p16基因突变及表达与喉癌的相关性研究
作者：沈伟 戴泓 郑颂国 罗建民 刘思良
单位：沈伟(上海市普陀中心医院耳鼻咽喉-头颈外科，上海 200062)；戴泓(上海医科大学市一临床医学院耳 鼻咽喉科，上海 200080)；刘思良(上海医科大学市一临床医学院耳 鼻咽喉科，上海 200080)；郑颂国(上海医科大学附属肿瘤医院分子生物学实验室，上海 200032)；罗建民(上海医科大学附属肿瘤医院分子生物学实验室，上海 200032)
关键词：喉癌；p16基因；p16蛋白；免疫组织化学；多聚酶链反应-单链构象多态性
现代诊断与治疗000106 摘 要：目的 研究p16基因在喉癌发生过程中的表达及在喉癌诊断中的应用价值。方法 采用特异合成引物对p16基因的有关外显子进行PCR扩增，结合单链构象多态性技术，检测29例喉癌手术标本中p16基因的突变，同时应用免疫组织化学方法观察其p16蛋白表达情况。结果 11/29的喉癌组织有p16基因第一、第二外显子的突变(P<0.05)，其中9/11发生于喉癌Ⅲ、Ⅳ期；7/9伴颈淋巴结转移有者第一、第二外显子突变(P<0.05)。免疫组织化学法结果显示临床Ⅲ、Ⅳ期喉癌p16蛋白表达明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，伴颈淋巴结转移组p16蛋白表达明显低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。结论 p16基因突变与喉癌的临床病程进展有关，在喉癌的诊断、判断预后及指导治疗上有重要意义。
, http://www.100md.com
分类号：R739.65 文献标识码：A
文章编号：1001-8174(2000)01-0016-03
Study on Correlation between the Mutation and Expression of p16 Gene and Laryneal Cancer
SHEN Wei
(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Shanghai P utuo Center Hospital,Shanghai 200060,China)
DAI Hong LIU Si-l iang
, http://www.100md.com (Department of Otolaryngology,The Fi rst Clinical Medical College of Shanghai Medical University,Shanghai 200080,China)
ZHENG Song-guo LUO Jian-min
(Laboratory of Molecular Biology,Tumor Hospital Affiliated to Shanghai Medica l University,Shanghai 200032,China)
Abstract：Objective To study p16 expression in genesis of larygeal cancer and its value in the diagnosis of laryngeal cancer.Met hod The mutation of p16 gene in laryngeal cancer cells was determined by PCR-SSCP method with silver staining technique.29 cases of specimens from pri mary laryngeal cancer were assayed by ABC immunohisto-chemical staining method.Results By using PCR-SSCP technique ,the mutations of exon 1- 2 in p16 gene in 11/29 laryngeal carcinoma 7/9 patients complicated with neck ly mph noeds metastasis,and 9/11 occurred on stage Ⅲ～Ⅳ.Conclusions The mutation of p16 gene is associated with the clinical progress of larynge al cancer.P16 might be a reliable marker for diagnosis prognosis and treatment g uide of laryngeal carcinoma.
, http://www.100md.com
Key words：Laryngeal carcinoma;p16 gene;p16 protein;immunohistoc hemistry;PCR-SSCP
1994年发现的p16基因又称多种肿瘤抑制因子1(Multipletumor suppressor 1,MTS1)基因或CDKN2基因，为肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21区，由2个内含子和3个外显子组成，能编码分子量为16KD的蛋白质。通过与CDK4-CDK6的特异性结合，参与细胞周期调控，抑制细胞的G1/S期转变[1，2]。由于CDK4是调节正常细胞生长的关键，p16基因的失活可导致细胞不可控制的生长并最终发生肿瘤。p16基因失活的机制主要包括基因的缺失、突变及异常甲基化[3～5]。我们采用免疫组化技术(Avidine-biotin complex,ABC法)和单链构象多态性-多聚酶链式反应(Single s traind conformation polymorphism-polymerase chain reaction,PCR-SSCP)方法对喉癌中p16基因突变和蛋白表达缺失情况进行综合研究，旨在探讨p16在喉癌发生与演进中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 临床病理资料 选择1996～1998年21例喉鳞状细胞癌病理存档蜡块标本，1998年喉癌切除术后半小时内置于低温冰箱中保存的新鲜喉癌组织标本8例，由上海医科大学市一临床医学院提供。其中男28例，女1例，年龄42～77(平均63)岁。声门上型3例，声门型17例，跨声门型9例。肿瘤临床分期按UICC-TNM(1987)标准分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期5例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例；其中伴颈淋巴结转移者9例，无颈淋巴结转移者20例。组织病理分级按Broder法分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其中Ⅰ级2例，Ⅱ级7例，Ⅲ级15例，Ⅳ级5例。
1.2 方法
1.2.1 亲和免疫组化法 p16蛋白多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，ABC试剂盒为Victor公司产品。4μm切片常规脱蜡至水，0.05%胰蛋白酶消化30分钟，PBS溶液洗涤后，分别滴加1∶100的p16多抗，置4℃冰箱过夜，次日用PBS洗涤后，滴加1∶200的生物素化二抗(DAKO公司产品)，45分钟后PBS洗涤，滴加1∶100的ABC试剂，1小时后在0.04%的DAB液中显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
, 百拇医药
1.2.2 DNA提取及PCR扩增 应用PCR热循环仪(PERKIN ELMER)，采用DNA裂解液和TaqDNA聚合酶(美国生命技术公司产品)，对所有标本进行DNA扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染得出阳性条带并分析其分子量，同时每例取同一病例非病灶部位的正常组织作对照。引物是根据已知的p16基因序列，在其第一、第二外显子的两端各设计一对扩增引物，其PCR扩增产物为420bp及218bp，引物序列如下：
SP1 5′-GGC TCT ACA CAA GCT TCC-3′，SP2 5′-TGA GCT TTG GAA GCT CTC-3′，SP1′ 5′-TAA GCT TTG GCT CTC GGC-3′，SP2′ 5′-TAC GGC AAC TCC TTG CTC-3′。
切7μm蜡膜7～8片置1.5ml离心管中，用二甲苯及无水酒精脱蜡后与新鲜冰冻标本一起经蛋白酶消化，56℃水育3小时后分次经等体积饱和酚、氯仿及80μl?3M醋酸钠溶解，再加无水乙醇过夜沉淀，离心后留沉淀物，经70%酒精清洗，加入10μl?TE液使DNA溶解，静置10分钟。
, 百拇医药
PCR扩增的反应体积为10μl，最后各加2滴灭菌液体石蜡。PCR的扩增条件是94℃预变性5分钟，然后94℃50秒，62℃50秒，72℃50秒，连续35个循环，末次循环延长5分钟后扩增产物加甲酰胺变性示踪液5μl。
1.2.3 SSCP银染分析 浇制8%聚丙烯酰胺凝胶板，取8μl扩增产物与2μl溴酚蓝载样液，混匀后加入凝胶梳孔，电泳电压200V，1个半小时取出后用10%酒精固定10秒，银染显示DNA条带。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因突变。
1.3 结果判断 喉正常组织的PCR产物为双链DNA，加热变性后可电泳分离成两条条带，而有突变的异常PCR产物则可分成3～4条条带，因为突变了的DNA分子有不同的构型，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动的速度与正常分子不同；同时，基因突变常常只发生在一条染色体上，而另一条保持正常，所以两条正常的带纹也还可见。
p16阳性染色大部分为细胞核染色，少数可见胞浆内染色，呈棕黄色颗粒，根据染色强度及阳性细胞数分为高表达和低表达，采用油镜(1000×)进行计数，任意取10个高倍视野，每例计数2000个细胞，计数时以最能反映增殖状态的p16阳性细胞集中区域为准。p16指数＝(p16阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。统计学方法采用χ2检验和t检验。
, 百拇医药
2 结果
12例癌旁正常粘膜，p16基因表达皆成两条带纹，29例喉癌组织中，p16表达成两条带纹者18例，占62.07%；表达成3～4条带纹者11例。p16蛋白高表达者10例，低表达者19例，见附表。
附表 p16基因表达与患者年龄、组织病理分级，临床分期
及颈淋巴结转移的关系
n
p16基因分析n
p16蛋白表达
指数(
±s)
P值
, 百拇医药
(+)
(-)
年龄(岁)
<60
10
6
4
51.09±10.41
>0.05
≥60
19
12
7
, 百拇医药
47.14±9.71
>0.05*
组织学分级
Ⅰ
2
2
0
56.81±13.22
Ⅱ
7
4
3
53.39±11.08
, 百拇医药
>0.05
Ⅲ
15
9
6
47.02±9.94
>0.05*
Ⅳ
5
3
2
42.66±14.39
临床分期
, 百拇医药
Ⅰ～Ⅱ
12
10
2
60.43±11.07
>0.05
Ⅲ～Ⅳ
17
8
9
48.33±7.20
>0.05*
颈淋巴结转移
, 百拇医药
有
9
2
7
49.64±10.45
>0.05
无
20
16
4
68.08±9.94
>0.05*
注：*为p16蛋白表达统计学P值。
, 百拇医药
我们将临床Ⅰ、Ⅱ期(12例)分为一组，将临床Ⅲ、Ⅳ期(17例)分为另一组，p16基因缺失前者为2/12，后者为9/17，经统计学分析有显著性差异(P<0.05)，提示临床Ⅲ、Ⅳ期喉癌p16基因缺失明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期；临床Ⅲ、Ⅳ期p16蛋白表达指数为60.43±11.07，明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)。说明p16基因缺失及p16蛋白低表达与喉癌临床进展密切相关。根据有无颈淋巴结转移，将所有病例分为两组进行讨论。发现有颈淋巴结转移组中p16基因缺失高达7/9，而无颈淋巴结转移组仅为4/20。经统计学分析有显著性差异(P<0.05)，结果显示喉癌有颈淋巴结转移组p16基因缺失明显高于无颈淋巴结转移组；同时发现有颈淋巴结转移组p16蛋白的明显高于无颈淋巴结转移组(P<0.05)，提示p16基因的缺失能反映喉癌的预后情况。研究中发现组织学Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间p16基因缺失及p16蛋白的表达无明显差异(P>0.05)，说明p16基因缺失与组织恶性程度无关，与患者的年龄亦无关(P>0.05)。
3 讨论
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鉴于肿瘤形成涉及到原癌和抑癌基因的遗传学变化，人们一直在试图寻找恶性肿瘤形成过程中的促进和抑制因素。自1986年发现第一个抑癌基因Rb以来，对抑癌基因的研究已成为肿瘤分子生物学的热点之一。过去几年中许多研究者将关于肿瘤抑制基因的注意力都集中于p16，证实p16基因的失活机制包括基因的缺失、突变及异常甲基化，但p16基因的改变在原发肿瘤中并不象在细胞系中那样普遍，而是具有一定的局限性，似乎与肿瘤的组织类型有关[6～8]，且同种类型程度不同的原发肿瘤中，p16基因的突变也不相同，国外已有文献报道多种肿瘤发生p16基因的高频突变而致其不能结合或抑制CDK4激酶活性[9]，提示其与肿瘤发生、发展有着密切关系。还有报道认为p16失活是肿瘤晚期基因突变的一个现象。
我们选择了p16基因的三个外显子中的第一及第二外显子作为扩增对象，因为第一、二外显子在三个外显子中分子量大，它们编码了整个p16蛋白97%以上。对我院1996年5月～1998年5月喉癌手术切除标本29例和12例喉旁正常粘膜组织，用分子生物学的单链构象多态性-多聚酶链式反应法(SSCP-PCR)进行了p16基因(DNA)检测，结果显示12例喉旁正常粘膜皆表达阳性，癌组织中正常表达者18例(62.07%)，异常表达者11例(37.93%)。同时将上述29例标本用免疫组化ABC法同步检测癌组织的p16蛋白表达情况，结果显示29例中阳性表达者仅12例，阴性表达者17例。对以上两种方法的结果都按年龄、组织学临床分期、有无颈淋巴结转移进行了分析，两者结果都显示p16基因突变及表达与病理分级无明显相关性，但都显示与临床分期及颈淋巴结转移相关，随着临床病程的进展，其缺失率逐渐升高，这样的结果提示p16基因的突变在喉癌的发生发展中是一个较晚期的行为，详细机制尚需进一步研究，这一结果与国外学者在食管癌、胆管癌等中的研究结果一致。由于p16基因失活与喉癌临床分期及颈淋巴结转移相关，因此p16基因状态检测可用来评估喉癌病人的预后。
, 百拇医药
p16基因较小，编码蛋白只有148个氨基酸残基，用p16基因做靶分子进行基因操作或蛋白修饰，均要比p53容易得多。因此，p16基因在肿瘤的基因诊断及治疗等临床方面具有更广阔的应用前景。
毕胜斌教授 审
作者简介：沈伟(1959-)，男，山西榆次人，上海市普陀区中心医院耳鼻咽喉-头颈外科副主任医师，1992～1996年赴法国巴黎大学、南特大学研修、工作，主要从事头颈肿瘤学的临床研究。
参考文献：
[1]Serrano M,Hannon GJ,Beach D,et al.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specitic inhibition of cyclin D/CDK4[J].Nature, 1993,366(3):704.
, 百拇医药
[2]Johns H,Tamura G,Nishizuka S,et al.Frequency of homozygous deletion at p16/CDKN2 in human tumours[J].Not-Genet,1995,11(2):210-212
[3]Nobori T,Miurak B,Wu DJ,et al.Deletions of the cyclin-dependent kin ast-4 inhibitor gene in multiple human cancers[J].Nature,1994,368(2):753-756 .
[4]Reed JA,Loganzo F,Joan JR,et al.Loss of expression of the p16 gene i n melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumour progression[J]. Cancer Res,1995,55(13):2713.
, 百拇医药
[5]Yeudall A,Crawford RY,Ensley JF,et al.Mutational analysis of CDKN2 (p16) in head and neck carcinomas[J].Cancinogenesis,1994,15(4):2683-2686.
[6]Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator pote ntially involved in genesis of many tumor types[J].Science,1994,264(6):436-43 9.
[7]Kees UR,Shevlin DW,Bartsch D,et al.Deletions of the p16 gene in pedi atric leukemia and corresponding cell lines[J].Oncogene,1996,12(10):2235-2239 .
, 百拇医药
[8]Huang L,Chu JJ,Hsu SL,et al.Deletion and mutation analysis of the p 16/MTS-1 in human ductal pancreatic cancer reveals a higher frequency of abnorm alities in tumor-derived cell lines than in primary ductal adenocarcinomas[J] .Cancer Res,1996,56(5):1137-1141.
[9]Shapiro GL,Kohe J,Kobzik L,et al.Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4 expression in primary lung cancers and cell lines[J].Cancer Res,1995,55 (3):505.
收稿日期：1999-08-23, 百拇医药
单位：沈伟(上海市普陀中心医院耳鼻咽喉-头颈外科，上海 200062)；戴泓(上海医科大学市一临床医学院耳 鼻咽喉科，上海 200080)；刘思良(上海医科大学市一临床医学院耳 鼻咽喉科，上海 200080)；郑颂国(上海医科大学附属肿瘤医院分子生物学实验室，上海 200032)；罗建民(上海医科大学附属肿瘤医院分子生物学实验室，上海 200032)
关键词：喉癌；p16基因；p16蛋白；免疫组织化学；多聚酶链反应-单链构象多态性
现代诊断与治疗000106 摘 要：目的 研究p16基因在喉癌发生过程中的表达及在喉癌诊断中的应用价值。方法 采用特异合成引物对p16基因的有关外显子进行PCR扩增，结合单链构象多态性技术，检测29例喉癌手术标本中p16基因的突变，同时应用免疫组织化学方法观察其p16蛋白表达情况。结果 11/29的喉癌组织有p16基因第一、第二外显子的突变(P<0.05)，其中9/11发生于喉癌Ⅲ、Ⅳ期；7/9伴颈淋巴结转移有者第一、第二外显子突变(P<0.05)。免疫组织化学法结果显示临床Ⅲ、Ⅳ期喉癌p16蛋白表达明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，伴颈淋巴结转移组p16蛋白表达明显低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。结论 p16基因突变与喉癌的临床病程进展有关，在喉癌的诊断、判断预后及指导治疗上有重要意义。
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分类号：R739.65 文献标识码：A
文章编号：1001-8174(2000)01-0016-03
Study on Correlation between the Mutation and Expression of p16 Gene and Laryneal Cancer
SHEN Wei
(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Shanghai P utuo Center Hospital,Shanghai 200060,China)
DAI Hong LIU Si-l iang
, http://www.100md.com (Department of Otolaryngology,The Fi rst Clinical Medical College of Shanghai Medical University,Shanghai 200080,China)
ZHENG Song-guo LUO Jian-min
(Laboratory of Molecular Biology,Tumor Hospital Affiliated to Shanghai Medica l University,Shanghai 200032,China)
Abstract：Objective To study p16 expression in genesis of larygeal cancer and its value in the diagnosis of laryngeal cancer.Met hod The mutation of p16 gene in laryngeal cancer cells was determined by PCR-SSCP method with silver staining technique.29 cases of specimens from pri mary laryngeal cancer were assayed by ABC immunohisto-chemical staining method.Results By using PCR-SSCP technique ,the mutations of exon 1- 2 in p16 gene in 11/29 laryngeal carcinoma 7/9 patients complicated with neck ly mph noeds metastasis,and 9/11 occurred on stage Ⅲ～Ⅳ.Conclusions The mutation of p16 gene is associated with the clinical progress of larynge al cancer.P16 might be a reliable marker for diagnosis prognosis and treatment g uide of laryngeal carcinoma.
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Key words：Laryngeal carcinoma;p16 gene;p16 protein;immunohistoc hemistry;PCR-SSCP
1994年发现的p16基因又称多种肿瘤抑制因子1(Multipletumor suppressor 1,MTS1)基因或CDKN2基因，为肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21区，由2个内含子和3个外显子组成，能编码分子量为16KD的蛋白质。通过与CDK4-CDK6的特异性结合，参与细胞周期调控，抑制细胞的G1/S期转变[1，2]。由于CDK4是调节正常细胞生长的关键，p16基因的失活可导致细胞不可控制的生长并最终发生肿瘤。p16基因失活的机制主要包括基因的缺失、突变及异常甲基化[3～5]。我们采用免疫组化技术(Avidine-biotin complex,ABC法)和单链构象多态性-多聚酶链式反应(Single s traind conformation polymorphism-polymerase chain reaction,PCR-SSCP)方法对喉癌中p16基因突变和蛋白表达缺失情况进行综合研究，旨在探讨p16在喉癌发生与演进中的作用。
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1 材料与方法
1.1 临床病理资料 选择1996～1998年21例喉鳞状细胞癌病理存档蜡块标本，1998年喉癌切除术后半小时内置于低温冰箱中保存的新鲜喉癌组织标本8例，由上海医科大学市一临床医学院提供。其中男28例，女1例，年龄42～77(平均63)岁。声门上型3例，声门型17例，跨声门型9例。肿瘤临床分期按UICC-TNM(1987)标准分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期5例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例；其中伴颈淋巴结转移者9例，无颈淋巴结转移者20例。组织病理分级按Broder法分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其中Ⅰ级2例，Ⅱ级7例，Ⅲ级15例，Ⅳ级5例。
1.2 方法
1.2.1 亲和免疫组化法 p16蛋白多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，ABC试剂盒为Victor公司产品。4μm切片常规脱蜡至水，0.05%胰蛋白酶消化30分钟，PBS溶液洗涤后，分别滴加1∶100的p16多抗，置4℃冰箱过夜，次日用PBS洗涤后，滴加1∶200的生物素化二抗(DAKO公司产品)，45分钟后PBS洗涤，滴加1∶100的ABC试剂，1小时后在0.04%的DAB液中显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
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1.2.2 DNA提取及PCR扩增 应用PCR热循环仪(PERKIN ELMER)，采用DNA裂解液和TaqDNA聚合酶(美国生命技术公司产品)，对所有标本进行DNA扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染得出阳性条带并分析其分子量，同时每例取同一病例非病灶部位的正常组织作对照。引物是根据已知的p16基因序列，在其第一、第二外显子的两端各设计一对扩增引物，其PCR扩增产物为420bp及218bp，引物序列如下：
SP1 5′-GGC TCT ACA CAA GCT TCC-3′，SP2 5′-TGA GCT TTG GAA GCT CTC-3′，SP1′ 5′-TAA GCT TTG GCT CTC GGC-3′，SP2′ 5′-TAC GGC AAC TCC TTG CTC-3′。
切7μm蜡膜7～8片置1.5ml离心管中，用二甲苯及无水酒精脱蜡后与新鲜冰冻标本一起经蛋白酶消化，56℃水育3小时后分次经等体积饱和酚、氯仿及80μl?3M醋酸钠溶解，再加无水乙醇过夜沉淀，离心后留沉淀物，经70%酒精清洗，加入10μl?TE液使DNA溶解，静置10分钟。
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PCR扩增的反应体积为10μl，最后各加2滴灭菌液体石蜡。PCR的扩增条件是94℃预变性5分钟，然后94℃50秒，62℃50秒，72℃50秒，连续35个循环，末次循环延长5分钟后扩增产物加甲酰胺变性示踪液5μl。
1.2.3 SSCP银染分析 浇制8%聚丙烯酰胺凝胶板，取8μl扩增产物与2μl溴酚蓝载样液，混匀后加入凝胶梳孔，电泳电压200V，1个半小时取出后用10%酒精固定10秒，银染显示DNA条带。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因突变。
1.3 结果判断 喉正常组织的PCR产物为双链DNA，加热变性后可电泳分离成两条条带，而有突变的异常PCR产物则可分成3～4条条带，因为突变了的DNA分子有不同的构型，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动的速度与正常分子不同；同时，基因突变常常只发生在一条染色体上，而另一条保持正常，所以两条正常的带纹也还可见。
p16阳性染色大部分为细胞核染色，少数可见胞浆内染色，呈棕黄色颗粒，根据染色强度及阳性细胞数分为高表达和低表达，采用油镜(1000×)进行计数，任意取10个高倍视野，每例计数2000个细胞，计数时以最能反映增殖状态的p16阳性细胞集中区域为准。p16指数＝(p16阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。统计学方法采用χ2检验和t检验。
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2 结果
12例癌旁正常粘膜，p16基因表达皆成两条带纹，29例喉癌组织中，p16表达成两条带纹者18例，占62.07%；表达成3～4条带纹者11例。p16蛋白高表达者10例，低表达者19例，见附表。
附表 p16基因表达与患者年龄、组织病理分级，临床分期
及颈淋巴结转移的关系
n
p16基因分析n
p16蛋白表达
指数(
±s)P值
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(+)
(-)
年龄(岁)
<60
10
6
4
51.09±10.41
>0.05
≥60
19
12
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47.14±9.71
>0.05*
组织学分级
Ⅰ
2
2
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56.81±13.22
Ⅱ
7
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>0.05
Ⅲ
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9
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>0.05*
Ⅳ
5
3
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临床分期
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Ⅰ～Ⅱ
12
10
2
60.43±11.07
>0.05
Ⅲ～Ⅳ
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>0.05*
颈淋巴结转移
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有
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>0.05
无
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>0.05*
注：*为p16蛋白表达统计学P值。
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我们将临床Ⅰ、Ⅱ期(12例)分为一组，将临床Ⅲ、Ⅳ期(17例)分为另一组，p16基因缺失前者为2/12，后者为9/17，经统计学分析有显著性差异(P<0.05)，提示临床Ⅲ、Ⅳ期喉癌p16基因缺失明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期；临床Ⅲ、Ⅳ期p16蛋白表达指数为60.43±11.07，明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)。说明p16基因缺失及p16蛋白低表达与喉癌临床进展密切相关。根据有无颈淋巴结转移，将所有病例分为两组进行讨论。发现有颈淋巴结转移组中p16基因缺失高达7/9，而无颈淋巴结转移组仅为4/20。经统计学分析有显著性差异(P<0.05)，结果显示喉癌有颈淋巴结转移组p16基因缺失明显高于无颈淋巴结转移组；同时发现有颈淋巴结转移组p16蛋白的明显高于无颈淋巴结转移组(P<0.05)，提示p16基因的缺失能反映喉癌的预后情况。研究中发现组织学Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间p16基因缺失及p16蛋白的表达无明显差异(P>0.05)，说明p16基因缺失与组织恶性程度无关，与患者的年龄亦无关(P>0.05)。
3 讨论
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鉴于肿瘤形成涉及到原癌和抑癌基因的遗传学变化，人们一直在试图寻找恶性肿瘤形成过程中的促进和抑制因素。自1986年发现第一个抑癌基因Rb以来，对抑癌基因的研究已成为肿瘤分子生物学的热点之一。过去几年中许多研究者将关于肿瘤抑制基因的注意力都集中于p16，证实p16基因的失活机制包括基因的缺失、突变及异常甲基化，但p16基因的改变在原发肿瘤中并不象在细胞系中那样普遍，而是具有一定的局限性，似乎与肿瘤的组织类型有关[6～8]，且同种类型程度不同的原发肿瘤中，p16基因的突变也不相同，国外已有文献报道多种肿瘤发生p16基因的高频突变而致其不能结合或抑制CDK4激酶活性[9]，提示其与肿瘤发生、发展有着密切关系。还有报道认为p16失活是肿瘤晚期基因突变的一个现象。
我们选择了p16基因的三个外显子中的第一及第二外显子作为扩增对象，因为第一、二外显子在三个外显子中分子量大，它们编码了整个p16蛋白97%以上。对我院1996年5月～1998年5月喉癌手术切除标本29例和12例喉旁正常粘膜组织，用分子生物学的单链构象多态性-多聚酶链式反应法(SSCP-PCR)进行了p16基因(DNA)检测，结果显示12例喉旁正常粘膜皆表达阳性，癌组织中正常表达者18例(62.07%)，异常表达者11例(37.93%)。同时将上述29例标本用免疫组化ABC法同步检测癌组织的p16蛋白表达情况，结果显示29例中阳性表达者仅12例，阴性表达者17例。对以上两种方法的结果都按年龄、组织学临床分期、有无颈淋巴结转移进行了分析，两者结果都显示p16基因突变及表达与病理分级无明显相关性，但都显示与临床分期及颈淋巴结转移相关，随着临床病程的进展，其缺失率逐渐升高，这样的结果提示p16基因的突变在喉癌的发生发展中是一个较晚期的行为，详细机制尚需进一步研究，这一结果与国外学者在食管癌、胆管癌等中的研究结果一致。由于p16基因失活与喉癌临床分期及颈淋巴结转移相关，因此p16基因状态检测可用来评估喉癌病人的预后。
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p16基因较小，编码蛋白只有148个氨基酸残基，用p16基因做靶分子进行基因操作或蛋白修饰，均要比p53容易得多。因此，p16基因在肿瘤的基因诊断及治疗等临床方面具有更广阔的应用前景。
毕胜斌教授 审
作者简介：沈伟(1959-)，男，山西榆次人，上海市普陀区中心医院耳鼻咽喉-头颈外科副主任医师，1992～1996年赴法国巴黎大学、南特大学研修、工作，主要从事头颈肿瘤学的临床研究。
参考文献：
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收稿日期：1999-08-23, 百拇医药