多发性硬化患者血清及脑脊液中可溶性Fas分子的测定
作者：周文斌 Hans Link
单位：周文斌(附属湘雅医院神经内科 长沙 410008)；Hans Link(瑞典卡罗林斯卡医学院Huddinge医院神经科)
关键词：多发性硬化；可溶性Fas分子*；血清；脑脊液
湖南医科大学学报000113 摘 要：应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测多发性硬化(MS) 患者血清及脑脊液(CSF)中的可溶性Fas分子(sFas)，对照组为其他神经病组(OND)及健康人(HC)。结果表明：MS患者组血清及CSF中sFas高于OND及HC组，且MS患者活动期sFas高于缓解期。提示sFas可能与MS的临床活跃有关，Fas分子可能在MS的免疫病理反应中扮演重要角色。
分类号：R744.51 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5625(2000)01-0039-03
Detection of the soluble form of the Fas molecule in patients
with multiple sclerosis
ZHOU Wen-bin, HANS Link
(Department of Neurology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University Chan gsha 410008)
Abstract：We examined the levels of the soluble form of the F as(sFas) in the cerebrospinal fluids(CSF) and the sera of patients with multiple sclerosis(MS) using an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). The levels of sera and CSF sFas were significantly higher in MS patients than that in other n eurological diseases(OND) group and healthy control(HC); MS patients in the acti ve stage had more sFas molecule than that in the inactive stage. It suggests tha t sera and CSF sFas may be related to clinical activity in patients with MS, and that sFas may play an important role in the pathogenesis of the MS.
, 百拇医药
Key words：multiple sclerosis;soluble Fas molecule*;se rum;cerebrospinal fluids▲
普遍认为多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)白 质的CD4+ T细胞介导的炎性脱髓鞘性疾病。它是一类自身免疫性疾病，但其有关的组织损伤 及细胞凋亡机制目前了解甚少。自身免疫机制导致对神经性抗原的攻击可能是其髓鞘损伤及 脱失的原因。Fas分子(CD95)位于多种细胞表面，属于TNF受体超家族，当它与抗Fas的抗体 或Fas配体(FasL)结合时即传递死亡信号，造成细胞的凋亡[1]。Fas介导的细胞凋 亡在自身免疫病的发病机制中起着关键性作用。研究发现，有Fas基因缺陷的小鼠易发生自 身免疫性疾病，系统性红斑狼疮(SLE)和风湿性关节炎(RA)患者的血清中可溶性Fas(sFas)分 子水平升高，给小鼠注入sFas可导致自身免疫病的发生[2]。目前国内外有关Fas 与MS发病关系的报道较少，笔者采用酶联免疫吸附法(ELISA)，检测了MS血清及脑脊液(CSF)中的sFas水平，以期探讨sFas在MS中的可能作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 MS组 临床诊断为MS患者45例，其中女30例，年龄为19～65(平均38) 岁。MS病人分成两组，活跃期35例(平均持续时间2.2年)，缓解期10例(时间7.5年)。活跃 期患者出现新的神经系统症状后，均在Hudding医院就诊。MS临床诊断依据临床表现、头部 磁共振(MRI)或CT以及CSF中的IgG寡克隆带[4]。
1.2 其他神经病(OND)组 30例，其中男12例，女18例，年龄32～76(平 均56)岁，包括脑梗死12例，病毒性脑膜炎4例，肌紧张性头痛6例，多发性神经病3例，单发 性神经病2例，面肌痉挛2例，三叉神经痛1例。
1.3 健康对照组(HC) 20名身体健康的医院工作人员。
1.4 标本处理 抽取CSF后，进行细胞总数及总蛋白量计数，2500r.m in-1离心，去除细胞。血及CSF标本均取自使用任何免疫抑制剂之前，标本收集后 迅速冻存于-70℃冰箱。
, 百拇医药
1.5 ELISA测定 采用sFas试剂盒(R&D公司.USA)检测。用pH7.4的PBS稀释 标本。血清标本按体积比1∶10，CSF按1∶1稀释，于已预包埋兔单克隆抗人sFas抗体的96孔 测试板内。每孔100μl，均为三复孔，用封板胶纸封住板孔。在室温下放置2h，PBS洗 板6次后加入生物素标记的抗sFas小鼠抗兔单克隆抗体100μl/孔，封住板孔，室温下静置 1h，再洗板6次，加入染色剂TMB，避光15～20min，变成蓝色后加入终止剂终止反应， 于酶标仪波长450mm处读取吸光度值。
1.6 sFas测定的标准曲线 按照试剂盒内标准品制成(附图)。
附图 sFas测定标准曲线
Fig. sFas standard curve
, 百拇医药
1.7 统计学 所有数据用均数±标准差(
±s)表示，采用Mamw hitne's U检验。
2 结 果
2.1 MS患者血清sFas水平 MS患者活跃期sFas水平显著高于MS缓解期、健 康对照组及OND组(见附表)。
2.2 MS患者脑脊液sFas水平 MS患者活跃期sFas及OND组sFas见附表。
附表 MS患者血清及脑脊液中sFas水平
(±s，ng .ml-1)
, 百拇医药
MS
OND
HC
活跃期
缓解期
血清
8.73±6.52①②③
3.20±2.90
3 .10±2.10
2.90±2.10
脑脊液
0.75±0.38①②
, 百拇医药
0.32±0.29
0.31±0.21
①与缓解期比较，P<0.01；②与OND组比较，P<0.01；③与HC组比较，P<0 .05
3 讨 论
MS是一类炎性脱髓鞘性自身免疫病。Fas基因是导致细胞凋亡的关键分子[5]。尽 管MS的CNS脱髓鞘机制仍不甚清楚，但自身免疫机制攻击少突胶质细胞，尤其T细胞介导的免 疫反应被认为扮演了重要角色。在MS中，病理发现包括巨噬细胞、细胞毒性T细胞浸润血管 周围，胶质细胞增生，组成髓鞘的少突胶质细胞受到攻击而被破坏[3]。在T细胞 的免疫反应中，活性T细胞的降解可能由Fas所诱导，而Fas介导的细胞毒T细胞更是溶细胞作 用产生的主要机制[6]。因此，由细胞毒T细胞所致的Fas-介导的细胞凋亡可能是 脱鞘鞘产生的主要原因。由于Fas主要表达在活化T细胞上[7]，故本研究的MS患者 血清及CSF中sFas水平升高，显示Fas/FasL系统介导的细胞凋亡机制可能参与MS的发病；而M S患者活跃期的血清及CSF中sFas高于缓解期则反映可能有较多的sFas从活跃期之活化T细胞 上脱落。在MS的动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的CNS中发现凋亡T细胞，且在 疾病的 高峰期凋亡细胞最多[8]。在MS脑组织脱髓鞘灶内浸润细胞CD4+/CD8+ T细胞及巨 噬细胞上均有FasL表达。当上述细胞在体外与带Fas的细胞相遇时可导致细胞损伤，而在正 常脑组织内未发现FasL表达细胞。提示Fas/FasL机制可能参与MS脱髓鞘病灶形成[3] 。Sameer D等亦报道在MS之脱髓灶中，少突胶质细胞上Fas表达增加，当自身反应性T细胞 的凋亡增加时即显示疾病恢复的开始[9]。据此认为，sFas水平增加提示MS活跃期 自身活化T细胞凋亡增加，而在MS缓解期中活化T细胞及巨噬细胞均减少，故sFas水平下降。 大量证据表明：Fas介导的细胞凋亡在免疫系统中起重要作用；在Lpr及gld鼠的基因突变 [10]以及近来报道的人Fas基因突变中，凋亡机能异常导致许多严重的免疫异常；s Fas有干扰Fas/FasL介导的细胞凋亡作用，抑制细胞毒T细胞介导的溶细胞作用及调节淋巴细 胞对自身抗原的活化增殖反应[2，12]。进一步研究sFas在MS中的调节作用可能 对MS的治疗提供有益的启示。
, 百拇医药
作者简介：周文斌(1965-)，男，主治医师
参考文献：
[1]Ito N, Yonehara S, Ishii A, et al. The polype ptide e ncoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis [J]. Cell, 1991,66:233-243.
[2]Cheng J, Zhou T, Liu C, et al. Protection from Fas-mediated apoptosi s by a soluble form of the Fas molecule[J]. Science, 1994,263:1759-1762.
[3]Dowling P, Shang G, Raval s, et al. Involvement of the CD95(APO-1/Fa s) receptor/ligand system in multiple sclerosis brain[J]. J Exp Med, 1996,184: 1513-1518.
, 百拇医药
[4]Poser CM, Paty DW, Scienberg L, et al. New diagnostic criteria for mu ltiple sclerosis: guidelines for research protcols[J]. Ann Neurol, 1983,13:227 -231.
[5]Oehm A, Behrmann I, Falk W, et al. Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor suprefamily: sequence identity with the Fas antigen[J] . J Biol Chem, 1992,267:10709-10715.
[6]Nagta S, Goldstein P. The Fas death factor[J]. Science, 1995,267:1449- 1456.
, 百拇医药
[7]Dhein J, Walczac H, Baumier C, et al. Autocrine T-cell suicide media ted by APO-1(Fas/CD95)[J]. Nature, 1995,373:438-441.
[8]McCombe PA, Nickson I, Tabi Z, et al. Apoptosis of Vb8.2T lymphocytes in the spinal cord during recovery from experimental autoimmune encephalomyelit is induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein[J]. J Neurol Sci, 1996,139:1-6.
[9]Sameer DD, Bonetti B, Balasingam V, et al. Multiple sclerosis: Fas si gnaling in oligodendrocyte cell death[J]. J Exp Med, 1996,184:2361-2370.
, 百拇医药
[10]Watanabe-fukunaga R, Brannan CL, Copealand NG, et al. Lymph oproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediate sapoptosis[J]. Nature, 1992,356:314-317.
[11]Rieux-Laucat F, Le Deist F, Hivroz C, et al. Mutations in Fas assoc iated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity[J]. Science, 1995,81:935-946.
[12]Hanabuchi S, Koyanagi M, Kawasaki A, et al. [J]. Fas and its ligand in a general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:4930-4934.
收稿日期：1998-12-01, 百拇医药
单位：周文斌(附属湘雅医院神经内科 长沙 410008)；Hans Link(瑞典卡罗林斯卡医学院Huddinge医院神经科)
关键词：多发性硬化；可溶性Fas分子*；血清；脑脊液
湖南医科大学学报000113 摘 要：应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测多发性硬化(MS) 患者血清及脑脊液(CSF)中的可溶性Fas分子(sFas)，对照组为其他神经病组(OND)及健康人(HC)。结果表明：MS患者组血清及CSF中sFas高于OND及HC组，且MS患者活动期sFas高于缓解期。提示sFas可能与MS的临床活跃有关，Fas分子可能在MS的免疫病理反应中扮演重要角色。
分类号：R744.51 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-5625(2000)01-0039-03
Detection of the soluble form of the Fas molecule in patients
with multiple sclerosis
ZHOU Wen-bin, HANS Link
(Department of Neurology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University Chan gsha 410008)
Abstract：We examined the levels of the soluble form of the F as(sFas) in the cerebrospinal fluids(CSF) and the sera of patients with multiple sclerosis(MS) using an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). The levels of sera and CSF sFas were significantly higher in MS patients than that in other n eurological diseases(OND) group and healthy control(HC); MS patients in the acti ve stage had more sFas molecule than that in the inactive stage. It suggests tha t sera and CSF sFas may be related to clinical activity in patients with MS, and that sFas may play an important role in the pathogenesis of the MS.
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Key words：multiple sclerosis;soluble Fas molecule*;se rum;cerebrospinal fluids▲
普遍认为多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)白 质的CD4+ T细胞介导的炎性脱髓鞘性疾病。它是一类自身免疫性疾病，但其有关的组织损伤 及细胞凋亡机制目前了解甚少。自身免疫机制导致对神经性抗原的攻击可能是其髓鞘损伤及 脱失的原因。Fas分子(CD95)位于多种细胞表面，属于TNF受体超家族，当它与抗Fas的抗体 或Fas配体(FasL)结合时即传递死亡信号，造成细胞的凋亡[1]。Fas介导的细胞凋 亡在自身免疫病的发病机制中起着关键性作用。研究发现，有Fas基因缺陷的小鼠易发生自 身免疫性疾病，系统性红斑狼疮(SLE)和风湿性关节炎(RA)患者的血清中可溶性Fas(sFas)分 子水平升高，给小鼠注入sFas可导致自身免疫病的发生[2]。目前国内外有关Fas 与MS发病关系的报道较少，笔者采用酶联免疫吸附法(ELISA)，检测了MS血清及脑脊液(CSF)中的sFas水平，以期探讨sFas在MS中的可能作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 MS组 临床诊断为MS患者45例，其中女30例，年龄为19～65(平均38) 岁。MS病人分成两组，活跃期35例(平均持续时间2.2年)，缓解期10例(时间7.5年)。活跃 期患者出现新的神经系统症状后，均在Hudding医院就诊。MS临床诊断依据临床表现、头部 磁共振(MRI)或CT以及CSF中的IgG寡克隆带[4]。
1.2 其他神经病(OND)组 30例，其中男12例，女18例，年龄32～76(平 均56)岁，包括脑梗死12例，病毒性脑膜炎4例，肌紧张性头痛6例，多发性神经病3例，单发 性神经病2例，面肌痉挛2例，三叉神经痛1例。
1.3 健康对照组(HC) 20名身体健康的医院工作人员。
1.4 标本处理 抽取CSF后，进行细胞总数及总蛋白量计数，2500r.m in-1离心，去除细胞。血及CSF标本均取自使用任何免疫抑制剂之前，标本收集后 迅速冻存于-70℃冰箱。
, 百拇医药
1.5 ELISA测定 采用sFas试剂盒(R&D公司.USA)检测。用pH7.4的PBS稀释 标本。血清标本按体积比1∶10，CSF按1∶1稀释，于已预包埋兔单克隆抗人sFas抗体的96孔 测试板内。每孔100μl，均为三复孔，用封板胶纸封住板孔。在室温下放置2h，PBS洗 板6次后加入生物素标记的抗sFas小鼠抗兔单克隆抗体100μl/孔，封住板孔，室温下静置 1h，再洗板6次，加入染色剂TMB，避光15～20min，变成蓝色后加入终止剂终止反应， 于酶标仪波长450mm处读取吸光度值。
1.6 sFas测定的标准曲线 按照试剂盒内标准品制成(附图)。
附图 sFas测定标准曲线
Fig. sFas standard curve
, 百拇医药
1.7 统计学 所有数据用均数±标准差(
±s)表示，采用Mamw hitne's U检验。2 结 果
2.1 MS患者血清sFas水平 MS患者活跃期sFas水平显著高于MS缓解期、健 康对照组及OND组(见附表)。
2.2 MS患者脑脊液sFas水平 MS患者活跃期sFas及OND组sFas见附表。
附表 MS患者血清及脑脊液中sFas水平
(
±s，ng .ml-1), 百拇医药
MS
OND
HC
活跃期
缓解期
血清
8.73±6.52①②③
3.20±2.90
3 .10±2.10
2.90±2.10
脑脊液
0.75±0.38①②
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0.32±0.29
0.31±0.21
①与缓解期比较，P<0.01；②与OND组比较，P<0.01；③与HC组比较，P<0 .05
3 讨 论
MS是一类炎性脱髓鞘性自身免疫病。Fas基因是导致细胞凋亡的关键分子[5]。尽 管MS的CNS脱髓鞘机制仍不甚清楚，但自身免疫机制攻击少突胶质细胞，尤其T细胞介导的免 疫反应被认为扮演了重要角色。在MS中，病理发现包括巨噬细胞、细胞毒性T细胞浸润血管 周围，胶质细胞增生，组成髓鞘的少突胶质细胞受到攻击而被破坏[3]。在T细胞 的免疫反应中，活性T细胞的降解可能由Fas所诱导，而Fas介导的细胞毒T细胞更是溶细胞作 用产生的主要机制[6]。因此，由细胞毒T细胞所致的Fas-介导的细胞凋亡可能是 脱鞘鞘产生的主要原因。由于Fas主要表达在活化T细胞上[7]，故本研究的MS患者 血清及CSF中sFas水平升高，显示Fas/FasL系统介导的细胞凋亡机制可能参与MS的发病；而M S患者活跃期的血清及CSF中sFas高于缓解期则反映可能有较多的sFas从活跃期之活化T细胞 上脱落。在MS的动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的CNS中发现凋亡T细胞，且在 疾病的 高峰期凋亡细胞最多[8]。在MS脑组织脱髓鞘灶内浸润细胞CD4+/CD8+ T细胞及巨 噬细胞上均有FasL表达。当上述细胞在体外与带Fas的细胞相遇时可导致细胞损伤，而在正 常脑组织内未发现FasL表达细胞。提示Fas/FasL机制可能参与MS脱髓鞘病灶形成[3] 。Sameer D等亦报道在MS之脱髓灶中，少突胶质细胞上Fas表达增加，当自身反应性T细胞 的凋亡增加时即显示疾病恢复的开始[9]。据此认为，sFas水平增加提示MS活跃期 自身活化T细胞凋亡增加，而在MS缓解期中活化T细胞及巨噬细胞均减少，故sFas水平下降。 大量证据表明：Fas介导的细胞凋亡在免疫系统中起重要作用；在Lpr及gld鼠的基因突变 [10]以及近来报道的人Fas基因突变中，凋亡机能异常导致许多严重的免疫异常；s Fas有干扰Fas/FasL介导的细胞凋亡作用，抑制细胞毒T细胞介导的溶细胞作用及调节淋巴细 胞对自身抗原的活化增殖反应[2，12]。进一步研究sFas在MS中的调节作用可能 对MS的治疗提供有益的启示。
, 百拇医药
作者简介：周文斌(1965-)，男，主治医师
参考文献：
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[6]Nagta S, Goldstein P. The Fas death factor[J]. Science, 1995,267:1449- 1456.
, 百拇医药
[7]Dhein J, Walczac H, Baumier C, et al. Autocrine T-cell suicide media ted by APO-1(Fas/CD95)[J]. Nature, 1995,373:438-441.
[8]McCombe PA, Nickson I, Tabi Z, et al. Apoptosis of Vb8.2T lymphocytes in the spinal cord during recovery from experimental autoimmune encephalomyelit is induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein[J]. J Neurol Sci, 1996,139:1-6.
[9]Sameer DD, Bonetti B, Balasingam V, et al. Multiple sclerosis: Fas si gnaling in oligodendrocyte cell death[J]. J Exp Med, 1996,184:2361-2370.
, 百拇医药
[10]Watanabe-fukunaga R, Brannan CL, Copealand NG, et al. Lymph oproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediate sapoptosis[J]. Nature, 1992,356:314-317.
[11]Rieux-Laucat F, Le Deist F, Hivroz C, et al. Mutations in Fas assoc iated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity[J]. Science, 1995,81:935-946.
[12]Hanabuchi S, Koyanagi M, Kawasaki A, et al. [J]. Fas and its ligand in a general mechanism of T-cell-mediated cytotoxicity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:4930-4934.
收稿日期：1998-12-01, 百拇医药