纤溶酶相关蛋白在急性髓性白血病血浆和骨髓中的表达
作者：陈怡 俞康 江松福
单位：陈怡(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))；俞康(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))；江松福(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))
关键词：白血病，急性/髓性；纤溶酶原激活剂；纤溶酶原激活剂抑制剂；纤溶亢进
临床血液学杂志000111 摘要：目的：观察髓性白血病及正常人骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI的表达情况并探讨其临床意义。方法：用ELISA法测定20例急性髓性白血病及15例正常人骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI-1、PAI-2抗原表达，同时用发色底物法测定血浆中tPA、uPA和PAI-1的活性。结果：骨髓中tPA浓度白血病低于正常人(P<0.01)，血浆中相反。uPA浓度骨髓及血浆中白血病均高于正常人(P<0.001)。PAI-1抗原测定两者骨髓及血浆均无差别。PAI-2正常人骨髓中高于白血病(P<0.01)，血浆中相反。急性髓性白血病uPA、tPA和PAI-1血浆活性均高于正常人。结论：急性髓性白血病骨髓中uPA表达增高，说明白血病细胞主要表达uPA为主，不产生tPA。tPA的释放是由于血管内皮细胞受到白血病细胞损伤引起。在急性髓性白血病患者的出血机制与uPA、tPA过度表达导致纤溶亢进有关，而且白血病早期浸润可能与uPA、PAI的表达有关。
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The expression of plasmin-associated proteins in bone marrow and plasma in AML
CHEN Yi YU Kang JIANG Song-fu
(The Department of Hematology Wenzhou Medical College
First Affilicated Hospital,WenZhou 325000)
Abstract：Objective：To investigate the uPA,tPA,PAI-Ⅰ PAI-Ⅱ antigen expression in bone marrow manomuclei cell (MNC) and its plasma level in AML and normal subject;furthermore to explone its clinical importance.Method：Using ELISA to determinating uPA,tPA,PAI-Ⅰ PAI-Ⅱ antigen in bone marrow MNC and its plasma level in 20 AML and 15 normal subject using chromophoric substract method to measure the uPA tPA PAI-Ⅰ activity.Result：The tPA and PAI-Ⅱ exprescion in BM MNe in AML is lower than in normal subjects while plasma level of the two factor is higher in AMI the uPA in BM MNC and its plasma level are both higher in AML.PAI-Ⅰ in BM MNC and its plasma level are the same in AML and normal subject.The tPA uPA,PAI-1 activity in AMI is higher than normal.Conclusion：The hemostasis mechanism in AML is associated with high level of uPA and tPA which inducing inueased fibrinolysis.uPA is predominatly expressed in the leukemia cells and the higher tPA is mainly released by the injuried vessel endethelial cells.
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Key words：AML Plasminogen acitvator Plasminogen activator inhibitor Fbrinolysis▲
急性髓性白血病的严重出血与血小板减少、凝血因子异常、纤维蛋白溶解(纤溶亢进)、DIC等有关。同时，近年来证实uPA、tPA、PAI与肿瘤转移和浸润密切相关且发现肿瘤细胞中uPA、uPA-R表达明显增高。本文观察了急性髓性白血病骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI的表达情况。
1 材料和方法
1.1 病例选择
急性髓性白血病初治共20例，按张之南血液病诊断及疗效标准确诊，其中M1 3例，M2 3例，M3 7例，M4 2例，M5 5例。男12例，女8例，年龄16～65岁，均系我科住院患者。正常对照组为胸外科病人骨髓共15例。
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1.2 总蛋白溶液的制备
取骨髓液5 ml，枸橼酸钠抗凝，先用180目不锈钢网过滤去除脂肪及骨髓小粒，10 ml中分子右旋糖酐自然沉降后去除上清液，细胞层以1∶9的比例加入0.1%氯化铵溶液溶解红细胞，用PBS(pH 7.0)洗3次，收集单个核细胞。用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白(Promagan公司产品)；冷冻干燥浓缩后，核酸/蛋白测定分析仪(DU640，Beckman)测定蛋白含量，配制成10 g/L总蛋白的溶液；留取1 ml血浆作活性测定，其余血浆同法分离提取总蛋白，定量配制10 g/L总蛋白的溶液。
1.3 uPA、tPA、PAI的抗原测定
用ELISA法。uPA、tPA、PAI-1和PAI-2酶联测定试剂盒购自美国ADI生物有限公司，按说明书操作，用BIO-TEK EL800酶联仪测定每g总蛋白中的uPA、tPA、PAI-1和PAI-2的含量。
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1.4 血浆tPA、uPA和PAI-1活性测定
用发色底物法。tPA、uPA和PAI-1活性测定试剂盒购自上海贝特生物技术有限公司，按说明书操作，用BIO-TEK酶标仪，A 405 nm比色并分别计算活性。
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
正常骨髓、血浆及白血病骨髓、血浆总蛋白中纤溶相关蛋白含量和活性，参见表1，表2。
表1 纤溶酶相关蛋白在正常、髓性白血病、骨髓及血浆总蛋白中的含量
±s
tPA
, 百拇医药
P值
uPA
P值
PAI-1
P值
PAI-2
P值
正常骨髓
正常血浆
2.293±1.330
0.034±0.016
<0.001
0.009±0.006
, http://www.100md.com
0.038±0.014
<0.001
0.844±0.470
0.213±0.087
<0.01
1.301±0.580
0.013±0.009
<0.01
白血病骨髓
白血病血浆
0.220±0.1501)
, http://www.100md.com 0.098±0.0592)
<0.01
0.130±0.0993)
0.088±0.0252)
<0.01
0.590±0.4404)
0.283±0.2615)
<0.05
0.103±0.0452)
0.003±0.0016)
, 百拇医药
<0.001
注：与正常骨髓比较 1)P<0.01 3)P<0.001 4)P<0.05；与正常血浆比较 2)P<0.05； 5)P>0.05； 6)P>0.01表2 正常人与白血病患者血浆中tPA、uPA、PAI-1活性的比较(ml/L)，±s 项目
正常血浆
髓性白血病血浆
P值
tPA
0.48±0.13
, 百拇医药
0.83±0.27
<0.05
uPA
0.22±0.08
0.56±0.12
<0.001
PAI-1
0.59±0.09
1.04±0.10
<0.01
tPA、uPA、PAI-1、PAI-2在骨髓中的表达，除正常骨髓中uPA不表达外，其余均明显高于血浆中的浓度(P<0.001)。tPA在白血病骨髓中浓度低于正常人(P<0.01)，而血浆中浓度恰好与之相反，即白血病组高于正常人组(P<0.05)。正常人骨髓细胞中uPA的表达显著低于白血病(P<0.001)，血浆中与骨髓相似。PAI-1抗原测定正常组与白血病组在骨髓或血浆中浓度差异均无显著性(P>0.05)，而PAI-1活性测定则白血病组高于正常对照者(P<0.01)。PAI-2正常人骨髓中表达显著高于白血病(P<0.001)，血浆中两者却相反(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
急性髓性白血病常并发严重出血，其出血原因通常与血小板数量减少、功能异常、凝血因子异常和(或)DIC有关，但一部分病人与纤维蛋白溶解(纤溶亢进)有密切关系。主要机制可能是〔1〕：①某些类型白血病细胞直接产生tPA型或uPA型纤维酶原激活物，而激活纤溶酶系统引起原发性纤溶。②大量凝血酶和纤维蛋白激活纤溶酶原使其转变为纤溶酶从而引起继发性纤溶。Tapiovaara等〔2〕报道白血病患者骨髓单个核细胞uPA、tPA表达增加，并分为单纯表达uPA和uPA、tPA双表型两种形式。本文通过对急性髓性白血病患者及正常对照组的血浆和骨髓单个核细胞uPA、tPA及PAI抗原表达及血浆活性的观察，发现急性白血病患者的骨髓单个核细胞tPA表达低于正常人，而血浆中恰好相反。uPA正常对照组无表达，而白血病组骨髓中表达明显增高，血浆中亦明显高于正常人，均为uPA单表达型。由此证实了急性白血病患者其白血病细胞主要以表达uPA为主，且血浆中uPA同步增高〔3〕。而tPA主要由血管内皮细胞合成并释放，白血病患者骨髓单个核细胞不表达tPA。故tPA并非由白血病细胞直接产生，而是在白血病时血管内皮细胞受到损伤，诱发tPA的释放。tPA的局部纤溶作用强，全身纤溶作用弱。而uPA的作用则相反，全身性纤溶作用强，无局部纤溶作用或很弱。uPA与tPA有协同激活纤溶作用。所以白血病患者通过uPA、tPA的产生增高，导致纤溶亢进。近年来发现uPA、uPAR、PAI与肿瘤的浸润转移有密切相关〔4〕。uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，不仅通过激活纤溶酶原转变为纤溶酶，发挥纤溶效应，还降解大部分糖蛋白如纤维连接蛋白层素，凝血酶敏感蛋白以及4型胶原等。肿瘤细胞表达uPA可以通过上述结缔组织中成分的破坏，逐步向前移动，导致瘤细胞转移。PAI的作用恰好与上述机制相反。本文观察到急性髓性白血病细胞中uPA增加，PAI不增加，白血病细胞早期出现广泛组织的浸润可能与此有关。PAI-1主要由血管内皮细胞产生，血小板α颗粒中贮存着大量的PAI-1。当血小板受激活时，PAI-1大量从血小板中释放。其以两种形式存在：一是有活性，称为活性型PAI-1；二是无活性，称为潜在型PAI-1。我们观察到正常组与白血病组的PAI-1抗原在骨髓或血浆中浓度差异均无显著意义，而PAI-1活性测定则白血病组高于正常组，可能由于白血病患者PAI-1以活化型增高为主，而PAI-2正常人骨髓中高于白血病，血浆中则相反。机制可能是由于白血病患者血浆中uPA活性升高后使PAI-2的产生增加，从而反馈抑制uPA活性的调控机制有关。而正常骨髓中由于tPA，PAI均升高并达到平衡，使正常骨髓具有一定纤溶活性，保持组织流动性。■
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参考文献：
[1]Bennett B,Booth N A,Cnoll,et al.The bleeding disorder in acute promyelocytic leukaemia：fibrinolysis due to u-PA rather than defibrination.Br J Haematol,1989,7：511～517
[2]Tapiovaara H,Alitalo R,Stephens,et al.Abundant urokinase activity on the surface of mononuclear ceels from blood and bone marrow of acute leukemia patients.Blood,1994,82：914～919
[3]Tapiovaara H,Matikainen S,Hurme M,et al.Induction of differentiation of promyelocytic NB4 cells by retinoic acid is associated with rapid increase in urokinase activity subsequently downregulated by production of inhibitors.Blood,1994,83：1883～1889
[4]Dano K,Andreasen P A,Grondahl-Hansea,et al.Plasminogen activation,tissue degradation and cancer.Adv Cancer Res,1985,44：139～144
收稿 1999-06-28, http://www.100md.com
单位：陈怡(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))；俞康(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))；江松福(温州医学院附属第一医院血液科(浙江温州，325000))
关键词：白血病，急性/髓性；纤溶酶原激活剂；纤溶酶原激活剂抑制剂；纤溶亢进
临床血液学杂志000111 摘要：目的：观察髓性白血病及正常人骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI的表达情况并探讨其临床意义。方法：用ELISA法测定20例急性髓性白血病及15例正常人骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI-1、PAI-2抗原表达，同时用发色底物法测定血浆中tPA、uPA和PAI-1的活性。结果：骨髓中tPA浓度白血病低于正常人(P<0.01)，血浆中相反。uPA浓度骨髓及血浆中白血病均高于正常人(P<0.001)。PAI-1抗原测定两者骨髓及血浆均无差别。PAI-2正常人骨髓中高于白血病(P<0.01)，血浆中相反。急性髓性白血病uPA、tPA和PAI-1血浆活性均高于正常人。结论：急性髓性白血病骨髓中uPA表达增高，说明白血病细胞主要表达uPA为主，不产生tPA。tPA的释放是由于血管内皮细胞受到白血病细胞损伤引起。在急性髓性白血病患者的出血机制与uPA、tPA过度表达导致纤溶亢进有关，而且白血病早期浸润可能与uPA、PAI的表达有关。
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The expression of plasmin-associated proteins in bone marrow and plasma in AML
CHEN Yi YU Kang JIANG Song-fu
(The Department of Hematology Wenzhou Medical College
First Affilicated Hospital,WenZhou 325000)
Abstract：Objective：To investigate the uPA,tPA,PAI-Ⅰ PAI-Ⅱ antigen expression in bone marrow manomuclei cell (MNC) and its plasma level in AML and normal subject;furthermore to explone its clinical importance.Method：Using ELISA to determinating uPA,tPA,PAI-Ⅰ PAI-Ⅱ antigen in bone marrow MNC and its plasma level in 20 AML and 15 normal subject using chromophoric substract method to measure the uPA tPA PAI-Ⅰ activity.Result：The tPA and PAI-Ⅱ exprescion in BM MNe in AML is lower than in normal subjects while plasma level of the two factor is higher in AMI the uPA in BM MNC and its plasma level are both higher in AML.PAI-Ⅰ in BM MNC and its plasma level are the same in AML and normal subject.The tPA uPA,PAI-1 activity in AMI is higher than normal.Conclusion：The hemostasis mechanism in AML is associated with high level of uPA and tPA which inducing inueased fibrinolysis.uPA is predominatly expressed in the leukemia cells and the higher tPA is mainly released by the injuried vessel endethelial cells.
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Key words：AML Plasminogen acitvator Plasminogen activator inhibitor Fbrinolysis▲
急性髓性白血病的严重出血与血小板减少、凝血因子异常、纤维蛋白溶解(纤溶亢进)、DIC等有关。同时，近年来证实uPA、tPA、PAI与肿瘤转移和浸润密切相关且发现肿瘤细胞中uPA、uPA-R表达明显增高。本文观察了急性髓性白血病骨髓单个核细胞及血浆中uPA、tPA、PAI的表达情况。
1 材料和方法
1.1 病例选择
急性髓性白血病初治共20例，按张之南血液病诊断及疗效标准确诊，其中M1 3例，M2 3例，M3 7例，M4 2例，M5 5例。男12例，女8例，年龄16～65岁，均系我科住院患者。正常对照组为胸外科病人骨髓共15例。
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1.2 总蛋白溶液的制备
取骨髓液5 ml，枸橼酸钠抗凝，先用180目不锈钢网过滤去除脂肪及骨髓小粒，10 ml中分子右旋糖酐自然沉降后去除上清液，细胞层以1∶9的比例加入0.1%氯化铵溶液溶解红细胞，用PBS(pH 7.0)洗3次，收集单个核细胞。用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白(Promagan公司产品)；冷冻干燥浓缩后，核酸/蛋白测定分析仪(DU640，Beckman)测定蛋白含量，配制成10 g/L总蛋白的溶液；留取1 ml血浆作活性测定，其余血浆同法分离提取总蛋白，定量配制10 g/L总蛋白的溶液。
1.3 uPA、tPA、PAI的抗原测定
用ELISA法。uPA、tPA、PAI-1和PAI-2酶联测定试剂盒购自美国ADI生物有限公司，按说明书操作，用BIO-TEK EL800酶联仪测定每g总蛋白中的uPA、tPA、PAI-1和PAI-2的含量。
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1.4 血浆tPA、uPA和PAI-1活性测定
用发色底物法。tPA、uPA和PAI-1活性测定试剂盒购自上海贝特生物技术有限公司，按说明书操作，用BIO-TEK酶标仪，A 405 nm比色并分别计算活性。
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
正常骨髓、血浆及白血病骨髓、血浆总蛋白中纤溶相关蛋白含量和活性，参见表1，表2。
表1 纤溶酶相关蛋白在正常、髓性白血病、骨髓及血浆总蛋白中的含量
±stPA
, 百拇医药
P值
uPA
P值
PAI-1
P值
PAI-2
P值
正常骨髓
正常血浆
2.293±1.330
0.034±0.016
<0.001
0.009±0.006
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0.038±0.014
<0.001
0.844±0.470
0.213±0.087
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1.301±0.580
0.013±0.009
<0.01
白血病骨髓
白血病血浆
0.220±0.1501)
, http://www.100md.com 0.098±0.0592)
<0.01
0.130±0.0993)
0.088±0.0252)
<0.01
0.590±0.4404)
0.283±0.2615)
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0.103±0.0452)
0.003±0.0016)
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注：与正常骨髓比较 1)P<0.01 3)P<0.001 4)P<0.05；与正常血浆比较 2)P<0.05； 5)P>0.05； 6)P>0.01表2 正常人与白血病患者血浆中tPA、uPA、PAI-1活性的比较(ml/L)，
±s 项目正常血浆
髓性白血病血浆
P值
tPA
0.48±0.13
, 百拇医药
0.83±0.27
<0.05
uPA
0.22±0.08
0.56±0.12
<0.001
PAI-1
0.59±0.09
1.04±0.10
<0.01
tPA、uPA、PAI-1、PAI-2在骨髓中的表达，除正常骨髓中uPA不表达外，其余均明显高于血浆中的浓度(P<0.001)。tPA在白血病骨髓中浓度低于正常人(P<0.01)，而血浆中浓度恰好与之相反，即白血病组高于正常人组(P<0.05)。正常人骨髓细胞中uPA的表达显著低于白血病(P<0.001)，血浆中与骨髓相似。PAI-1抗原测定正常组与白血病组在骨髓或血浆中浓度差异均无显著性(P>0.05)，而PAI-1活性测定则白血病组高于正常对照者(P<0.01)。PAI-2正常人骨髓中表达显著高于白血病(P<0.001)，血浆中两者却相反(P<0.01)。
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3 讨论
急性髓性白血病常并发严重出血，其出血原因通常与血小板数量减少、功能异常、凝血因子异常和(或)DIC有关，但一部分病人与纤维蛋白溶解(纤溶亢进)有密切关系。主要机制可能是〔1〕：①某些类型白血病细胞直接产生tPA型或uPA型纤维酶原激活物，而激活纤溶酶系统引起原发性纤溶。②大量凝血酶和纤维蛋白激活纤溶酶原使其转变为纤溶酶从而引起继发性纤溶。Tapiovaara等〔2〕报道白血病患者骨髓单个核细胞uPA、tPA表达增加，并分为单纯表达uPA和uPA、tPA双表型两种形式。本文通过对急性髓性白血病患者及正常对照组的血浆和骨髓单个核细胞uPA、tPA及PAI抗原表达及血浆活性的观察，发现急性白血病患者的骨髓单个核细胞tPA表达低于正常人，而血浆中恰好相反。uPA正常对照组无表达，而白血病组骨髓中表达明显增高，血浆中亦明显高于正常人，均为uPA单表达型。由此证实了急性白血病患者其白血病细胞主要以表达uPA为主，且血浆中uPA同步增高〔3〕。而tPA主要由血管内皮细胞合成并释放，白血病患者骨髓单个核细胞不表达tPA。故tPA并非由白血病细胞直接产生，而是在白血病时血管内皮细胞受到损伤，诱发tPA的释放。tPA的局部纤溶作用强，全身纤溶作用弱。而uPA的作用则相反，全身性纤溶作用强，无局部纤溶作用或很弱。uPA与tPA有协同激活纤溶作用。所以白血病患者通过uPA、tPA的产生增高，导致纤溶亢进。近年来发现uPA、uPAR、PAI与肿瘤的浸润转移有密切相关〔4〕。uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，不仅通过激活纤溶酶原转变为纤溶酶，发挥纤溶效应，还降解大部分糖蛋白如纤维连接蛋白层素，凝血酶敏感蛋白以及4型胶原等。肿瘤细胞表达uPA可以通过上述结缔组织中成分的破坏，逐步向前移动，导致瘤细胞转移。PAI的作用恰好与上述机制相反。本文观察到急性髓性白血病细胞中uPA增加，PAI不增加，白血病细胞早期出现广泛组织的浸润可能与此有关。PAI-1主要由血管内皮细胞产生，血小板α颗粒中贮存着大量的PAI-1。当血小板受激活时，PAI-1大量从血小板中释放。其以两种形式存在：一是有活性，称为活性型PAI-1；二是无活性，称为潜在型PAI-1。我们观察到正常组与白血病组的PAI-1抗原在骨髓或血浆中浓度差异均无显著意义，而PAI-1活性测定则白血病组高于正常组，可能由于白血病患者PAI-1以活化型增高为主，而PAI-2正常人骨髓中高于白血病，血浆中则相反。机制可能是由于白血病患者血浆中uPA活性升高后使PAI-2的产生增加，从而反馈抑制uPA活性的调控机制有关。而正常骨髓中由于tPA，PAI均升高并达到平衡，使正常骨髓具有一定纤溶活性，保持组织流动性。■
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参考文献：
[1]Bennett B,Booth N A,Cnoll,et al.The bleeding disorder in acute promyelocytic leukaemia：fibrinolysis due to u-PA rather than defibrination.Br J Haematol,1989,7：511～517
[2]Tapiovaara H,Alitalo R,Stephens,et al.Abundant urokinase activity on the surface of mononuclear ceels from blood and bone marrow of acute leukemia patients.Blood,1994,82：914～919
[3]Tapiovaara H,Matikainen S,Hurme M,et al.Induction of differentiation of promyelocytic NB4 cells by retinoic acid is associated with rapid increase in urokinase activity subsequently downregulated by production of inhibitors.Blood,1994,83：1883～1889
[4]Dano K,Andreasen P A,Grondahl-Hansea,et al.Plasminogen activation,tissue degradation and cancer.Adv Cancer Res,1985,44：139～144
收稿 1999-06-28, http://www.100md.com