同源盒HOXA1基因在髓系白血病细胞内的表达
作者：王吉伟 田菁燕 陈汉春
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078
关键词：白血病，髓样；基因，同源盒；基因表达
湖南医学000102【摘 要】目的研究HOXA1基因在髓系白血病细胞内的表达及药物对其表达的影响。方法采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术，研究全反式维甲酸(ATRA)对HL-60细胞内同源盒HOXA1基因表达的影响。同时对9例髓系白血病患者的HOXA1基因表达进行了检测。结果①ATRA可上调HL-60细胞内HOXA1基因的表达。②所有受检白血病患者的HOXA1基因表达水平均比正常对照组高(P<0.01)。结论ATRA可能通过增强HOXA1基因表达使癌细胞朝良性细胞分化。
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【中图分类号】 R733.7 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)01-0003-02
Expression of Homeobox A1 Gene in Myeloid Leukemia Cells
WANG Jiwei TIAN Jingyan CHEN Hanchun
(Research Center of Molecular Biology,Hunan Medical University,Changsha 410078,China)
【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of homeobox A1 (HOXA1) gene in the myeloid leukemia cells and effects of a certain drug on their expression.MethodThe effects of all-trans retinoic acid(ATRA) on the HOXA1 expression in HL-60 cells were semi-quantitatively studied by using the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.Simaltaneously,the expression of HOXA1 gene was also detected in 9 patients with myeloid leukemia.ResultsThe expression of HOXA1 gene in HL-60 cells was upregulated by ATRA.The expression level of HL-60 cells in all the examined patients with leukemia was significantly higher than that in the normal control group (P<0.05).ConclusionThe cancer cells could be induced to differentiate into benign cells by ATRA through promoting the expression of HOXA1 gene.
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【Key word】 Leukemia,myeloid; gene expression; gene,homeo box
各种HOX基因统称为Ⅰ型同源盒基因，其编码蛋白质具有转录因子的功能。目前已发现，HOX基因可通过严格的“时空”表达协调造血细胞的分化[1]。通过鉴定造血细胞内HOX基因的表达种类，并进一步探讨它们与细胞恶变及药物治癌的关系，已逐渐成为相关领域的新热点。作者的前期研究已证实同源盒HOXA1基因在人髓系白血病细胞株HL-60细胞内表达[2]，为深入探讨HOXA1基因的功能，本文应用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术对HOXA1基因的表达进行了更进一步的研究。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及药物作用 HL-60细胞由湖南医科大学中心实验室提供。细胞培养方法、全反式维甲酸(ATRA)的配制及药物作用条件按文献[3]进行。
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1.2 临床标本的来源及处理 6例正常人外周血标本来源于血库献血员，9例白血病患者外周血均来自湘雅医院血液科门诊及住院病人。其中急性髓系白血病(AML)5例、慢性髓系白血病(CML)4例。所有患者均为初发病例。按常规方法分离单个核细胞，用Trizol○ R(美国Promega公司生产)试剂按操作说明提取总RNA后，置-70 ℃冰箱分装冻存。
1.3 半定量RT-PCR 逆转录及PCR的反应体系均用本室方法[2]。逆转录引物为Oligo(dT)15-18，用于PCR扩增的引物包括两对，其中一对为HOXA1基因扩增引物，有意链引物ATGAACTCCTTCCTGGAATA，反意链引物TCTGCTTCCTGATTTAACGC；内对照引物为β-actin基因引物，有意链引物ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，反意链引物CATCTCTTGCTCGAAGT-CCA。HOXA1基因的扩增条件为：94 ℃下变性30 s，56 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共进行35个循环。β-actin基因的PCR反应参数为：94 ℃下变性30 s，54 ℃下退火40 s，72 ℃下延伸40 s，共进行25个循环。
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1.4 扩增产物分析 取10 μl PCR产物用2%琼脂糖凝胶分离片段，用溴化乙锭(EB)染色后，紫外灯下观察并照相，光密度扫描仪扫描各区带的光密度值。通过比较同一样品HOXA1基因与β-actin基因的光密度比值，判断HOXA1基因的相对表达量。
2 结果
2.1 ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响 如附图所示，经ATRA作用后的HL-60细胞，HOXA1的表达明显增强，其表达的最高峰在ATRA作用36 h左右，但随着作用时间延长，HOXA1基因的表达水平明显回落。
附图 ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响
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2.2 白血病患者与对照组HOXA1基因的表达 6例献血员及9例白血病患者单核细胞均有HOXA1基因的表达。两组的表达均数分别为(0.362±0.096)及(0.687±0.162)，二者比较差异有显著性(t=19.8，P<0.01)。
3 讨论
HOX基因是一类首先在果蝇中发现的、进化高度保守的家族基因。到目前为止，已鉴定出39个人类HOX基因，并发现它们成簇分列于7，17，12，及2号染色体上[4]。HOX基因除了在胚胎发育中起重要的调节作用外，还在某些成人组织如造血细胞内表达，并受许多蛋白的调节。在白血病患者中，已发现了多种异常的同源盒基因[5]，同时转基因试验也证实，特定HOX基因的异常表达具有致瘤特性[6，7]。据此提出，同源盒基因在细胞的恶性转化和(或)肿瘤的演变中具有重要的作用。但目前尚不清楚特定癌变细胞中究竟表达哪些同源盒基因，以及这些基因在癌变中的作用。为此作者曾对人髓系白血病细胞株HL-60中的HOX基因进行了筛选，并从中鉴定出一个阳性克隆—HOXA1基因[2]。由于已知胚胎细胞内HOXA1基因的表达受ATRA的调节，故作者等利用半定量RT-PCR技术，尝试性地检测了ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响。结果表明，ATRA可诱导HOXA1基因的表达，呈现出一种上调后又下降的趋势。鉴于HOXA1基因在许多细胞(如人癌胚细胞株NT2/D1)中均能被ATRA诱导[8]，提示这种变化与细胞的种类无关，可能是ATRA诱导细胞分化的一个共同信号途径。进一步鉴定受HOXA1基因调节的靶基因，将有助于更好地理解ATRA的分子治癌机理。
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另外作者还发现HOXA1基因在15例被检临床标本中均有表达，其中9例粒系白血病患者HOXA1基因的表达明显增加。结合ATRA可诱导HL-60细胞HOXA1基因的表达改变这一结果，提示癌变造血细胞内HOXA1基因的表达出现异常，ATRA可能是通过改变HOXA1的表达，使白血病细胞向成熟分化，从而达到治癌的目的。由于HOXA1基因在正常人的表达较白血病患者的高，而ATRA可诱导HL-60细胞HOXA1表达增强使细胞成熟，提示HOXA1基因在ATRA诱导HL-60细胞分化中的作用与其在正常造血细胞分化中的作用不尽相同。深入研究此类诱导分化剂对各种白血病细胞(特别是AML M3型)内HOXA1基因表达的影响，将有助于对上述假设的验证。
【作者简介】 王吉伟(1966～)，男，浙江宁波市人，讲师，主要从事白血病的基因诊断及治疗研究。
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【参 考 文 献】
[1] MagLi Mc,Largman C,Lawrence J.Effect of HOX homeobox genes in blood cell differentiation[J].J Cellular physiology,1997,173:168
[2] 王吉伟.田菁燕，陈汉春.HL-60细胞内同源盒HOXA1 cDNA基因的克隆[J].中国现代医学杂志，2000,91(2):14-16
[3] 王吉伟，王顺伟，田菁燕，等.HL-60细胞内一种新的全反式维甲酸应答基因的克隆[J].湖南医科大学学报，1999，24(6)：501-503
[4] Boncinelli E,Acampora D,Pannese M,et al.Organization of human class l homeobox gene[J].Genome,1989,37:745
, 百拇医药
[5] Lawrence HJ,Largman C.Homebox genes in normal hematopoiesis and leukemia[J].Blood,1992,80:2445-2453
[6] Lawrence HJ,Helgason CD,Sauvageau G,et al.Mice bearing a targeted interruption of the homeobox gene HOXA1 have defects in myeloed,erythroid,and lymphoid hematopoiesis[J].Blood,1997,89(6):1922-1930
[7] Castronovo,V,Kusaka M,Chariot A,et al.Homeobox genes:potential candidates for the transcriptional control of the transformed and invasive phenotype[J].Biochemical Pharmac，1994,47(1):137-143
[8] Boncinelli,E,Simene A,Acampora D,et al.HOX gene activation by retinoic acid[J].Thrends in Biochem Sci,1991,7(10):329
【收稿日期】 1999-10-25, 百拇医药
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078
关键词：白血病，髓样；基因，同源盒；基因表达
湖南医学000102【摘 要】目的研究HOXA1基因在髓系白血病细胞内的表达及药物对其表达的影响。方法采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术，研究全反式维甲酸(ATRA)对HL-60细胞内同源盒HOXA1基因表达的影响。同时对9例髓系白血病患者的HOXA1基因表达进行了检测。结果①ATRA可上调HL-60细胞内HOXA1基因的表达。②所有受检白血病患者的HOXA1基因表达水平均比正常对照组高(P<0.01)。结论ATRA可能通过增强HOXA1基因表达使癌细胞朝良性细胞分化。
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【中图分类号】 R733.7 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)01-0003-02
Expression of Homeobox A1 Gene in Myeloid Leukemia Cells
WANG Jiwei TIAN Jingyan CHEN Hanchun
(Research Center of Molecular Biology,Hunan Medical University,Changsha 410078,China)
【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of homeobox A1 (HOXA1) gene in the myeloid leukemia cells and effects of a certain drug on their expression.MethodThe effects of all-trans retinoic acid(ATRA) on the HOXA1 expression in HL-60 cells were semi-quantitatively studied by using the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.Simaltaneously,the expression of HOXA1 gene was also detected in 9 patients with myeloid leukemia.ResultsThe expression of HOXA1 gene in HL-60 cells was upregulated by ATRA.The expression level of HL-60 cells in all the examined patients with leukemia was significantly higher than that in the normal control group (P<0.05).ConclusionThe cancer cells could be induced to differentiate into benign cells by ATRA through promoting the expression of HOXA1 gene.
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【Key word】 Leukemia,myeloid; gene expression; gene,homeo box
各种HOX基因统称为Ⅰ型同源盒基因，其编码蛋白质具有转录因子的功能。目前已发现，HOX基因可通过严格的“时空”表达协调造血细胞的分化[1]。通过鉴定造血细胞内HOX基因的表达种类，并进一步探讨它们与细胞恶变及药物治癌的关系，已逐渐成为相关领域的新热点。作者的前期研究已证实同源盒HOXA1基因在人髓系白血病细胞株HL-60细胞内表达[2]，为深入探讨HOXA1基因的功能，本文应用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术对HOXA1基因的表达进行了更进一步的研究。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及药物作用 HL-60细胞由湖南医科大学中心实验室提供。细胞培养方法、全反式维甲酸(ATRA)的配制及药物作用条件按文献[3]进行。
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1.2 临床标本的来源及处理 6例正常人外周血标本来源于血库献血员，9例白血病患者外周血均来自湘雅医院血液科门诊及住院病人。其中急性髓系白血病(AML)5例、慢性髓系白血病(CML)4例。所有患者均为初发病例。按常规方法分离单个核细胞，用Trizol○ R(美国Promega公司生产)试剂按操作说明提取总RNA后，置-70 ℃冰箱分装冻存。
1.3 半定量RT-PCR 逆转录及PCR的反应体系均用本室方法[2]。逆转录引物为Oligo(dT)15-18，用于PCR扩增的引物包括两对，其中一对为HOXA1基因扩增引物，有意链引物ATGAACTCCTTCCTGGAATA，反意链引物TCTGCTTCCTGATTTAACGC；内对照引物为β-actin基因引物，有意链引物ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，反意链引物CATCTCTTGCTCGAAGT-CCA。HOXA1基因的扩增条件为：94 ℃下变性30 s，56 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共进行35个循环。β-actin基因的PCR反应参数为：94 ℃下变性30 s，54 ℃下退火40 s，72 ℃下延伸40 s，共进行25个循环。
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1.4 扩增产物分析 取10 μl PCR产物用2%琼脂糖凝胶分离片段，用溴化乙锭(EB)染色后，紫外灯下观察并照相，光密度扫描仪扫描各区带的光密度值。通过比较同一样品HOXA1基因与β-actin基因的光密度比值，判断HOXA1基因的相对表达量。
2 结果
2.1 ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响 如附图所示，经ATRA作用后的HL-60细胞，HOXA1的表达明显增强，其表达的最高峰在ATRA作用36 h左右，但随着作用时间延长，HOXA1基因的表达水平明显回落。
附图 ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响
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2.2 白血病患者与对照组HOXA1基因的表达 6例献血员及9例白血病患者单核细胞均有HOXA1基因的表达。两组的表达均数分别为(0.362±0.096)及(0.687±0.162)，二者比较差异有显著性(t=19.8，P<0.01)。
3 讨论
HOX基因是一类首先在果蝇中发现的、进化高度保守的家族基因。到目前为止，已鉴定出39个人类HOX基因，并发现它们成簇分列于7，17，12，及2号染色体上[4]。HOX基因除了在胚胎发育中起重要的调节作用外，还在某些成人组织如造血细胞内表达，并受许多蛋白的调节。在白血病患者中，已发现了多种异常的同源盒基因[5]，同时转基因试验也证实，特定HOX基因的异常表达具有致瘤特性[6，7]。据此提出，同源盒基因在细胞的恶性转化和(或)肿瘤的演变中具有重要的作用。但目前尚不清楚特定癌变细胞中究竟表达哪些同源盒基因，以及这些基因在癌变中的作用。为此作者曾对人髓系白血病细胞株HL-60中的HOX基因进行了筛选，并从中鉴定出一个阳性克隆—HOXA1基因[2]。由于已知胚胎细胞内HOXA1基因的表达受ATRA的调节，故作者等利用半定量RT-PCR技术，尝试性地检测了ATRA对HL-60细胞内HOXA1基因表达的影响。结果表明，ATRA可诱导HOXA1基因的表达，呈现出一种上调后又下降的趋势。鉴于HOXA1基因在许多细胞(如人癌胚细胞株NT2/D1)中均能被ATRA诱导[8]，提示这种变化与细胞的种类无关，可能是ATRA诱导细胞分化的一个共同信号途径。进一步鉴定受HOXA1基因调节的靶基因，将有助于更好地理解ATRA的分子治癌机理。
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另外作者还发现HOXA1基因在15例被检临床标本中均有表达，其中9例粒系白血病患者HOXA1基因的表达明显增加。结合ATRA可诱导HL-60细胞HOXA1基因的表达改变这一结果，提示癌变造血细胞内HOXA1基因的表达出现异常，ATRA可能是通过改变HOXA1的表达，使白血病细胞向成熟分化，从而达到治癌的目的。由于HOXA1基因在正常人的表达较白血病患者的高，而ATRA可诱导HL-60细胞HOXA1表达增强使细胞成熟，提示HOXA1基因在ATRA诱导HL-60细胞分化中的作用与其在正常造血细胞分化中的作用不尽相同。深入研究此类诱导分化剂对各种白血病细胞(特别是AML M3型)内HOXA1基因表达的影响，将有助于对上述假设的验证。
【作者简介】 王吉伟(1966～)，男，浙江宁波市人，讲师，主要从事白血病的基因诊断及治疗研究。
, http://www.100md.com
【参 考 文 献】
[1] MagLi Mc,Largman C,Lawrence J.Effect of HOX homeobox genes in blood cell differentiation[J].J Cellular physiology,1997,173:168
[2] 王吉伟.田菁燕，陈汉春.HL-60细胞内同源盒HOXA1 cDNA基因的克隆[J].中国现代医学杂志，2000,91(2):14-16
[3] 王吉伟，王顺伟，田菁燕，等.HL-60细胞内一种新的全反式维甲酸应答基因的克隆[J].湖南医科大学学报，1999，24(6)：501-503
[4] Boncinelli E,Acampora D,Pannese M,et al.Organization of human class l homeobox gene[J].Genome,1989,37:745
, 百拇医药
[5] Lawrence HJ,Largman C.Homebox genes in normal hematopoiesis and leukemia[J].Blood,1992,80:2445-2453
[6] Lawrence HJ,Helgason CD,Sauvageau G,et al.Mice bearing a targeted interruption of the homeobox gene HOXA1 have defects in myeloed,erythroid,and lymphoid hematopoiesis[J].Blood,1997,89(6):1922-1930
[7] Castronovo,V,Kusaka M,Chariot A,et al.Homeobox genes:potential candidates for the transcriptional control of the transformed and invasive phenotype[J].Biochemical Pharmac，1994,47(1):137-143
[8] Boncinelli,E,Simene A,Acampora D,et al.HOX gene activation by retinoic acid[J].Thrends in Biochem Sci,1991,7(10):329
【收稿日期】 1999-10-25, 百拇医药