBS液清洗，去除血污及坏死组织，剪碎匀浆后，置-80℃冰箱备用。(2)总脂的提取：已制备的标本分别用20倍体积的氯仿：甲醇液在磁力搅拌下抽提总脂30 min，滤纸过滤，残渣再以同样的方法抽提30 min，共抽提3次，最后一次在4℃下过夜(氯仿:甲醇的体积比分别为2:1、1:1、1:2)。合并3次滤液于(45±3)℃下在旋转蒸发仪中减压蒸发。干燥物用少量氯仿:甲醇(1:1 V/V)溶解备用(-20℃)。(3)DEAE-Sephadex-A25柱层析：提取的总脂以氯仿、甲醇和水溶解，调整三者比例至30:60:8 V/V/V(A液)。称取2.2 g DEAE-Sephadex-A25以30 ml氯仿、甲醇和0.8 mol/L醋酸钠(NaAc) 溶解，调整三者比例至30:60:8 V/V/V(B液)振摇30 min。自然沉淀后弃上清，如此重复3次，最后一次于4℃下过夜。次日再以A液洗3次，方法同前。最后悬于20 ml A液中装柱(2.0 cm×20 cm)，再以A液60 ml洗柱以除去残留的NaAc。含总脂的A液沿已装好填料的柱壁缓慢上柱，速度为0.5 ml/min，装柱后过夜，让总脂与层析柱有充分的时间反应，然后以80 ml A液洗脱，速度为2 ml/min。收集洗脱液，于(45±3)℃下在旋转蒸发仪中减压蒸发，即为中性糖脂粗提物。(4) Florisil 柱层析： Florisil硅胶经用A液处理后上柱， 再将中性糖脂粗提物悬于80 ml 液中，按0.5 ml/min速度上样。洗脱液经减压蒸发后即得纯化中性鞘糖脂。溶于1:1 氯仿:甲醇液中，-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.3.2 正常人脑红细胞糖苷脂和脑胶质瘤CDH单一成分的分离 纯化中性鞘糖脂以1:1氯仿/甲醇溶液溶解，拌硅胶H(10～40 U)加压柱层析，用不同浓度氯仿/甲醇梯度洗脱，分管收集，于TLC板点样检测，60: 35: 8氯仿/甲醇/水展开，碘显色，并与人O型血红细胞膜中性鞘糖脂比较，TLC板上红细胞糖苷脂、CDH均为一个斑点，Rf值分别为0.45、0.70，减压蒸干得到白色固体，-20℃保存备用。
1.3.3 SWO-38细胞中性糖脂的分析 收集体外培养的SWO-38细胞1×108，按上述方法提取中性糖脂，以红细胞膜的中性鞘糖脂为标准品， 将提取的糖脂标本按10μl/条的量点样于高效薄层层析上HPTLC板上，吹干。然后置于已用展开剂平衡2 h的层析缸中上行展开，至板上沿约1 cm时停止。展开剂为氯仿: 甲醇:水( 60:35:8 V/V/V)，新鲜配制。展开完成后冷风吹干，二苯胺喷雾显色。
1.3.4 SWO-38细胞的培养 传代SWO-38细胞接种在含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中， 培养在含有95%空气和5%二氧化碳(CO2)的37℃培养箱中；红细胞糖苷脂及CDH各44μg，加入完全培养基2 ml中，超声乳化，抽滤除菌，备用；SWO-38细胞以1X108/L浓度接种于直径为2.5 cm的玻璃培养皿中， 培养基中含22 mg/L的红细胞糖苷脂或CDH，2%FCS，培养48 h后行扫描电镜观察。
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1.3.5扫描电镜观察 倒弃培养皿中的培养液，以pH7.4，0.1 mol/L的PBS 液轻轻漂洗附着于培养皿的细胞3次；加入2.5%戊二醛固定1 h；在倒置显微镜下观察后，用玻璃刀割出附着细胞较多的培养皿玻璃底板以PBS 液再清洗2遍以洗除残余的戊二醛；丙酮系列(50%、70%、90%、100%、100%、100%)各1次，每次脱水5～6 min；100%醋酸异戊酯中置换30 min；临界点干燥后，在普通生物显微镜下，将样品观察面向上贴在标本台上；离子喷涂，观察，摄影。
2 结果
2.1 红细胞糖苷脂及CDH的纯化
经柱层析法纯化的红细胞糖苷脂及CDH，HPTLC分析显示达到了层析纯，由上述方法可以得到层析纯的红细胞糖苷脂及CDH以用于细胞调控实验(图1)。
2.2 胶质瘤细胞株 SWO–38中性糖脂的表达
, 百拇医药
中性糖脂的各组分CMH、CDH、 CTH、红细胞糖苷脂在SWO–38细胞均有表达(图2)。
2.3 红细胞糖苷脂可抑制胶质瘤细胞突起的形成
经正常人脑红细胞糖苷脂(22 m g/ml)处理后的细胞其突起变短或消失， 细胞表面变得较为光滑，细胞聚集，说明红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成。肿瘤相关CDH对胶质瘤细胞的突起形成无影响用胶质瘤高表达的CDH(22 m g/ml)，同样处理SWO-38细胞后，细胞形态无明显变化，细胞仍然单个生长，不发生聚集(图3)。
图1 从人脑中提取、纯化的红细胞糖苷脂及CDH
Fig.1 Globoside and CDH extracted from normal human brain. Lane 1: marker, N-GSLs from the membrane of human type O RBC; Lane 2: CDH；Lane 3: Globoside
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图2 胶质瘤细胞SWO-38中性糖脂的高效薄层层析图
Fig.2 The HPTLC of N-GSLs from SWO-38 cells. Lane 1: marker; Lane 2: N-GSLs from SWO-38 cells
图3 红细胞糖苷脂和CDH作用胶质瘤细胞SWO-38后的扫描电镜结果
Fig.3 The results of scanning electron microscope of SWO-38 cells treated by globoside and CDH. A. Control cells´ 800；B. Control cells´ 3 200；C. Cells treated with globoside 22mg/L for 48 hours.×800; D. Cells treated with globoside 22mg/L for 48 hours.×2 000; E. Cells treated with CDH 22mg/L for 48 hours.×900; F. Cells treated with CDH 22 mg/L for 48 hours.×2 000
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3 讨论
恶性转化细胞及肿瘤细胞的生长失控，浸润转移等特性，与细胞表面的复合糖成分在性质或数量上的异常有关。鞘糖脂在肿瘤生长调控中的作用已有不少文献报道，外源性的神经节苷脂对肿瘤细胞的调控作用也已有较广泛的研究。研究表明[2]，神经节苷脂可以抑制正常及恶性细胞的生长，其机理未完全阐明，但节苷脂可以抑制受脂质刺激的自身磷酸化、抑制血小板生长因子受体及表皮生长因子受体的二聚体的形成，二及三唾液酸的节苷脂较单唾液酸的节苷脂抑制作用更强，失去1 b系列的节苷脂可能是低分化肿瘤迅速生长的原因[5]。这些研究因肿瘤的异质性、肿瘤细胞抗原的隐蔽性等原因，均未发现特异性抑制胶质瘤细胞恶性增殖及浸润转移的因子，在中性糖脂方面研究更少。我们在实验中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂表达为主，而CDH、CTH在胶质瘤组织中表达较强，这在胶质瘤恶性增殖中有何意义呢？本实验研究了红细胞糖苷脂及CDH对胶质瘤细胞SWO–38生长的影响。
, 百拇医药 由于鞘糖脂与肿瘤细胞的“社会行为”(即浸润、转移)关系密切[1]，而肿瘤细胞表面结构是其执行“社会行为”的物质基础，本实验在电镜下观察了鞘糖脂对肿瘤细胞表面结构的影响。
本实验发现胶质瘤细胞株SWO-38表达中性糖脂的各组分， 经正常人脑高表达的红细胞糖苷脂 22 mg/L处理后，发现其细胞形态发生变化，其细胞表面的突起变短或消失，细胞聚集，而用胶质瘤高表达的CDH (22 mg/L)，同样处理SWO-38细胞后，细胞形态无明显变化，细胞仍然单个生长，不发生聚集。结果表明外源性地加入正常人脑 红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤突起的形成，而CDH无此作用。
红细胞糖苷脂抑制胶质瘤轴突形成的机理还有待进一步的实验探索，但由 红细胞糖苷脂所引起的细胞的聚集似乎与突起形成抑制有关。可能有以下几种因素参与抑制作用：(1)碳水化合物与碳水化合物之间的相互作用参与了细胞与细胞间的相互接触、细胞间的通讯等，细胞表面糖脂积聚，导致产生了细胞间的接触性抑制，红细胞糖苷脂糖链结构较CDH复杂，糖链较长，因而可能产生红细胞糖苷脂有抑制作用而CDH缺乏。(2)细胞膜上的糖脂，可能与细胞生长因子受体的功能有关[85]，加入外源性正常结构的红细胞糖苷脂后，可能影响胶质瘤细胞膜上生长因子受体功能，使胶质瘤细胞的有丝分裂信号阻断，从而抑制其生长及分化。(3)鞘糖脂在生理情况下一般含量较低，在含量丰富的脑灰质中才有千分之几[6]，本实验中红细胞糖苷脂的浓度远远超过生理状态，这可能是胶质瘤患者其周围正常脑组织红细胞糖苷脂对瘤组织的生长缺乏抑制作用，而本实验中出现抑制作用的原因之一。
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肿瘤细胞表面的突起，如微绒毛等与肿瘤细胞的粘附、浸润、转移等相关。红细胞糖苷脂抑制胶质瘤生长有一定的意义：脑胶质瘤的浸润及术后复发使得其愈后欠佳，近20余年的研究也未取得突破性进展，故寻找和发现新的脑胶质瘤生长抑制因子便成为近年来国内外研究的热点。但目前的重点在于抑制基因及抑制蛋白，在鞘糖脂方面也偏重于神经节苷脂，本研究从中性糖脂角度，发现红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成，有可能发现一种新的脑胶质瘤生长抑制因子，为胶质瘤细胞恶性增殖机理的研究开辟一个新的途径。
国家自然科学基金资助(39700143)
参考文献
[1]Hakomori SI. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingolipid metabolism[J]. Cancer Res, 1996, 56:5309～18.
, 百拇医药
[2]Merzak A, Koochekpour S, McCrea S et al. Gangliosides modulate proliferation, migration, and invasiveness of human brain tumor cells in vitro[J]. Mol Chem Neuropathol, 1995, 24(2-3):121～35.
[3]司徒锐, 王惠华, 王锦环等. 人脑恶性胶质瘤体外细胞系SWO-38的建立和生物学特性[J]. 癌症，1987, 6(4):235～7.
[4]张世忠，张 健，张积仁. 脑胶质瘤中性鞘糖脂抗原的初步研究[J]. 中华神经外科杂志，1998, 14(1):34～6.
[5]Sung CC, Pearl DR, Coons SW et al. Correlation of ganglioside patterns of primary brain tumors with survival[J]. Cancer, 1995, 75(3):851～9.
[6]王维通. 鞘氨醇糖脂的结构、分离及检测[J]. 国外医学·分子生物学分册，1987, 9(1):1～5.
1998-12-22, http://www.100md.com
单位：张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；李鹏(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：脑胶质瘤；中性鞘糖脂；生长调控
第一军医大学学报000115 摘要：目的 探讨中性鞘糖脂在脑胶质瘤细胞生长调控中的作用。方法 用改良的Hakomori方法，提取正常脑组织和脑胶质瘤组织中的中性鞘糖脂，并经柱层析法进一步纯化其中的单一成分红细胞糖苷脂(globoside)和CDH，运用扫描电镜观察它们对胶质瘤细胞生长的影响。结果 正常脑组织高表达的红细胞糖苷脂可以抑制体外培养人脑胶质瘤细胞株细胞突起的形成，而脑胶质瘤相关CDH对脑胶质瘤细胞生长无明显影响。结论 中性鞘糖脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成，其作用与其结构相关。
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中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0044-04
Inhibition effect of globoside on the formation of the protuberance in human glioma cells by Globoside
ZhANG Jian, ZHANG Zong-cheng, LI Peng, ZHANG Ji-ren
(The Oncology Centre, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective The effects of neutral glycolipids (N-GSLs) on the growth of glioma cells were investigated. Methods The N-GSLs was extracted and purified from normal human brain and glioma tissue with the modified method of Hakomori, globoside and CDH from normal human brain and glioma tissue were further separated from the total N-GSLs by the method of column chromatography. The effects of globoside and CDH on the growth of glioma cells in vitro were observed with scanning electronic microscopy. Results Globoside from normal human brain can inhibit the formation of the protuberance of glioma cells while CDH has no such effect. Conclusions N-GSLs can inhibit the growth of glioma cells, and this ability is closely related to the structure of the N-GSLs.
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Key words: glioma of the brain; neutral glycosphingolipids; growth regulation
鞘糖脂是细胞表面糖萼(glycocalyx)的主要成分之一， 它们不仅在细胞的社会行为中具有重要意义，而且对细胞的增殖、分化、代谢等功能具有调控作用[1]。目前国内外这方面的研究多集中于神经节苷脂上[2]，且运用的糖脂大多从牛脑中分离纯化，我们在对人脑胶质瘤中性鞘糖脂的研究中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂(Globoside)表达为主，而CDH在胶质瘤组织中表达较强，为了了解正常及肿瘤相关鞘糖脂对肿瘤细胞的生长调控作用，本实验观察了正常脑组织红细胞糖苷脂及脑胶质瘤CDH对胶质瘤细胞株生长的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
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SWO–38人脑星形胶质瘤细胞株[3]，购自暨南大学医学院病理教研室，本室传代培养。正常人脑组织(脑灰质)(取自因意外事故非疾病死亡之尸体，取标本时间距死亡<1 h)。手术切除标本，经病理证实为星型胶质细胞瘤Ⅲ～Ⅳ级。
1.2 主要实验试剂
RPMI-1640培养液：美国Gibco公司。胎牛血清：国产，55℃灭活30 min，分装，-20℃冷冻备用。中性糖脂抽提剂：甲醇、氯仿、醋酸钠为国产AR级试剂。高效薄层层析板(Gilica gel 60 HPTLC plates)：德国E Merck公司。硅胶H：国产。丙酮，乙酸异戊酯，锇酸等常规试剂为国产分析纯试剂。
1.3 实验方法
1.3.1 组织中性糖脂的提取(按改良的Hakomori的方法[4]) (1)标本的预处理：分别取上述正常脑及胶质瘤组织各20 g，以pH7.4，0.01 mol PBS液清洗，去除血污及坏死组织，剪碎匀浆后，置-80℃冰箱备用。(2)总脂的提取：已制备的标本分别用20倍体积的氯仿：甲醇液在磁力搅拌下抽提总脂30 min，滤纸过滤，残渣再以同样的方法抽提30 min，共抽提3次，最后一次在4℃下过夜(氯仿:甲醇的体积比分别为2:1、1:1、1:2)。合并3次滤液于(45±3)℃下在旋转蒸发仪中减压蒸发。干燥物用少量氯仿:甲醇(1:1 V/V)溶解备用(-20℃)。(3)DEAE-Sephadex-A25柱层析：提取的总脂以氯仿、甲醇和水溶解，调整三者比例至30:60:8 V/V/V(A液)。称取2.2 g DEAE-Sephadex-A25以30 ml氯仿、甲醇和0.8 mol/L醋酸钠(NaAc) 溶解，调整三者比例至30:60:8 V/V/V(B液)振摇30 min。自然沉淀后弃上清，如此重复3次，最后一次于4℃下过夜。次日再以A液洗3次，方法同前。最后悬于20 ml A液中装柱(2.0 cm×20 cm)，再以A液60 ml洗柱以除去残留的NaAc。含总脂的A液沿已装好填料的柱壁缓慢上柱，速度为0.5 ml/min，装柱后过夜，让总脂与层析柱有充分的时间反应，然后以80 ml A液洗脱，速度为2 ml/min。收集洗脱液，于(45±3)℃下在旋转蒸发仪中减压蒸发，即为中性糖脂粗提物。(4) Florisil 柱层析： Florisil硅胶经用A液处理后上柱， 再将中性糖脂粗提物悬于80 ml 液中，按0.5 ml/min速度上样。洗脱液经减压蒸发后即得纯化中性鞘糖脂。溶于1:1 氯仿:甲醇液中，-20℃保存备用。
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1.3.2 正常人脑红细胞糖苷脂和脑胶质瘤CDH单一成分的分离 纯化中性鞘糖脂以1:1氯仿/甲醇溶液溶解，拌硅胶H(10～40 U)加压柱层析，用不同浓度氯仿/甲醇梯度洗脱，分管收集，于TLC板点样检测，60: 35: 8氯仿/甲醇/水展开，碘显色，并与人O型血红细胞膜中性鞘糖脂比较，TLC板上红细胞糖苷脂、CDH均为一个斑点，Rf值分别为0.45、0.70，减压蒸干得到白色固体，-20℃保存备用。
1.3.3 SWO-38细胞中性糖脂的分析 收集体外培养的SWO-38细胞1×108，按上述方法提取中性糖脂，以红细胞膜的中性鞘糖脂为标准品， 将提取的糖脂标本按10μl/条的量点样于高效薄层层析上HPTLC板上，吹干。然后置于已用展开剂平衡2 h的层析缸中上行展开，至板上沿约1 cm时停止。展开剂为氯仿: 甲醇:水( 60:35:8 V/V/V)，新鲜配制。展开完成后冷风吹干，二苯胺喷雾显色。
1.3.4 SWO-38细胞的培养 传代SWO-38细胞接种在含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中， 培养在含有95%空气和5%二氧化碳(CO2)的37℃培养箱中；红细胞糖苷脂及CDH各44μg，加入完全培养基2 ml中，超声乳化，抽滤除菌，备用；SWO-38细胞以1X108/L浓度接种于直径为2.5 cm的玻璃培养皿中， 培养基中含22 mg/L的红细胞糖苷脂或CDH，2%FCS，培养48 h后行扫描电镜观察。
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1.3.5扫描电镜观察 倒弃培养皿中的培养液，以pH7.4，0.1 mol/L的PBS 液轻轻漂洗附着于培养皿的细胞3次；加入2.5%戊二醛固定1 h；在倒置显微镜下观察后，用玻璃刀割出附着细胞较多的培养皿玻璃底板以PBS 液再清洗2遍以洗除残余的戊二醛；丙酮系列(50%、70%、90%、100%、100%、100%)各1次，每次脱水5～6 min；100%醋酸异戊酯中置换30 min；临界点干燥后，在普通生物显微镜下，将样品观察面向上贴在标本台上；离子喷涂，观察，摄影。
2 结果
2.1 红细胞糖苷脂及CDH的纯化
经柱层析法纯化的红细胞糖苷脂及CDH，HPTLC分析显示达到了层析纯，由上述方法可以得到层析纯的红细胞糖苷脂及CDH以用于细胞调控实验(图1)。
2.2 胶质瘤细胞株 SWO–38中性糖脂的表达
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中性糖脂的各组分CMH、CDH、 CTH、红细胞糖苷脂在SWO–38细胞均有表达(图2)。
2.3 红细胞糖苷脂可抑制胶质瘤细胞突起的形成
经正常人脑红细胞糖苷脂(22 m g/ml)处理后的细胞其突起变短或消失， 细胞表面变得较为光滑，细胞聚集，说明红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成。肿瘤相关CDH对胶质瘤细胞的突起形成无影响用胶质瘤高表达的CDH(22 m g/ml)，同样处理SWO-38细胞后，细胞形态无明显变化，细胞仍然单个生长，不发生聚集(图3)。
图1 从人脑中提取、纯化的红细胞糖苷脂及CDHFig.1 Globoside and CDH extracted from normal human brain. Lane 1: marker, N-GSLs from the membrane of human type O RBC; Lane 2: CDH；Lane 3: Globoside
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图2 胶质瘤细胞SWO-38中性糖脂的高效薄层层析图
Fig.2 The HPTLC of N-GSLs from SWO-38 cells. Lane 1: marker; Lane 2: N-GSLs from SWO-38 cells
图3 红细胞糖苷脂和CDH作用胶质瘤细胞SWO-38后的扫描电镜结果
Fig.3 The results of scanning electron microscope of SWO-38 cells treated by globoside and CDH. A. Control cells´ 800；B. Control cells´ 3 200；C. Cells treated with globoside 22mg/L for 48 hours.×800; D. Cells treated with globoside 22mg/L for 48 hours.×2 000; E. Cells treated with CDH 22mg/L for 48 hours.×900; F. Cells treated with CDH 22 mg/L for 48 hours.×2 000
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3 讨论
恶性转化细胞及肿瘤细胞的生长失控，浸润转移等特性，与细胞表面的复合糖成分在性质或数量上的异常有关。鞘糖脂在肿瘤生长调控中的作用已有不少文献报道，外源性的神经节苷脂对肿瘤细胞的调控作用也已有较广泛的研究。研究表明[2]，神经节苷脂可以抑制正常及恶性细胞的生长，其机理未完全阐明，但节苷脂可以抑制受脂质刺激的自身磷酸化、抑制血小板生长因子受体及表皮生长因子受体的二聚体的形成，二及三唾液酸的节苷脂较单唾液酸的节苷脂抑制作用更强，失去1 b系列的节苷脂可能是低分化肿瘤迅速生长的原因[5]。这些研究因肿瘤的异质性、肿瘤细胞抗原的隐蔽性等原因，均未发现特异性抑制胶质瘤细胞恶性增殖及浸润转移的因子，在中性糖脂方面研究更少。我们在实验中已发现正常人脑组织以红细胞糖苷脂表达为主，而CDH、CTH在胶质瘤组织中表达较强，这在胶质瘤恶性增殖中有何意义呢？本实验研究了红细胞糖苷脂及CDH对胶质瘤细胞SWO–38生长的影响。
, 百拇医药 由于鞘糖脂与肿瘤细胞的“社会行为”(即浸润、转移)关系密切[1]，而肿瘤细胞表面结构是其执行“社会行为”的物质基础，本实验在电镜下观察了鞘糖脂对肿瘤细胞表面结构的影响。
本实验发现胶质瘤细胞株SWO-38表达中性糖脂的各组分， 经正常人脑高表达的红细胞糖苷脂 22 mg/L处理后，发现其细胞形态发生变化，其细胞表面的突起变短或消失，细胞聚集，而用胶质瘤高表达的CDH (22 mg/L)，同样处理SWO-38细胞后，细胞形态无明显变化，细胞仍然单个生长，不发生聚集。结果表明外源性地加入正常人脑 红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤突起的形成，而CDH无此作用。
红细胞糖苷脂抑制胶质瘤轴突形成的机理还有待进一步的实验探索，但由 红细胞糖苷脂所引起的细胞的聚集似乎与突起形成抑制有关。可能有以下几种因素参与抑制作用：(1)碳水化合物与碳水化合物之间的相互作用参与了细胞与细胞间的相互接触、细胞间的通讯等，细胞表面糖脂积聚，导致产生了细胞间的接触性抑制，红细胞糖苷脂糖链结构较CDH复杂，糖链较长，因而可能产生红细胞糖苷脂有抑制作用而CDH缺乏。(2)细胞膜上的糖脂，可能与细胞生长因子受体的功能有关[85]，加入外源性正常结构的红细胞糖苷脂后，可能影响胶质瘤细胞膜上生长因子受体功能，使胶质瘤细胞的有丝分裂信号阻断，从而抑制其生长及分化。(3)鞘糖脂在生理情况下一般含量较低，在含量丰富的脑灰质中才有千分之几[6]，本实验中红细胞糖苷脂的浓度远远超过生理状态，这可能是胶质瘤患者其周围正常脑组织红细胞糖苷脂对瘤组织的生长缺乏抑制作用，而本实验中出现抑制作用的原因之一。
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肿瘤细胞表面的突起，如微绒毛等与肿瘤细胞的粘附、浸润、转移等相关。红细胞糖苷脂抑制胶质瘤生长有一定的意义：脑胶质瘤的浸润及术后复发使得其愈后欠佳，近20余年的研究也未取得突破性进展，故寻找和发现新的脑胶质瘤生长抑制因子便成为近年来国内外研究的热点。但目前的重点在于抑制基因及抑制蛋白，在鞘糖脂方面也偏重于神经节苷脂，本研究从中性糖脂角度，发现红细胞糖苷脂可以抑制胶质瘤细胞突起的形成，有可能发现一种新的脑胶质瘤生长抑制因子，为胶质瘤细胞恶性增殖机理的研究开辟一个新的途径。
国家自然科学基金资助(39700143)
参考文献
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1998-12-22, http://www.100md.com