骨巨细胞瘤瘤组织中M-CSF、TNF-α的检测及其意义
作者:姚俊霞 文剑明 钟思陶 谢丹 张萌
单位:姚俊霞(中山医科大学病理学教研室 广州 510089 现地址为:湖北省十堰市郧阳医学院病理学教研室);文剑明(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);钟思陶(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);谢丹(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);张萌(中山医科大学病理学教研室 广州 510089)
关键词:骨肿瘤;骨巨细胞瘤;肿瘤坏死因子;巨噬细胞克隆刺激因子
中国现代医学杂志000109目的:探讨细胞因子与骨巨细胞瘤局部溶骨的关系。方法:通过ELISA法、Western blot法和免疫组化法对10例骨巨细胞瘤、5例骨肉瘤和5例正常人血清进行了TNF-α和M-CSF表达及定位检测。结果:骨巨细胞瘤组织TNF-α含量和M-CSF表达率明显高于骨肉瘤和正常人血清。TNF-α由骨巨细胞的部分单核基质细胞和多核巨细胞分泌;而M-CSF由部分单核基质细胞分泌,多核巨细胞则不表达。结论:骨巨细胞瘤中各种细胞分泌不同的细胞因子可能参与该肿瘤的局部骨质吸收。
, 百拇医药
分类号:R738.1▲
骨巨细胞瘤是一种具潜在恶性的良性骨肿瘤,局部主要表现为溶骨性损害,其溶骨机制尚不清楚。目前比较肯定参与骨吸收的细胞因子有肿瘤坏死因子(TNF)、克隆刺激因子(CSF)和白细胞介素1(IL-1)。本文通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白印迹(Western blot)法和免疫组化方法,对骨巨细胞瘤组织中的TNF-α、巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)的表达进行检测,并从形态上证明这些细胞因子的存在部位,从而探讨其在骨巨细胞瘤溶骨机制中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
骨巨细胞瘤10例、骨肉瘤5例取自骨外科手术切除的肿瘤组织。正常人血清5例,取自正常人静脉血。
1.2 组织匀浆上清液
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取瘤组织1~3 g,用Hank's液洗3次,剪碎,按2 ml/g组织的比例加入生理盐水,用玻璃匀浆器匀浆。匀浆液低温超速离心(4℃,1 300 r/min,15 min)后吸取上清用于实验。
1.3 组织匀浆TNF-α的ELISA法
试剂盒由军事科学院邦定公司生产。于反应孔中加入不同含量的标准TNF-α和组织匀浆上清(100μl/孔),以PBS作空白对照。同一试样加2孔作平衡。37℃孵育1h。加辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG,37℃温育1h。洗板3次后加OPD显色。在酶标仪上测定波长为490mm的OD值。根据校正曲线查得各样本TNF-α的含量。同样检测样本的蛋白含量。TNF-α的含量以ng/g蛋白表示。
1.4 组织匀浆M-CSF的Western blot法
将组织匀浆上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。再通过电泳将凝胶上的样本转印到硝酸纤维膜上。加入抗M-CSF(Genzyme)进行孵育,然后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG温育,最后用DAB显色。当硝酸纤维素膜上出现棕色谱带时终止显色。
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1.5 冰冻切片和免疫组化法
取新鲜肿瘤组织,低温恒冷切片,厚约4μm,冷丙酮固定,BPS洗涤。加非特异血清封闭10min,分别加入抗TNF-α和抗M-CSF抗体,孵育30min,依次加入二抗三抗,DAB显色。
2 结果
2.1 骨巨细胞瘤、骨肉瘤、正常血清中TNF-α含量比较
用ELISA方法检测10例骨巨细胞瘤、5例骨肉瘤组织匀浆上清液、5例正常血清中TNF-α的含量,结果显示,骨巨细胞瘤中TNF-α含量明显高于骨肉瘤及正常血清;骨肉瘤中TNF-α含量也明显高于正常血清,经统计学两样本均数的t检验,各组之间均有显著性意义(表1)。
表1 骨巨细胞瘤TNF-α含量及比较(±s) 样 本
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例 数
TNF-α(ng/g蛋白)
骨巨细胞瘤
10
9.58±3.731)
骨肉瘤
5
6.46±2.342)
正常血清
5
2.47±0.84
注:1)与骨肉瘤比较,P<0.05;与正常血清比较,P<0.01
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2)与正常血清比较,P<0.01
2.2 骨巨细胞瘤、骨肉瘤、正常血清中M-CSF比较
用Western blot法分析肿瘤组织匀浆(其中骨巨细胞瘤10例、骨肉瘤5例)和正常血清(5例)中的M-CSF,结果见表2。阳性者在硝酸纤维膜上出现棕色谱带,分子量约为40kd,符合M-CSF的分子量。
表2 骨巨细胞瘤M-CSF检测结果(Western blot法) 样 本
总例数
阳性例数
阴性例数
骨巨细胞瘤
10
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8
2
骨肉瘤
5
2
3
正常血清
5
2
3
2.3 骨巨细胞瘤TNF-α和M-CSF免疫组化结果
采用免疫组化法,对8例骨巨细胞瘤冰冻切片进行TNF-α和M-CSF检测,结果分级如下:阴性(-),所有肿瘤细胞胞膜和胞浆均不着色;可疑阳性(±),仅个别的细胞出现阳性;阳性(+):1%~25%细胞阳性;++:26%~50%细胞阳性;+++:51%~75%细胞阳性;++++:76%~100%细胞阳性。
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结果显示(表3),各例骨巨细胞瘤TNF-α和M-CSF均呈阳性反应(+~+++)。在细胞内呈现棕黄色颗粒状结构。TNF-α的阳性反应见于部分单核基质细胞胞膜和胞浆,偶见核阳性,而多核巨细胞则以核阳性为主,部分胞膜也呈阳性反应。M-CSF的阳性反应主要见于单核基质细胞的胞膜和部分细胞胞浆,多核巨细胞为阴性反应。表3 8例骨巨细胞瘤免疫组化结果 抗 体
单核细胞
多核巨细胞
-
±
+
++
+++~++++
-
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±
+
++
+++~++++
TNF-α
0
0
6
2
0
0
0
4
3
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1
M-CSF
0
0
2
5
1
5
3
0
0
0
3 讨论
由巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子命名为TNF-α。事实上,除激活的单核-巨噬细胞外,在肿瘤促进剂十四酰佛波乙酸酯(PMA)或IL-2等刺激因素存在下,多种细胞均能产生TNF-α[1]。本实验用免疫组化染色,观察到骨巨细胞瘤中部分单核基质细胞和部分多核巨细胞表达TNF-α(+~++)。Kito等人报道,在来源于人的骨巨细胞瘤株的培养上清液中,用Western blot分析法检测到TNF-α的存在[2]。我们进一步用ELISA法证实了骨巨细胞瘤组织匀浆中的TNF-α含量明显高于骨肉瘤组织和正常血清,说明骨巨细胞瘤细胞能表达高水平的TNF-α。而且,表达TNF-α的多核巨噬细胞可能是由表达TNF-α的单核巨噬细胞样细胞融合而成,在融合后仍保持TNF-α的分泌现象。
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目前认为,TNF-α能刺激纤维母细胞的增殖。骨巨细胞瘤中的梭型基质细胞表型类似结缔组织中的纤维母细胞,故称为纤维母细胞样基质细胞。骨巨细胞瘤局部形成的高浓度TNF-α,促进了纤维母细胞样基质细胞的增生。我们最近的研究结果证明骨巨细胞瘤中不但多核巨细胞,纤维母细胞样基质细胞也有骨质吸收能力,而且,外源性TNF-α的加入能明显促进基质细胞的骨吸收能力[3]。TNF-α还能使破骨细胞骨吸收的能力提高2~3倍[4]。此外,局部TNF-α浓度的增加,还可通过其它途径抑制骨质形成,促进局部的溶骨。如刺激前列腺素E2(PGE-2)产生,抑制胶原、骨钙素合成以及抑制1,25(OH)2VitD3刺激碱性磷酸酶活性[5]。当TNF-α达到一定浓度时,可通过增加破骨细胞的数量和减少骨质钙化,使胎鼠骨的骨质吸收增加。
本文的结果还表明,骨巨细胞瘤部分的单核基质细胞表达M-CSF,而多核巨细胞未见阳性反应。用Western blot法检测M-CSF,10例骨巨细胞瘤的组织匀浆样本中8例阳性,证实骨巨细胞瘤能分泌M-CSF。M-CSF能促进长期骨髓培养中的多核巨细胞的形成[6],并通过或作用于分化较低的单核基质细胞,使其增生和向巨噬细胞样基质细胞转变和融合为多核巨细胞,活化多核巨细胞刺激骨质吸收[7]。
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综上所述,骨巨细胞瘤各种细胞可分泌不同的细胞因子,互相作用,共同参与局部的骨质吸收,使该肿瘤成为以溶骨为主要表现的骨肿瘤。当然,骨巨细胞瘤中的细胞成分还可能分泌一些物质如胶原酶[8]和尿激酶型纤溶酶原激活物[9]等,直接或间接参与溶骨过程。■
参考文献:
[1]Shalaby MR,Aggarwal BB,Rinderknecht E,et al.Activation of human polymorphonuclear neutrophil functions by interferon-γ and tumor necrosis factors.J Immunol,1985;135:2069
[2]Kito M,Moriya H,Mikata A,et al.Establishment of a cell line from a human giant cell tumor of bone.Clin Orthop,1993;294:353~360
, http://www.100md.com
[3]谢 丹,文剑明,林汉良,等.骨巨细胞瘤细胞成分和细胞因子在溶骨中的作用.中山医科大学学报,1998;19:197~200
[4]Thomson BM,Mundy GR,Chambers TJ,et al.Tumor necrosis factor α and β induce osteoblastic cells to stimulate osteoclastic bone resorption.J Immunol,1987;138:775~779
[5]Contrella M,MeCarthy TL,Canalis E,et al.Tumor necrosis factor-α inhibits collagen synthesis and alkaline phosphatase activity independently of its effect on deoxyribonucleic acid synthesis in osteoblast-enriched bone cell cultures.Endocrinology,1988;123:1442
, 百拇医药
[6]MacDonald BR,Mundy GR,Clark S,et al.Effects of human recombinant CSF-GM and highly purified CSF-1 on the formation of multinucleated cells with osteoclast characteristics in long-term bone marrow cultures.J Bone Miner Res,1986;1:227~233
[7]Yang S,Zhang Y,Rodriguiz RM,et al.Functions of the M-CSF receptor on osteoclasts. Bone,1996;18:355~360
[8]Sasaguri Y,Komiya S,Sugama K,et al.Production of matrix metalloproteinases 2 and 3 (stromelysin) by stromal cells of giant cell tumor of bone. Am J Pathol,1992;141:611~621
[9]Zheng MH,Fan Y,Panicker A,et al.Detection of mRNAs for urokinase-type plasminogen activator,its receptor,and type 1 inhibitor in giant cell tumors of bone with in situ hybridization.Am J Pathol,1995;147:1559~1566
程瑞雪审稿 申海菊编辑
1999-01-20收稿, 百拇医药
单位:姚俊霞(中山医科大学病理学教研室 广州 510089 现地址为:湖北省十堰市郧阳医学院病理学教研室);文剑明(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);钟思陶(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);谢丹(中山医科大学病理学教研室 广州 510089);张萌(中山医科大学病理学教研室 广州 510089)
关键词:骨肿瘤;骨巨细胞瘤;肿瘤坏死因子;巨噬细胞克隆刺激因子
中国现代医学杂志000109目的:探讨细胞因子与骨巨细胞瘤局部溶骨的关系。方法:通过ELISA法、Western blot法和免疫组化法对10例骨巨细胞瘤、5例骨肉瘤和5例正常人血清进行了TNF-α和M-CSF表达及定位检测。结果:骨巨细胞瘤组织TNF-α含量和M-CSF表达率明显高于骨肉瘤和正常人血清。TNF-α由骨巨细胞的部分单核基质细胞和多核巨细胞分泌;而M-CSF由部分单核基质细胞分泌,多核巨细胞则不表达。结论:骨巨细胞瘤中各种细胞分泌不同的细胞因子可能参与该肿瘤的局部骨质吸收。
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分类号:R738.1▲
骨巨细胞瘤是一种具潜在恶性的良性骨肿瘤,局部主要表现为溶骨性损害,其溶骨机制尚不清楚。目前比较肯定参与骨吸收的细胞因子有肿瘤坏死因子(TNF)、克隆刺激因子(CSF)和白细胞介素1(IL-1)。本文通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白印迹(Western blot)法和免疫组化方法,对骨巨细胞瘤组织中的TNF-α、巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)的表达进行检测,并从形态上证明这些细胞因子的存在部位,从而探讨其在骨巨细胞瘤溶骨机制中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
骨巨细胞瘤10例、骨肉瘤5例取自骨外科手术切除的肿瘤组织。正常人血清5例,取自正常人静脉血。
1.2 组织匀浆上清液
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取瘤组织1~3 g,用Hank's液洗3次,剪碎,按2 ml/g组织的比例加入生理盐水,用玻璃匀浆器匀浆。匀浆液低温超速离心(4℃,1 300 r/min,15 min)后吸取上清用于实验。
1.3 组织匀浆TNF-α的ELISA法
试剂盒由军事科学院邦定公司生产。于反应孔中加入不同含量的标准TNF-α和组织匀浆上清(100μl/孔),以PBS作空白对照。同一试样加2孔作平衡。37℃孵育1h。加辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG,37℃温育1h。洗板3次后加OPD显色。在酶标仪上测定波长为490mm的OD值。根据校正曲线查得各样本TNF-α的含量。同样检测样本的蛋白含量。TNF-α的含量以ng/g蛋白表示。
1.4 组织匀浆M-CSF的Western blot法
将组织匀浆上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。再通过电泳将凝胶上的样本转印到硝酸纤维膜上。加入抗M-CSF(Genzyme)进行孵育,然后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG温育,最后用DAB显色。当硝酸纤维素膜上出现棕色谱带时终止显色。
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1.5 冰冻切片和免疫组化法
取新鲜肿瘤组织,低温恒冷切片,厚约4μm,冷丙酮固定,BPS洗涤。加非特异血清封闭10min,分别加入抗TNF-α和抗M-CSF抗体,孵育30min,依次加入二抗三抗,DAB显色。
2 结果
2.1 骨巨细胞瘤、骨肉瘤、正常血清中TNF-α含量比较
用ELISA方法检测10例骨巨细胞瘤、5例骨肉瘤组织匀浆上清液、5例正常血清中TNF-α的含量,结果显示,骨巨细胞瘤中TNF-α含量明显高于骨肉瘤及正常血清;骨肉瘤中TNF-α含量也明显高于正常血清,经统计学两样本均数的t检验,各组之间均有显著性意义(表1)。
表1 骨巨细胞瘤TNF-α含量及比较(±s) 样 本
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例 数
TNF-α(ng/g蛋白)
骨巨细胞瘤
10
9.58±3.731)
骨肉瘤
5
6.46±2.342)
正常血清
5
2.47±0.84
注:1)与骨肉瘤比较,P<0.05;与正常血清比较,P<0.01
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2)与正常血清比较,P<0.01
2.2 骨巨细胞瘤、骨肉瘤、正常血清中M-CSF比较
用Western blot法分析肿瘤组织匀浆(其中骨巨细胞瘤10例、骨肉瘤5例)和正常血清(5例)中的M-CSF,结果见表2。阳性者在硝酸纤维膜上出现棕色谱带,分子量约为40kd,符合M-CSF的分子量。
表2 骨巨细胞瘤M-CSF检测结果(Western blot法) 样 本
总例数
阳性例数
阴性例数
骨巨细胞瘤
10
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8
2
骨肉瘤
5
2
3
正常血清
5
2
3
2.3 骨巨细胞瘤TNF-α和M-CSF免疫组化结果
采用免疫组化法,对8例骨巨细胞瘤冰冻切片进行TNF-α和M-CSF检测,结果分级如下:阴性(-),所有肿瘤细胞胞膜和胞浆均不着色;可疑阳性(±),仅个别的细胞出现阳性;阳性(+):1%~25%细胞阳性;++:26%~50%细胞阳性;+++:51%~75%细胞阳性;++++:76%~100%细胞阳性。
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结果显示(表3),各例骨巨细胞瘤TNF-α和M-CSF均呈阳性反应(+~+++)。在细胞内呈现棕黄色颗粒状结构。TNF-α的阳性反应见于部分单核基质细胞胞膜和胞浆,偶见核阳性,而多核巨细胞则以核阳性为主,部分胞膜也呈阳性反应。M-CSF的阳性反应主要见于单核基质细胞的胞膜和部分细胞胞浆,多核巨细胞为阴性反应。表3 8例骨巨细胞瘤免疫组化结果 抗 体
单核细胞
多核巨细胞
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3 讨论
由巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子命名为TNF-α。事实上,除激活的单核-巨噬细胞外,在肿瘤促进剂十四酰佛波乙酸酯(PMA)或IL-2等刺激因素存在下,多种细胞均能产生TNF-α[1]。本实验用免疫组化染色,观察到骨巨细胞瘤中部分单核基质细胞和部分多核巨细胞表达TNF-α(+~++)。Kito等人报道,在来源于人的骨巨细胞瘤株的培养上清液中,用Western blot分析法检测到TNF-α的存在[2]。我们进一步用ELISA法证实了骨巨细胞瘤组织匀浆中的TNF-α含量明显高于骨肉瘤组织和正常血清,说明骨巨细胞瘤细胞能表达高水平的TNF-α。而且,表达TNF-α的多核巨噬细胞可能是由表达TNF-α的单核巨噬细胞样细胞融合而成,在融合后仍保持TNF-α的分泌现象。
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目前认为,TNF-α能刺激纤维母细胞的增殖。骨巨细胞瘤中的梭型基质细胞表型类似结缔组织中的纤维母细胞,故称为纤维母细胞样基质细胞。骨巨细胞瘤局部形成的高浓度TNF-α,促进了纤维母细胞样基质细胞的增生。我们最近的研究结果证明骨巨细胞瘤中不但多核巨细胞,纤维母细胞样基质细胞也有骨质吸收能力,而且,外源性TNF-α的加入能明显促进基质细胞的骨吸收能力[3]。TNF-α还能使破骨细胞骨吸收的能力提高2~3倍[4]。此外,局部TNF-α浓度的增加,还可通过其它途径抑制骨质形成,促进局部的溶骨。如刺激前列腺素E2(PGE-2)产生,抑制胶原、骨钙素合成以及抑制1,25(OH)2VitD3刺激碱性磷酸酶活性[5]。当TNF-α达到一定浓度时,可通过增加破骨细胞的数量和减少骨质钙化,使胎鼠骨的骨质吸收增加。
本文的结果还表明,骨巨细胞瘤部分的单核基质细胞表达M-CSF,而多核巨细胞未见阳性反应。用Western blot法检测M-CSF,10例骨巨细胞瘤的组织匀浆样本中8例阳性,证实骨巨细胞瘤能分泌M-CSF。M-CSF能促进长期骨髓培养中的多核巨细胞的形成[6],并通过或作用于分化较低的单核基质细胞,使其增生和向巨噬细胞样基质细胞转变和融合为多核巨细胞,活化多核巨细胞刺激骨质吸收[7]。
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综上所述,骨巨细胞瘤各种细胞可分泌不同的细胞因子,互相作用,共同参与局部的骨质吸收,使该肿瘤成为以溶骨为主要表现的骨肿瘤。当然,骨巨细胞瘤中的细胞成分还可能分泌一些物质如胶原酶[8]和尿激酶型纤溶酶原激活物[9]等,直接或间接参与溶骨过程。■
参考文献:
[1]Shalaby MR,Aggarwal BB,Rinderknecht E,et al.Activation of human polymorphonuclear neutrophil functions by interferon-γ and tumor necrosis factors.J Immunol,1985;135:2069
[2]Kito M,Moriya H,Mikata A,et al.Establishment of a cell line from a human giant cell tumor of bone.Clin Orthop,1993;294:353~360
, http://www.100md.com
[3]谢 丹,文剑明,林汉良,等.骨巨细胞瘤细胞成分和细胞因子在溶骨中的作用.中山医科大学学报,1998;19:197~200
[4]Thomson BM,Mundy GR,Chambers TJ,et al.Tumor necrosis factor α and β induce osteoblastic cells to stimulate osteoclastic bone resorption.J Immunol,1987;138:775~779
[5]Contrella M,MeCarthy TL,Canalis E,et al.Tumor necrosis factor-α inhibits collagen synthesis and alkaline phosphatase activity independently of its effect on deoxyribonucleic acid synthesis in osteoblast-enriched bone cell cultures.Endocrinology,1988;123:1442
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[6]MacDonald BR,Mundy GR,Clark S,et al.Effects of human recombinant CSF-GM and highly purified CSF-1 on the formation of multinucleated cells with osteoclast characteristics in long-term bone marrow cultures.J Bone Miner Res,1986;1:227~233
[7]Yang S,Zhang Y,Rodriguiz RM,et al.Functions of the M-CSF receptor on osteoclasts. Bone,1996;18:355~360
[8]Sasaguri Y,Komiya S,Sugama K,et al.Production of matrix metalloproteinases 2 and 3 (stromelysin) by stromal cells of giant cell tumor of bone. Am J Pathol,1992;141:611~621
[9]Zheng MH,Fan Y,Panicker A,et al.Detection of mRNAs for urokinase-type plasminogen activator,its receptor,and type 1 inhibitor in giant cell tumors of bone with in situ hybridization.Am J Pathol,1995;147:1559~1566
程瑞雪审稿 申海菊编辑
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