实验性急性出血性胰腺炎犬血中肽类物质在急性呼吸窘迫综合症中的意义
作者：杜传福 张兵 贾顺兴
单位：杜传福(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)；张兵(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)；贾顺兴(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)
关键词：肽类物质；肺泡表面活性物质；急性呼吸窘迫综合征；膜天平
第一军医大学学报000112 摘要：目的 研究急性出血性胰腺炎状态下血中肽类物质对肺泡表面活性物质表面活性的影响。方法 将实验性犬急性出血性胰腺炎时血中分离出的肽类物质加入到大鼠支气管肺泡灌洗液中，应用膜天平测定了灌洗液中表面物质的表面活性变化。结果 急性出血性胰腺炎状态下犬血中的肽类物质可使肺泡灌洗液的表面活性发生明显的抑制作用，表现为最小表面张力显著增加，恢复系数和稳定系数显著减小。结论 胰腺炎状态下犬血中的肽类物质能显著抑制肺泡表面物质的表面活性，并由此导致急性呼吸窘迫综合症的发生和恶化。
, 百拇医药
中图分类号：Q571; Q461 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0036-03
The inhibiting role of the peptides released in acute experimental hemorrhage pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant
DU Chuan-fu, ZHANG Bing, JIA Shun-xing
(Huiqiao Building, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract：Objective To investigate the role of the peptides released in acute experimental hemorrhagic pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant. Method We seperated the peptides from the plasma of acute experimental hemorrhagic pancreatitis dogs using the Sephadex G-25 chromatography and then using the Whihelmy Film Banlance to test its effects to the activity of pulmonary surfactant in the rats’ bronchoalveolar lavage. Result We found that the peptides released in the hemorrhagic pancretitis could inhibit the activity of pulmonary surfactant severely and extensively, but the peptides of control group showed no significant inhibiting effects. Conclusion It suggests that the peptides released in acute hemorrhagic pancreatitis may play a very important role in the development of acute respiratory distress syndrome by inhibiting the activity of pulmonary surfactant.
, 百拇医药
Key words: peptide; pulmonary surfactant; acute respiratory distress syndrome; Whihelmy film balance
急性出血性胰腺炎病人早期死亡的主要原因是并发了急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)。近年来国外陆续出现了用清除血液中肽类物质治疗ARDS并取得了良好效果的报道[1]，因此，肽类物质在急性胰腺炎致急性呼吸窘迫综合征中的作用引起了广泛的关注。本文研究了分离出的实验性急性出血性胰腺炎犬血中的肽类物质对大鼠肺泡灌注液中表面活性物质(pulmonary surfactant.PS)表面活性的影响，旨在了解这些肽类物质在胰腺炎致ARDS发病中的作用。
1 材料和方法
1.1动物模型
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参照李少华等[2]犬胰腺炎模型。健康成年杂种子狗12条，雌雄不拘，体质量10～13 kg，随机分为实验组(n=6)和假手术组(n=6)，在无菌条件下开腹，以30 cm左右水柱压力向主胰管内注射自身胆汁1 ml/kg体质量；假手术组以同样条件向胰管内注入生理盐水。术后12 h腹主动脉插管放血，全血迅速离心分离血浆，即置 20℃低温冰箱保存备用。
1.2 血浆肽类物质分离
采用葡聚糖凝胶分离法。制备型层析柱(150×4.5 cm)为自制。柱子经洗涤、干燥并硅化后充填Sephadex G-25(Pharmacia))约250 g，血浆上柱后用XZ-85-1型核酸蛋白检测仪(温州鹿城化仪器厂)在254 nm 波长下检测记录。血浆上柱后用0.02 mol/L氯化钠溶液洗脱。可洗脱个4波峰，其中第二峰即为含肽类物质的峰,收集后精确分装，低温冷冻干燥备用。
1.3 大鼠肺泡灌洗液的提取
, 百拇医药
取SD大鼠3只，雌雄不拘，体质量300～320 g，用20%乌拉坦0.6/Kg腹腔注射麻醉，腹主动脉放血处死，打开胸腔，暴露双肺和心脏，右心房内插管，一定压力下用生理盐水冲洗直到双肺变白，心室流出液清亮透明。完整摘取大鼠肺及气管，用塑料管插入气管并结扎固定，反复用生理盐水灌洗，得到肺泡灌洗液精确分装后，随机分为三组：胰腺炎组(n=20)每管加入相当于2.5 ml胰腺炎犬血浆量的肽类干粉；正常犬组(n=20)，每管中加入2.5 ml正常犬血量的肽类干粉；对照组(n)不加作任何物质，各组放入37℃水浴30 min后取出加入膜天平中测量表面活性。
1.4 样品的表面活性物质活性测定
采用由第二军医大学研制的M-8601型膜天平(改良的Wihlelmyml 膜天平)测定[3]。在膜天平液槽中加入生理盐水430 ml，将水浴过的灌洗液样品均匀地加在盐水表面，使之成为一层均匀的单分子膜，天平中的液体温度控制在于(25±0.5)℃。样品吸附平衡1 h后开动滑尺，使液面上PS表面膜在最大面积(400 cm2)和最小面积(80 cm2)之间作连续变动。液面表面张力的改变由传感器转变为电信号，经放大后输入计算机，滑尺移动一个来回后，通过计算机算出液面的最大表面张力(γmax)、最小表面张力(γmin)、迟滞环面积(Hysteresis Area, Harea)、恢复系数(Recruitment Index, RI)和稳定系数(Stablity Index, SI)等。
, 百拇医药
1.5 统计方法
所有数据均用
±s表示，n为样本数。组间对照用Student-t检验。
2 结果
结果显示，空白对照组和正常犬组成相比，各指标无明显差别，而胰腺炎组动物血中的肽类物质能使大鼠支气管肺泡灌洗液表面活性物质的最小表面张力极显著增加(P<0.01)，使恢复系数和稳定系数极显著减小(P<0.01，表1)。
表1 胰腺炎犬血浆中肽类物质对大鼠支气管肺泡灌洗液表面活性物质表面活性的影响
Tab.1 Effects of the peptides released in acute experimental hemorrhagic pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant
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Control group
(n=20)
Normal dog group
(n=20)
Pancreatitis dog group
C(n=20)
Max(mN/m)
53.1±1.6
54.7±1.1
54.1±1.3
γmin(mN/m)
, 百拇医药
22.3±1.0
21.4±1.6
23.6±0.8**
Harea
493.4±91.7
448.3±57.3
490.1±59.3
RI
2.6±1.2
3.0±0.01
2.3±0.1**
, 百拇医药
SI
0.9±0.04
0.9±0.04
0.8±0.02**
**P<0.01 vs normal dog group
3 讨论
3.1急性胰腺炎时，血中的肽类物质主要有两个来源, 一是胰腺炎过程中大量释放高活性的胰蛋白酶，使部分组织蛋白和血浆蛋白降解产生肽类物质；二是胰腺炎时体内补体系统被激活,使体内产生大量肽类物质。有报道认为这些肽类物质既有直接的细胞毒作用[4]，又可以通过增高肺微血管张力，提高肺动脉压力、激活血栓片断引发肺微血栓的形成，引起肺微循环和淋巴动力障碍，从而直接或间接地导致ARDS的发生。但肽类物质对肺PS表面活性的影响尚未见到报道。
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3.2 3.2 用膜平测得的γmax、γmin、Harea、RI和SI等指标可以判断PS的表面活性, 其中,γmin是指PS单分子表面膜压缩到最小时的表面张力，它反映了PS降低表面张力的能力，PS活性越高，γmin就越低。PS的最主要功能就是降低肺泡表面张力，因此，γmin是反映PS活性最重要的指标。SI反映的是PS单分子表面膜压缩时的表面特性，SI=2(γmax –γmin)/(γmaxγ+minγmax)，式中γmax是单分子膜在压缩前最大面积时的表面张力。从式中看出，SI与表面张力的下降幅度成正比，与平均表面张力成反比，它反映了PS单分子表面膜在压缩时的稳定性，同时也反映了PS降低表面张力的能力，即SI值越小，PS活性越差，RI则反映了PS单分子表面膜扩张时的表面特性，RI=(γmin +△γ)/γmin，式中△γ表示PS表面膜扩展最初5%面积时表面张力的上升值。RI是表征PS迟滞性的指标。所谓PS的迟滞性是指PS单分子表面膜扩展时的表面张力大于压缩时相应面积的表面张力。PS的迟滞性有助于肺吸气相、尤其是吸气早期肺泡的恢复和稳定。PS 的迟滞性越明显，RI的值就越大。
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肺损伤发生时，由于肺血管的通透性增强，血中很多物质得以进入肺泡从而对肺泡表面活性物质发生作用。作者应用膜天平测定肽类物质对肺泡灌洗液中PS表面活性的影响实际上就是模拟这一过程。本研究发现，和正常犬相比，胰腺炎状态下犬血中的肽类物质可以使鼠肺泡灌洗液的γmin明显增大，使RI和SI明显缩小，提示胰腺炎状态下动物血中的肽类物质对PS活性有明显的抑制作用，而正常犬的肽类物质对PS表面活性无显著影响，说明急性胰腺炎是血中的肽类物质组分发生了变化，这些肽类进入肺泡后能抑制肺泡PS的表面活性，而表面活性的下降又可使肺泡萎陷，使全肺发生广泛肺不张，肺泡弥散功能发生障碍，从而发生顽固性的难以纠正的低氧血症。因此，推测应用清除血中肽类物质的方法缓解晚期ARDS的可能机制在于肽类物质的清除使患者受肽类物质抑制的肺PS活性恢复正常，肺泡不张减轻，缺氧改善并由此引起全身状况的好转。
参考文献
[1]Gotloib L, Eitan B, Avshalom S et al. Sequential hemofiltration in nonoligurii high capillary permeability pulmonary edema of severe sepsis:preliminary report[J]. Crit Care Med, 1984, 12(11):997～1000.
, http://www.100md.com
[2]李少华，吴中立. 狗急性胰腺炎早期血管紧张素转化酶的变化与肺损伤的关系[J]. 中国病理生理杂志，1986, 2(1):156～64.
[3]刘明耀，张亚霏. 研究肺表面活性物质表面特性的膜天平的研制与应用[J]. 中国生物医学工程学报，1988, 7(3):148～50.
[4]Belyakov N, Obolensky S, Malakgova M et al. Lung injury and endogenous intoxication: Interrelation and sorption detoxication capacity[J]. Biomater Artif Cells Artif Organs, 1987, 15(3):595～7.
1999-01-22, 百拇医药
单位：杜传福(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)；张兵(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)；贾顺兴(第一军医大学南方医院惠侨科，广东 广州 510515)
关键词：肽类物质；肺泡表面活性物质；急性呼吸窘迫综合征；膜天平
第一军医大学学报000112 摘要：目的 研究急性出血性胰腺炎状态下血中肽类物质对肺泡表面活性物质表面活性的影响。方法 将实验性犬急性出血性胰腺炎时血中分离出的肽类物质加入到大鼠支气管肺泡灌洗液中，应用膜天平测定了灌洗液中表面物质的表面活性变化。结果 急性出血性胰腺炎状态下犬血中的肽类物质可使肺泡灌洗液的表面活性发生明显的抑制作用，表现为最小表面张力显著增加，恢复系数和稳定系数显著减小。结论 胰腺炎状态下犬血中的肽类物质能显著抑制肺泡表面物质的表面活性，并由此导致急性呼吸窘迫综合症的发生和恶化。
, 百拇医药
中图分类号：Q571; Q461 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0036-03
The inhibiting role of the peptides released in acute experimental hemorrhage pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant
DU Chuan-fu, ZHANG Bing, JIA Shun-xing
(Huiqiao Building, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract：Objective To investigate the role of the peptides released in acute experimental hemorrhagic pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant. Method We seperated the peptides from the plasma of acute experimental hemorrhagic pancreatitis dogs using the Sephadex G-25 chromatography and then using the Whihelmy Film Banlance to test its effects to the activity of pulmonary surfactant in the rats’ bronchoalveolar lavage. Result We found that the peptides released in the hemorrhagic pancretitis could inhibit the activity of pulmonary surfactant severely and extensively, but the peptides of control group showed no significant inhibiting effects. Conclusion It suggests that the peptides released in acute hemorrhagic pancreatitis may play a very important role in the development of acute respiratory distress syndrome by inhibiting the activity of pulmonary surfactant.
, 百拇医药
Key words: peptide; pulmonary surfactant; acute respiratory distress syndrome; Whihelmy film balance
急性出血性胰腺炎病人早期死亡的主要原因是并发了急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)。近年来国外陆续出现了用清除血液中肽类物质治疗ARDS并取得了良好效果的报道[1]，因此，肽类物质在急性胰腺炎致急性呼吸窘迫综合征中的作用引起了广泛的关注。本文研究了分离出的实验性急性出血性胰腺炎犬血中的肽类物质对大鼠肺泡灌注液中表面活性物质(pulmonary surfactant.PS)表面活性的影响，旨在了解这些肽类物质在胰腺炎致ARDS发病中的作用。
1 材料和方法
1.1动物模型
, http://www.100md.com
参照李少华等[2]犬胰腺炎模型。健康成年杂种子狗12条，雌雄不拘，体质量10～13 kg，随机分为实验组(n=6)和假手术组(n=6)，在无菌条件下开腹，以30 cm左右水柱压力向主胰管内注射自身胆汁1 ml/kg体质量；假手术组以同样条件向胰管内注入生理盐水。术后12 h腹主动脉插管放血，全血迅速离心分离血浆，即置 20℃低温冰箱保存备用。
1.2 血浆肽类物质分离
采用葡聚糖凝胶分离法。制备型层析柱(150×4.5 cm)为自制。柱子经洗涤、干燥并硅化后充填Sephadex G-25(Pharmacia))约250 g，血浆上柱后用XZ-85-1型核酸蛋白检测仪(温州鹿城化仪器厂)在254 nm 波长下检测记录。血浆上柱后用0.02 mol/L氯化钠溶液洗脱。可洗脱个4波峰，其中第二峰即为含肽类物质的峰,收集后精确分装，低温冷冻干燥备用。
1.3 大鼠肺泡灌洗液的提取
, 百拇医药
取SD大鼠3只，雌雄不拘，体质量300～320 g，用20%乌拉坦0.6/Kg腹腔注射麻醉，腹主动脉放血处死，打开胸腔，暴露双肺和心脏，右心房内插管，一定压力下用生理盐水冲洗直到双肺变白，心室流出液清亮透明。完整摘取大鼠肺及气管，用塑料管插入气管并结扎固定，反复用生理盐水灌洗，得到肺泡灌洗液精确分装后，随机分为三组：胰腺炎组(n=20)每管加入相当于2.5 ml胰腺炎犬血浆量的肽类干粉；正常犬组(n=20)，每管中加入2.5 ml正常犬血量的肽类干粉；对照组(n)不加作任何物质，各组放入37℃水浴30 min后取出加入膜天平中测量表面活性。
1.4 样品的表面活性物质活性测定
采用由第二军医大学研制的M-8601型膜天平(改良的Wihlelmyml 膜天平)测定[3]。在膜天平液槽中加入生理盐水430 ml，将水浴过的灌洗液样品均匀地加在盐水表面，使之成为一层均匀的单分子膜，天平中的液体温度控制在于(25±0.5)℃。样品吸附平衡1 h后开动滑尺，使液面上PS表面膜在最大面积(400 cm2)和最小面积(80 cm2)之间作连续变动。液面表面张力的改变由传感器转变为电信号，经放大后输入计算机，滑尺移动一个来回后，通过计算机算出液面的最大表面张力(γmax)、最小表面张力(γmin)、迟滞环面积(Hysteresis Area, Harea)、恢复系数(Recruitment Index, RI)和稳定系数(Stablity Index, SI)等。
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1.5 统计方法
所有数据均用
±s表示，n为样本数。组间对照用Student-t检验。2 结果
结果显示，空白对照组和正常犬组成相比，各指标无明显差别，而胰腺炎组动物血中的肽类物质能使大鼠支气管肺泡灌洗液表面活性物质的最小表面张力极显著增加(P<0.01)，使恢复系数和稳定系数极显著减小(P<0.01，表1)。
表1 胰腺炎犬血浆中肽类物质对大鼠支气管肺泡灌洗液表面活性物质表面活性的影响
Tab.1 Effects of the peptides released in acute experimental hemorrhagic pancreatitis in dogs to the activity of pulmonary surfactant
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Control group
(n=20)
Normal dog group
(n=20)
Pancreatitis dog group
C(n=20)
Max(mN/m)
53.1±1.6
54.7±1.1
54.1±1.3
γmin(mN/m)
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22.3±1.0
21.4±1.6
23.6±0.8**
Harea
493.4±91.7
448.3±57.3
490.1±59.3
RI
2.6±1.2
3.0±0.01
2.3±0.1**
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SI
0.9±0.04
0.9±0.04
0.8±0.02**
**P<0.01 vs normal dog group
3 讨论
3.1急性胰腺炎时，血中的肽类物质主要有两个来源, 一是胰腺炎过程中大量释放高活性的胰蛋白酶，使部分组织蛋白和血浆蛋白降解产生肽类物质；二是胰腺炎时体内补体系统被激活,使体内产生大量肽类物质。有报道认为这些肽类物质既有直接的细胞毒作用[4]，又可以通过增高肺微血管张力，提高肺动脉压力、激活血栓片断引发肺微血栓的形成，引起肺微循环和淋巴动力障碍，从而直接或间接地导致ARDS的发生。但肽类物质对肺PS表面活性的影响尚未见到报道。
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3.2 3.2 用膜平测得的γmax、γmin、Harea、RI和SI等指标可以判断PS的表面活性, 其中,γmin是指PS单分子表面膜压缩到最小时的表面张力，它反映了PS降低表面张力的能力，PS活性越高，γmin就越低。PS的最主要功能就是降低肺泡表面张力，因此，γmin是反映PS活性最重要的指标。SI反映的是PS单分子表面膜压缩时的表面特性，SI=2(γmax –γmin)/(γmaxγ+minγmax)，式中γmax是单分子膜在压缩前最大面积时的表面张力。从式中看出，SI与表面张力的下降幅度成正比，与平均表面张力成反比，它反映了PS单分子表面膜在压缩时的稳定性，同时也反映了PS降低表面张力的能力，即SI值越小，PS活性越差，RI则反映了PS单分子表面膜扩张时的表面特性，RI=(γmin +△γ)/γmin，式中△γ表示PS表面膜扩展最初5%面积时表面张力的上升值。RI是表征PS迟滞性的指标。所谓PS的迟滞性是指PS单分子表面膜扩展时的表面张力大于压缩时相应面积的表面张力。PS的迟滞性有助于肺吸气相、尤其是吸气早期肺泡的恢复和稳定。PS 的迟滞性越明显，RI的值就越大。
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肺损伤发生时，由于肺血管的通透性增强，血中很多物质得以进入肺泡从而对肺泡表面活性物质发生作用。作者应用膜天平测定肽类物质对肺泡灌洗液中PS表面活性的影响实际上就是模拟这一过程。本研究发现，和正常犬相比，胰腺炎状态下犬血中的肽类物质可以使鼠肺泡灌洗液的γmin明显增大，使RI和SI明显缩小，提示胰腺炎状态下动物血中的肽类物质对PS活性有明显的抑制作用，而正常犬的肽类物质对PS表面活性无显著影响，说明急性胰腺炎是血中的肽类物质组分发生了变化，这些肽类进入肺泡后能抑制肺泡PS的表面活性，而表面活性的下降又可使肺泡萎陷，使全肺发生广泛肺不张，肺泡弥散功能发生障碍，从而发生顽固性的难以纠正的低氧血症。因此，推测应用清除血中肽类物质的方法缓解晚期ARDS的可能机制在于肽类物质的清除使患者受肽类物质抑制的肺PS活性恢复正常，肺泡不张减轻，缺氧改善并由此引起全身状况的好转。
参考文献
[1]Gotloib L, Eitan B, Avshalom S et al. Sequential hemofiltration in nonoligurii high capillary permeability pulmonary edema of severe sepsis:preliminary report[J]. Crit Care Med, 1984, 12(11):997～1000.
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[2]李少华，吴中立. 狗急性胰腺炎早期血管紧张素转化酶的变化与肺损伤的关系[J]. 中国病理生理杂志，1986, 2(1):156～64.
[3]刘明耀，张亚霏. 研究肺表面活性物质表面特性的膜天平的研制与应用[J]. 中国生物医学工程学报，1988, 7(3):148～50.
[4]Belyakov N, Obolensky S, Malakgova M et al. Lung injury and endogenous intoxication: Interrelation and sorption detoxication capacity[J]. Biomater Artif Cells Artif Organs, 1987, 15(3):595～7.
1999-01-22, 百拇医药