苹果酸钠对晕厥心肌线粒体酶系作用的实验研究
作者：高群 贾国良 王立军 李兰荪 李红梅 叶季鲜
单位：高群(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；李红梅(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；叶季鲜(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；贾国良(西京医院心内科)；李兰荪(西京医院心内科)；王立军(南京军区总院心内科)
关键词：晕厥心肌;线粒体酶;苹果酸钠
心脏杂志000103研究晕厥心肌线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)活性变化及苹果酸钠对其活性的影响。采用在体动物(家兔)晕厥心肌模型,测定心肌ATP含量及线粒体内SDH,CCO活性变化,观察苹果酸钠对上述指标的作用。结果:晕厥心肌线粒体重要酶SHD,CCO的活性降低,苹果酸钠能促进其活性恢复,增加ATP合成。结论:补充重要中间代谢产物对晕厥心肌线粒体功能恢复具有重要意义。
, 百拇医药
中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号：1005-3271(2000)-01-0007-03
Experimental study of the effect of sodium malate on mitochondrial enzymes in myocardial stunning
GAO Qun,LI Hong-mei,YE Ji-xian
(Department of Cardiology, No.323th Hospital,Xi′an 710054,Shaanxi,China)
JIA Guo-liang,LI Lan-sun
(Department of Cardiology,Xijing Hospital)
, 百拇医药
WANG Li-jun
(Department of Cardiology,Nanjing Military Command General Hospital)
Abstract:An experiment was conducted to study the activity changes of the succiodehydrogenase (SDH) and cyotochrome oxidase (CCO) in mitochondria and the effect of sodium malate on them in myocardial stunning. The model of myocardial stunning in the animal body (rabbit) was used to detect the ATP production of myocardial and the activity changes of SDH and CCO in mitochondria and to observe the effect of sodium malate on them. It was found that the activities of important enzymes (SDH,CCO) in mitochondria decreased in myocardial stunning, and sodium malate could enhance their reactivity and increase ATP produltion. Complementing the important intermediate substance might be very important to reviving the function of mitochondria in myocardial stunning.
, http://www.100md.com
Key words:myocardial stunning;mitochondrial enzyme;sodium malate
晕厥心肌是指心肌短暂缺血后不发生坏死,但引起心肌功能改变,再灌注后需要较长时间才能恢复的现象[1]。随着PTCA及AMI溶栓治疗等各种介入性治疗技术的广泛应用,发现心肌晕厥现象在临床广泛存在。其发生主要与自由基损伤、钙超载及能量代谢有关,且实验证实应用钙阻断剂、自由基清除剂对晕厥心肌具有保护作用。补充重要的中间代谢产物,促进线粒体功能恢复,可能成为临床防治心肌晕厥的有效措施。本实验观察了苹果酸钠对SDH,CCO活性恢复的作用及与ATP含量的关系。
1 材料与方法
1.1 动物及模型 健康新西兰雄性家兔,体重2.0～2.5 kg。随机分为苹果酸钠治疗组和生理盐水对照组。动物麻醉固定,开胸,剪开心包膜,充分暴露心脏,分离左室主干冠脉,并于上中三分之一交界处穿线,以备提拉结扎,再灌注时放松以恢复血流。以胸导联出现ST段弓背样抬高为结扎成功标准。根据分组需要,分别于缺血15 min,再灌注5,15,30及60 min迅速采取心肌标本。再灌注时治疗组用苹果酸钠(120 mg/kg),对照组用生理盐水。1.2 ATP测定 实验结束后,迅速剪下心脏,立即在左室非缺血区和缺血再灌注区剪取全层心肌组织各一块,置于液氮中速冻后,切取0.3 g心肌组织,置于预冷的玻璃匀浆器中,按1∶10比例加入预冷的0.6 mol/L高氯酸,在水浴条件下制成心肌匀浆,低温4 000 r/min离心15 min后取上清液,上清液在0℃条件下,5 mol/L氢氧化钾滴定调节pH值为7.0,低温4 000 r/min,离心15 min,取上清液,用高压液相色谱法测定ATP含量,每次标本重复进样4次测量,取平均值。
, http://www.100md.com
1.3 心肌线粒体分离 实验结束后,立即剪取心脏,取左室缺血再灌注全层心肌组织,去除结缔组织,剪碎,以含250 mmol/L蔗糖,5 mmol/L EDTA,pH7.4的磷酸缓冲液为介质制备心肌匀浆,用低温高速离心机600 ×g离心10 min,取上清液,再以10 000 ×g离心15 min,得线粒体沉淀,再以介质液悬浮,离心洗涤2次(以除去杂质蛋白)。用Lowrry法进行线粒体蛋白定量。
1.4 细胞色素氧化酶(CCO)活力测定 线粒体悬液制成50 g/L;测定样品含100 mmol/L,pH7.0磷酸缓冲液1.5 ml,加线粒体悬液0.01 ml,加蒸馏水至2.9 ml。对照组含同等量的线粒体和磷酸缓冲液,并加入100 mmol/L K3Fe(CN)6 0.03 ml，加蒸馏水至2.0 ml。30℃温育2 min。加入还原型细胞色素C 0.1 ml。
, http://www.100md.com
用分光光度计(UV-300)直接测定还原型细胞色素C被氧化的速度[吸光度(A)550 μm下降速度],计算CCO活力。以一级反应速度常数K表示酶的活力。比活力=K.min-1.mg-1线粒体蛋白。
1.5 琥珀酸脱氢酶活力测定 测定样品含200 mmol/L pH7.6磷酸缓冲液0.75 ml,45 mmol/L KCN和135 mmol/L琥珀酸钠0.2 ml,1.5 mmol/L二氯酚啶酚0.15 ml,9 mmol/L酚嗪二甲酯硫酸盐0.4 ml，加蒸馏水至2.9 ml,36℃温育5 min,加入线粒体悬液0.1 ml,立即以蒸馏水为对照,记录吸光度600 nm(A600 nm)变化,计算酶活力。
, 百拇医药
式中3为反应系统体积,21为二氯酚啶酚吸光系数(mmol/cm)。
2 结果
2.1 心肌ATP含量变化 见表1。
表1 心肌缺血再灌注ATP含量变化 (
±s，n=7) 分组
非缺血区
缺血15 min
再灌注
5 min
15 min
30 min
, 百拇医药
60 min
对照组
5.42±1.01
3.16±1.10b
2.71±0.71b
2.85±0.37b
3.03±0.61a
3.32±0.39b
治疗组
5.41±0.83
3.12±0.51b
, http://www.100md.com
2.63±1.04b
2.88±0.31b
3.14±0.75b
3.80±0.57bc
与本组非缺血区比较,aP<0.05,bP<0.01;与对照组比较,cP<0.052.2 心肌缺血再灌注各时间点SDG,CCO活性变化 见表2。
表2 心肌缺血再灌注SDH,CCO活性变化 (±s,n=7) 样本
非缺血区
, 百拇医药
缺血15 min
再灌注
5 min
15 min
30 min
60 min
对照组SDH
0.78±0.06
0.67±0.07b
0.54±0.05b
0.55±0.04b
, 百拇医药
0.59±0.04b
0.60±0.05
治疗组SDH
0.79±0.06
0.69±0.05b
0.54±0.08b
0.56±0.04b
0.64±0.03b
0.75±0.07c
对照组CCO
, 百拇医药
10.37±1.50
10.35±0.98b
6.64±1.38b
6.57±0.85b
7.16±0.87b
8.67±1.21
治疗组CCO
10.61±1.42
10.74±1.23b
6.43±1.30b
, http://www.100md.com
6.62±0.94b
7.58±1.01b
10.00±0.77c
与本组非缺血区比较,aP<0.05,bP<0.01;与对照组比较,cP<0.053 讨论
心肌能量代谢在心肌晕厥发生和恢复过程中的作用越来越受到关注。有实验结果表明,晕厥心肌功能的恢复要有完整的线粒体氧化磷酸化功能,单纯提高ATP含量,作用不大[2,3]。促进线粒体呼吸功能恢复,促进内源性ATP生成,对晕厥心肌功能的恢复具有重要意义[4,5]。
3.1 SDH活性变化 SDH是反映线粒体功能的重要酶,它催化琥珀酸脱氢生成反丁烯2酸,并使SDH的还原型辅基FADH2进入呼吸链,而且SDH是黄酶,同时也是呼吸链的一个环节,结果显示:心肌缺血15 min时SDH活性显著下降,再灌注5 min时进一步降低。其机制可能是:①心肌缺血,乳酸生成增多,细胞内酸中毒使SDH活性降低。②细胞内钙超载损害线粒体内膜时,对SDH有抑制作用。③再灌注时产生大量自由基直接损伤酶的结构,使SDH活性进一步下降。④ATP,COQH2,Mg2+是SDH的激动剂,其流失或减少都可使SDH活性降低。
, 百拇医药
3.2 CCO活性变化 本实验结果显示:缺血15 min,CCO活性无明显变化,但再灌注5 min后明显降低。其机制可能与下列因素有关:①氧化磷酸化是由呼吸链及有关酶系完成的。酶系主要分为4个多酶复合体,短暂缺血不易破坏整个体系。②缺血发生后,酵解增强,产生的乳酸通过NAD,FMN体系对CCO有间接激动作用。③短暂缺血时线粒体内细胞色素C及细胞色素aa3含量无显著变化,而再灌注时明显减少,也可致CCO活性下降。④再灌注产生大量自由基破坏线粒体膜及酶的结构,改变膜的通透性,使细胞色素C和细胞色素aa3等流失,从而使CCO活性下降。
3.3 ATP含量变化 对照组ATP含量在缺血15 min时下降,为非缺血区的58%,再灌注5 min时进一步降至48%且恢复缓慢,至再灌注60 min时,只恢复到非缺血区的60%。这种变化过程与SDH变化过程相关(r=0.863)。说明心肌缺血/再灌注时线粒体酶活性降低,氧化磷酸化障碍是ATP减少的原因之一,再灌注后酶活性恢复缓慢,各种能量代谢底物流失,使氧化磷酸化功能难以立即得到恢复,所以ATP恢复也延迟。
, http://www.100md.com
3.4 苹果酸钠对晕厥心肌SDH,CCO,ATP的作用 本实验结果显示:治疗组SDH,CCO活性于再灌注60 min时较对照组明显提高,表明苹果酸钠对晕厥心肌线粒体酶SDH,CCO的活性恢复有促进作用。苹果酸钠对CCO的作用主要是直接促进细胞色素C还原,增强CCO的活性,另一方面能通过载入NADH促进CCO活性。SDH是呼吸链的一个组成部分,随着CCO活性的增强,电子传递加快,使SDH活性也随之增强。再灌注60 min时治疗组ATP含量也是显著高于对照组。苹果酸钠促进晕厥心肌线粒体呼吸功能恢复,产生大量内源性ATP,用于细胞结构及膜通道修复,并使Na+-K+-ATP酶、H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等ATP依赖酶活性恢复,转运各种离子,恢复生理状态分布。Ca2+转出细胞后转入肌浆网储存,促进Ca2+超载恢复。另外,ATP是SDH的特异激动剂,ATP含量增加,可以促进SDH活性恢复,从而促进三羧酸循环[6]。本实验中,治疗组再灌注30 min时SDH活性已明显高于对照组,较CCO活性恢复提前,可能与ATP的特异激动作用有关。
, http://www.100md.com
参考文献:
[1] Braunwaldl E,Klone RA. The stanned myocardium proloned postischemic venticular dysfunction[J]. Circulation,1982,66(6):1146.
[2] Edoute Y,Kotze JCN,Lochner A. Normothermic ischemic corrdiac arrest of the isolated working rat heart[J]. Circ Res,1983,53:663.
[3] Flameng W,Andres J,Ferdinande P. Mitochondrial function in myocardial stunning[J]. J Mol Cell Cardiol,1991,23:1.
[4] John H,et al. Myocardial presservation during is chemia and reperfusion[J]. Am Heart J,1988,115:1094.
[5] 郭志凌,赵月华. 局部心肌缺血/再灌注损伤的防治[J]. 心血管病学进展,1993,14(2):95.
[6] 窦淑筠. 正常与缺血时心肌线粒体代谢状况[J]. 生理科学进展, 1982,13(2):108.
(收稿 1998-08-21 修回 1999-06-30), http://www.100md.com
单位：高群(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；李红梅(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；叶季鲜(解放军323医院心肾科,陕西 西安 710054)；贾国良(西京医院心内科)；李兰荪(西京医院心内科)；王立军(南京军区总院心内科)
关键词：晕厥心肌;线粒体酶;苹果酸钠
心脏杂志000103研究晕厥心肌线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)活性变化及苹果酸钠对其活性的影响。采用在体动物(家兔)晕厥心肌模型,测定心肌ATP含量及线粒体内SDH,CCO活性变化,观察苹果酸钠对上述指标的作用。结果:晕厥心肌线粒体重要酶SHD,CCO的活性降低,苹果酸钠能促进其活性恢复,增加ATP合成。结论:补充重要中间代谢产物对晕厥心肌线粒体功能恢复具有重要意义。
, 百拇医药
中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号：1005-3271(2000)-01-0007-03
Experimental study of the effect of sodium malate on mitochondrial enzymes in myocardial stunning
GAO Qun,LI Hong-mei,YE Ji-xian
(Department of Cardiology, No.323th Hospital,Xi′an 710054,Shaanxi,China)
JIA Guo-liang,LI Lan-sun
(Department of Cardiology,Xijing Hospital)
, 百拇医药
WANG Li-jun
(Department of Cardiology,Nanjing Military Command General Hospital)
Abstract:An experiment was conducted to study the activity changes of the succiodehydrogenase (SDH) and cyotochrome oxidase (CCO) in mitochondria and the effect of sodium malate on them in myocardial stunning. The model of myocardial stunning in the animal body (rabbit) was used to detect the ATP production of myocardial and the activity changes of SDH and CCO in mitochondria and to observe the effect of sodium malate on them. It was found that the activities of important enzymes (SDH,CCO) in mitochondria decreased in myocardial stunning, and sodium malate could enhance their reactivity and increase ATP produltion. Complementing the important intermediate substance might be very important to reviving the function of mitochondria in myocardial stunning.
, http://www.100md.com
Key words:myocardial stunning;mitochondrial enzyme;sodium malate
晕厥心肌是指心肌短暂缺血后不发生坏死,但引起心肌功能改变,再灌注后需要较长时间才能恢复的现象[1]。随着PTCA及AMI溶栓治疗等各种介入性治疗技术的广泛应用,发现心肌晕厥现象在临床广泛存在。其发生主要与自由基损伤、钙超载及能量代谢有关,且实验证实应用钙阻断剂、自由基清除剂对晕厥心肌具有保护作用。补充重要的中间代谢产物,促进线粒体功能恢复,可能成为临床防治心肌晕厥的有效措施。本实验观察了苹果酸钠对SDH,CCO活性恢复的作用及与ATP含量的关系。
1 材料与方法
1.1 动物及模型 健康新西兰雄性家兔,体重2.0～2.5 kg。随机分为苹果酸钠治疗组和生理盐水对照组。动物麻醉固定,开胸,剪开心包膜,充分暴露心脏,分离左室主干冠脉,并于上中三分之一交界处穿线,以备提拉结扎,再灌注时放松以恢复血流。以胸导联出现ST段弓背样抬高为结扎成功标准。根据分组需要,分别于缺血15 min,再灌注5,15,30及60 min迅速采取心肌标本。再灌注时治疗组用苹果酸钠(120 mg/kg),对照组用生理盐水。1.2 ATP测定 实验结束后,迅速剪下心脏,立即在左室非缺血区和缺血再灌注区剪取全层心肌组织各一块,置于液氮中速冻后,切取0.3 g心肌组织,置于预冷的玻璃匀浆器中,按1∶10比例加入预冷的0.6 mol/L高氯酸,在水浴条件下制成心肌匀浆,低温4 000 r/min离心15 min后取上清液,上清液在0℃条件下,5 mol/L氢氧化钾滴定调节pH值为7.0,低温4 000 r/min,离心15 min,取上清液,用高压液相色谱法测定ATP含量,每次标本重复进样4次测量,取平均值。
, http://www.100md.com
1.3 心肌线粒体分离 实验结束后,立即剪取心脏,取左室缺血再灌注全层心肌组织,去除结缔组织,剪碎,以含250 mmol/L蔗糖,5 mmol/L EDTA,pH7.4的磷酸缓冲液为介质制备心肌匀浆,用低温高速离心机600 ×g离心10 min,取上清液,再以10 000 ×g离心15 min,得线粒体沉淀,再以介质液悬浮,离心洗涤2次(以除去杂质蛋白)。用Lowrry法进行线粒体蛋白定量。
1.4 细胞色素氧化酶(CCO)活力测定 线粒体悬液制成50 g/L;测定样品含100 mmol/L,pH7.0磷酸缓冲液1.5 ml,加线粒体悬液0.01 ml,加蒸馏水至2.9 ml。对照组含同等量的线粒体和磷酸缓冲液,并加入100 mmol/L K3Fe(CN)6 0.03 ml，加蒸馏水至2.0 ml。30℃温育2 min。加入还原型细胞色素C 0.1 ml。
, http://www.100md.com
用分光光度计(UV-300)直接测定还原型细胞色素C被氧化的速度[吸光度(A)550 μm下降速度],计算CCO活力。以一级反应速度常数K表示酶的活力。比活力=K.min-1.mg-1线粒体蛋白。
1.5 琥珀酸脱氢酶活力测定 测定样品含200 mmol/L pH7.6磷酸缓冲液0.75 ml,45 mmol/L KCN和135 mmol/L琥珀酸钠0.2 ml,1.5 mmol/L二氯酚啶酚0.15 ml,9 mmol/L酚嗪二甲酯硫酸盐0.4 ml，加蒸馏水至2.9 ml,36℃温育5 min,加入线粒体悬液0.1 ml,立即以蒸馏水为对照,记录吸光度600 nm(A600 nm)变化,计算酶活力。
, 百拇医药
式中3为反应系统体积,21为二氯酚啶酚吸光系数(mmol/cm)。
2 结果
2.1 心肌ATP含量变化 见表1。
表1 心肌缺血再灌注ATP含量变化 (
±s，n=7) 分组非缺血区
缺血15 min
再灌注
5 min
15 min
30 min
, 百拇医药
60 min
对照组
5.42±1.01
3.16±1.10b
2.71±0.71b
2.85±0.37b
3.03±0.61a
3.32±0.39b
治疗组
5.41±0.83
3.12±0.51b
, http://www.100md.com
2.63±1.04b
2.88±0.31b
3.14±0.75b
3.80±0.57bc
与本组非缺血区比较,aP<0.05,bP<0.01;与对照组比较,cP<0.052.2 心肌缺血再灌注各时间点SDG,CCO活性变化 见表2。
表2 心肌缺血再灌注SDH,CCO活性变化 (
±s,n=7) 样本非缺血区
, 百拇医药
缺血15 min
再灌注
5 min
15 min
30 min
60 min
对照组SDH
0.78±0.06
0.67±0.07b
0.54±0.05b
0.55±0.04b
, 百拇医药
0.59±0.04b
0.60±0.05
治疗组SDH
0.79±0.06
0.69±0.05b
0.54±0.08b
0.56±0.04b
0.64±0.03b
0.75±0.07c
对照组CCO
, 百拇医药
10.37±1.50
10.35±0.98b
6.64±1.38b
6.57±0.85b
7.16±0.87b
8.67±1.21
治疗组CCO
10.61±1.42
10.74±1.23b
6.43±1.30b
, http://www.100md.com
6.62±0.94b
7.58±1.01b
10.00±0.77c
与本组非缺血区比较,aP<0.05,bP<0.01;与对照组比较,cP<0.053 讨论
心肌能量代谢在心肌晕厥发生和恢复过程中的作用越来越受到关注。有实验结果表明,晕厥心肌功能的恢复要有完整的线粒体氧化磷酸化功能,单纯提高ATP含量,作用不大[2,3]。促进线粒体呼吸功能恢复,促进内源性ATP生成,对晕厥心肌功能的恢复具有重要意义[4,5]。
3.1 SDH活性变化 SDH是反映线粒体功能的重要酶,它催化琥珀酸脱氢生成反丁烯2酸,并使SDH的还原型辅基FADH2进入呼吸链,而且SDH是黄酶,同时也是呼吸链的一个环节,结果显示:心肌缺血15 min时SDH活性显著下降,再灌注5 min时进一步降低。其机制可能是:①心肌缺血,乳酸生成增多,细胞内酸中毒使SDH活性降低。②细胞内钙超载损害线粒体内膜时,对SDH有抑制作用。③再灌注时产生大量自由基直接损伤酶的结构,使SDH活性进一步下降。④ATP,COQH2,Mg2+是SDH的激动剂,其流失或减少都可使SDH活性降低。
, 百拇医药
3.2 CCO活性变化 本实验结果显示:缺血15 min,CCO活性无明显变化,但再灌注5 min后明显降低。其机制可能与下列因素有关:①氧化磷酸化是由呼吸链及有关酶系完成的。酶系主要分为4个多酶复合体,短暂缺血不易破坏整个体系。②缺血发生后,酵解增强,产生的乳酸通过NAD,FMN体系对CCO有间接激动作用。③短暂缺血时线粒体内细胞色素C及细胞色素aa3含量无显著变化,而再灌注时明显减少,也可致CCO活性下降。④再灌注产生大量自由基破坏线粒体膜及酶的结构,改变膜的通透性,使细胞色素C和细胞色素aa3等流失,从而使CCO活性下降。
3.3 ATP含量变化 对照组ATP含量在缺血15 min时下降,为非缺血区的58%,再灌注5 min时进一步降至48%且恢复缓慢,至再灌注60 min时,只恢复到非缺血区的60%。这种变化过程与SDH变化过程相关(r=0.863)。说明心肌缺血/再灌注时线粒体酶活性降低,氧化磷酸化障碍是ATP减少的原因之一,再灌注后酶活性恢复缓慢,各种能量代谢底物流失,使氧化磷酸化功能难以立即得到恢复,所以ATP恢复也延迟。
, http://www.100md.com
3.4 苹果酸钠对晕厥心肌SDH,CCO,ATP的作用 本实验结果显示:治疗组SDH,CCO活性于再灌注60 min时较对照组明显提高,表明苹果酸钠对晕厥心肌线粒体酶SDH,CCO的活性恢复有促进作用。苹果酸钠对CCO的作用主要是直接促进细胞色素C还原,增强CCO的活性,另一方面能通过载入NADH促进CCO活性。SDH是呼吸链的一个组成部分,随着CCO活性的增强,电子传递加快,使SDH活性也随之增强。再灌注60 min时治疗组ATP含量也是显著高于对照组。苹果酸钠促进晕厥心肌线粒体呼吸功能恢复,产生大量内源性ATP,用于细胞结构及膜通道修复,并使Na+-K+-ATP酶、H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等ATP依赖酶活性恢复,转运各种离子,恢复生理状态分布。Ca2+转出细胞后转入肌浆网储存,促进Ca2+超载恢复。另外,ATP是SDH的特异激动剂,ATP含量增加,可以促进SDH活性恢复,从而促进三羧酸循环[6]。本实验中,治疗组再灌注30 min时SDH活性已明显高于对照组,较CCO活性恢复提前,可能与ATP的特异激动作用有关。
, http://www.100md.com
参考文献:
[1] Braunwaldl E,Klone RA. The stanned myocardium proloned postischemic venticular dysfunction[J]. Circulation,1982,66(6):1146.
[2] Edoute Y,Kotze JCN,Lochner A. Normothermic ischemic corrdiac arrest of the isolated working rat heart[J]. Circ Res,1983,53:663.
[3] Flameng W,Andres J,Ferdinande P. Mitochondrial function in myocardial stunning[J]. J Mol Cell Cardiol,1991,23:1.
[4] John H,et al. Myocardial presservation during is chemia and reperfusion[J]. Am Heart J,1988,115:1094.
[5] 郭志凌,赵月华. 局部心肌缺血/再灌注损伤的防治[J]. 心血管病学进展,1993,14(2):95.
[6] 窦淑筠. 正常与缺血时心肌线粒体代谢状况[J]. 生理科学进展, 1982,13(2):108.
(收稿 1998-08-21 修回 1999-06-30), http://www.100md.com