免疫组化检测转基因内皮细胞tPA基因的表达
作者：刘鹏 韩琴琴 宋后燕 杨英珍
单位：刘鹏(上海医科大学中山医院心内科 200032)；韩琴琴(上海医科大学中山医院心内科 200032)；宋后燕(上海医科大学中山医院心内科 200032 上海医科大学基础医学院分子遗传 研究院)；杨英珍(上海医科大学中山医院心内科 200032)
关键词：免疫组织化学；组织型纤溶酶原激活剂；内皮细胞；基因表达
中国现代医学杂志000124分类号：R392▲
从新生小牛的胸主动脉分离血管内皮细胞，经形态学和Ⅷ因子相关抗原免疫染色鉴定，将其培养至一定数量；使用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，通过病毒包装细胞，将人tPA(组织型纤溶酶原激活剂)cDNA导入内皮细胞中，分别用纤维蛋白板法和发色底物法检测到转基因内皮细胞的tPA分泌活性[1]。为了对内皮细胞的转基因模型进行更深入地研究，我们又利用免疫组化染色测定了转基因内皮细胞tPA基因的表达。
, 百拇医药
1 材料及方法
1.1 材料
实验使用的人tPA cDNA片段长1.689Kb,连接在质粒pUC18两端的HindⅢ酶切位点上。逆转录病毒载体LNSX由美国德州大学馈赠，PA317病毒包装细胞由上海市肿瘤研究所提供。
1.2 内皮细胞培养及基因转移
参见文献[1]。实验采用第3代的牛血管内皮细胞。
1.3 免疫组织化学检测
使用PAP法：转基因的内皮细胞和未转基因的正常内皮细胞在胰酶消化后，分别放入约1cm2消毒好的小载玻片，37℃培养48h，待细胞长满后取出，凉干并用PBS洗5min；3.7%多聚甲醛固定10min，0.3%过氧化氢甲醇37℃作用30min；0.1%TritonX 100消化10min，PBS洗3次，每次5 min；加1%牛血清白蛋白，37℃孵育30min；加入1∶100稀释的兔抗人tPA多克隆抗体(效价1∶16)，置于湿盒中4℃过夜；PBS洗3次，每次5min，加入1∶100稀释羊抗兔IgG，37℃反应1h；加入兔PAP复合物，37℃作用1h；PBS洗过之后，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片；镜下观察染色结果，拍照后进行图像分析，数据值用灰度表示。同时设立阴性对照，以PBS代替人tPA抗血清。
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2 结果
正常对照的内皮细胞和转基因内皮细胞均为贴壁生长，透明呈大多角形。细胞汇合后聚积为致密单层，呈典型的“铺路石”样排列。免疫组化染色显示，转基因内皮细胞和未转基因的正常内皮细胞均为胞浆着色。所不同的是，在相同染色条件下，前者阳性指数明显增加。经图像分析，转基因内皮细胞的平均灰度为63，正常内皮细胞为50，二者差异具有显著性(P<0.01)。
3 讨论
tPA是一各主要由血管内皮细胞分泌合成的丝氨酸蛋白酶，它能激活纤溶酶原形成纤溶酶，使不溶的纤维蛋白水解，是体内重要的生理溶栓剂[2]。利用基因操作技术，将外源的tPA基因导入哺乳动物内皮细胞中，使之表达出生物活性较原先高得多的基因产物，以弥补内源性tPA的产生不足，对防止血栓性疾病的发生有重要意义[3]
免疫组织化学属于定性的形态学观察方法，将染色结果进行图像扫描，可以用作半定量分析。为了避免非特异染色，它要求实验组和对照组细胞必须处在完全相同的反应条件下操作。本研究发现，正常对照的内皮细胞和转基因的内皮细胞均为胞浆着色，但后者的阳性数明显增高；因而证实人tPA cDNA已正确导入牛的内皮细胞中。将人类内皮细胞的转基因模型应用于血管支架上，再植入冠状动脉腔内，将对冠心病及再狭窄的治疗和预防有重要临床价值。■
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参考文献：
[1]刘 鹏，彭鲁英，韩琴琴，等.转基因内皮细胞tPA纤溶活性的变化.上海医科大学学报，1997；24(6)：450
[2]Dichek DA,Neville RF,Zwiebel JA,et al.Seeding of imtravascular stents with genetically engineered endothelial cells.Crirculation 1989;80:1347
[3]Zwiebel JA,Freemana SM,Kantoff PW,et al.High level recombinant gene expression in rabbit endothelial cells transduced by retroviral vectors.Science 1989;243:220
孙明审稿 黄其伟编辑
1999-01-22收稿, 百拇医药
单位：刘鹏(上海医科大学中山医院心内科 200032)；韩琴琴(上海医科大学中山医院心内科 200032)；宋后燕(上海医科大学中山医院心内科 200032 上海医科大学基础医学院分子遗传 研究院)；杨英珍(上海医科大学中山医院心内科 200032)
关键词：免疫组织化学；组织型纤溶酶原激活剂；内皮细胞；基因表达
中国现代医学杂志000124分类号：R392▲
从新生小牛的胸主动脉分离血管内皮细胞，经形态学和Ⅷ因子相关抗原免疫染色鉴定，将其培养至一定数量；使用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，通过病毒包装细胞，将人tPA(组织型纤溶酶原激活剂)cDNA导入内皮细胞中，分别用纤维蛋白板法和发色底物法检测到转基因内皮细胞的tPA分泌活性[1]。为了对内皮细胞的转基因模型进行更深入地研究，我们又利用免疫组化染色测定了转基因内皮细胞tPA基因的表达。
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1 材料及方法
1.1 材料
实验使用的人tPA cDNA片段长1.689Kb,连接在质粒pUC18两端的HindⅢ酶切位点上。逆转录病毒载体LNSX由美国德州大学馈赠，PA317病毒包装细胞由上海市肿瘤研究所提供。
1.2 内皮细胞培养及基因转移
参见文献[1]。实验采用第3代的牛血管内皮细胞。
1.3 免疫组织化学检测
使用PAP法：转基因的内皮细胞和未转基因的正常内皮细胞在胰酶消化后，分别放入约1cm2消毒好的小载玻片，37℃培养48h，待细胞长满后取出，凉干并用PBS洗5min；3.7%多聚甲醛固定10min，0.3%过氧化氢甲醇37℃作用30min；0.1%TritonX 100消化10min，PBS洗3次，每次5 min；加1%牛血清白蛋白，37℃孵育30min；加入1∶100稀释的兔抗人tPA多克隆抗体(效价1∶16)，置于湿盒中4℃过夜；PBS洗3次，每次5min，加入1∶100稀释羊抗兔IgG，37℃反应1h；加入兔PAP复合物，37℃作用1h；PBS洗过之后，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片；镜下观察染色结果，拍照后进行图像分析，数据值用灰度表示。同时设立阴性对照，以PBS代替人tPA抗血清。
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2 结果
正常对照的内皮细胞和转基因内皮细胞均为贴壁生长，透明呈大多角形。细胞汇合后聚积为致密单层，呈典型的“铺路石”样排列。免疫组化染色显示，转基因内皮细胞和未转基因的正常内皮细胞均为胞浆着色。所不同的是，在相同染色条件下，前者阳性指数明显增加。经图像分析，转基因内皮细胞的平均灰度为63，正常内皮细胞为50，二者差异具有显著性(P<0.01)。
3 讨论
tPA是一各主要由血管内皮细胞分泌合成的丝氨酸蛋白酶，它能激活纤溶酶原形成纤溶酶，使不溶的纤维蛋白水解，是体内重要的生理溶栓剂[2]。利用基因操作技术，将外源的tPA基因导入哺乳动物内皮细胞中，使之表达出生物活性较原先高得多的基因产物，以弥补内源性tPA的产生不足，对防止血栓性疾病的发生有重要意义[3]
免疫组织化学属于定性的形态学观察方法，将染色结果进行图像扫描，可以用作半定量分析。为了避免非特异染色，它要求实验组和对照组细胞必须处在完全相同的反应条件下操作。本研究发现，正常对照的内皮细胞和转基因的内皮细胞均为胞浆着色，但后者的阳性数明显增高；因而证实人tPA cDNA已正确导入牛的内皮细胞中。将人类内皮细胞的转基因模型应用于血管支架上，再植入冠状动脉腔内，将对冠心病及再狭窄的治疗和预防有重要临床价值。■
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参考文献：
[1]刘 鹏，彭鲁英，韩琴琴，等.转基因内皮细胞tPA纤溶活性的变化.上海医科大学学报，1997；24(6)：450
[2]Dichek DA,Neville RF,Zwiebel JA,et al.Seeding of imtravascular stents with genetically engineered endothelial cells.Crirculation 1989;80:1347
[3]Zwiebel JA,Freemana SM,Kantoff PW,et al.High level recombinant gene expression in rabbit endothelial cells transduced by retroviral vectors.Science 1989;243:220
孙明审稿 黄其伟编辑
1999-01-22收稿, 百拇医药