肾移植病人配组淋巴细胞毒抗体的检测
作者：陈盛强 邓维意 欧阳峰 李留洋
单位：陈盛强 邓维意 欧阳峰(广州医学院神经科学研究所)；李留洋(广州市珠江医院肾移植科)
关键词：配组淋巴细胞毒抗体；微量淋巴细胞毒试验；淋巴细胞毒；交叉配合实验
广州医学院学报000110提要 目的：通过对肾移植病人的配组淋巴细胞毒抗体(panel reactive antibody PRA)的检测，了解与分析肾移植病人配组淋巴细胞毒抗体的差异。方法：以36名健康成人外周血淋巴细胞作为群体淋巴细胞来源。采用补体依赖微量淋巴细胞毒方法，检测病人血清中的配组淋巴细胞毒抗体。结果：55例病人进行血清淋巴细胞毒交叉配合实验检测，只有1例阳性1.82%。而PRA检测8例病人血清为阳性(6女2男)占14.5%。同时此群体中35例病人曾经输血，其中PRA阳性有6例(17.1%)，而未经输血病人20例，其中有2例PRA阳性(10%)。结论：男女病人的PRA结果有显著性差异(P<0.05)。而输血与未输血病人FRA值无显著性差异(P>0.05)。与淋巴细胞毒交叉配合实验对比较，PRA的检测能更准确预测病人体内致敏状况和抗体水平。
, 百拇医药
中图分类号 R617 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0039-04
The Detection of Panel Reactive Antibody in Patients
to Receive Renal Transplantation
Chen Shengqiang,Deng Weiyi,Ou Yangfeng
(Research Institute of Neurosciences,Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
Objective:To investigate the possible difference in the positive rates of panel reactive antibody (PRA) among different patients to receive renal transplantation. Methods:The peripheral blood lymphocytes from 36 healthy adults were used in the study. The serum PRA in patients was detected by using the method of complement-dependent micro-lymphocytotoxicity test. Results:Lymphocyte samples from 55 cases of patients were subject to serum lymphocytotoxicity cross matching test,only one case was found positive (1.82%);while by PRA detection serum from 8 cases (6 female and 2 male) showed positive (14.5%). In these patients 35 cases had ever received blood transfusion,of them 6 cases were PRA-positive (17.2%),while of the 20 cases who had never received blood transfusion only 2 cases were PRA-positive (10%). Conclusion:There was difference in the positive rates of PRA between female and male patients (P<0.05),while no difference was observed between patients having and not having received blood transfusion (P>0.05).Compared with serum lymphocytotoxicity cross test,the detection of PRA is more effective in accurately predicting the in vivo sensitization situation and antibody level in patients.
, 百拇医药
Key words Panel reactive antibody;Micro-lymphocytotoxicity test;Lymphocytotoxicity cross matching test
肾移植是晚期肾功能衰竭最佳治疗方法，面影响移植肾存活的主要原因是发生排斥，尤其是超急性排斥反应常造成移植肾不可逆损伤导致手术失败[1]。组织配型是为肾移植病人寻找合适供者，减小术后排斥反应产生，提高移植成功率的基本方法。ABO血型相配和淋巴细胞毒交叉配合实验在肾移植中的应用，使术后超急性排斥反应发生明显减小，但是加速性和急性排斥反应发生率依然很高。国内外研究发现，病人血清中的配组淋巴细胞毒抗体能够介导超急性和加速性排斥反应，导致移植物功能下降甚至供体肾丧失。因此，配组淋巴细胞毒抗体(PRA)的检测作为一种配型方法，对移植高危患者的筛选，预测术后排斥反应的发生，提高器官移植的成功率具有非常重要的价值。本文通过对肾移植病人的配组淋巴细胞毒抗体(PRA)的检测，了解与分析肾移植宿主配组淋巴细胞毒抗体的差异。现报道如下。1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验材料与病例
1.1.1 病例来源 1998年1月～1998年12月广州珠江医院肾移植术前病人血清55例。其中男性32例、女性23例，分为输血组(35例)与未输血组(2例)。平均年龄41岁(22～47岁)。
1.1.2 淋巴细胞来源 广州医学院HLA标准细胞库。
1.1.3 淋巴细胞分离 取36例健康成人已作HLA分型肝素抗凝血2m1，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用Hank′s液调至淋巴细胞悬液浓度为1500～200/μl。
1.1.4 补体 采用20只未经免疫接种家兔心脏血，混匀分装放-20℃保存。
1.1.5 试剂 伊红与福尔马林以及台盼蓝购自中国医药总公司。
, 百拇医药 2 方法
2.1 细胞活性检验 细胞活性以染料着色能力来判断。用伊红染色，2min后加入福尔马林液固定，根据细胞是否着色区分死活细胞。
2.2 淋巴细胞毒交叉配合实验 参照文献方法[3]基本如下：常规分离供体淋巴细胞，调整细胞浓度，加入受者血清，37℃孵育30min后加入兔补体，37℃再次孵育1h后，1%台盼蓝染色。计算200个细胞，以供体淋巴细胞作为对照，计算淋巴细胞死亡率。高于10%为阳性，低于10%为阴性。
2.3 PRA测定方法 参照文献中微量淋巴毒方法[3]，取泰萨奇板，依次每孔加入1μl血清，5μl石蜡油，1μl冻存淋巴细胞(2000个/孔)，1μl补体(每份血清重复一孔)，室温下(22℃～25℃)孵育1h后，每孔加入1μl伊红，2min后加入5μl福尔马林固定。每孔计算200个细胞，计算细胞死亡率，细胞死亡率高于10%作为阳性孔，阳性孔所占百分比为PRA值。当PRA值>50%表示病人处于高度致敏状态。
, 百拇医药
PRA原理： 将包含绝大部分HLA抗原的群体淋巴细胞点在泰萨奇板上，点上病人血清，孵育，加入补体根据细胞死亡率判断病人免疫状态(PRA水平)和HLA抗体的特异性。
2.4 统计学处理方法 计数资料以例数、百分数表示，采用卡方检验。
3 结果
3.1 对55例病人进行淋巴细胞毒交叉配合实验检测有54例病人CDC实验阴性，只有1例病人是阳性(占1.8%)。PRA检测结果显示有8例病人PRA为阳性(占14.5%)，其余47例为阴性。统计学分析表明CDC实验与PRA实验在显示病人体内致敏状况存在显著性差异(P<0.05)。见表1。
表1 肾移植病人淋巴细胞毒交叉
配合实验与PRA实验的比较 组别
, http://www.100md.com
阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
P
CDC
1
54
55
1.8
PRA
8
47
, http://www.100md.com 55
14.5
<0.01
3.2 对55例病人血清配组淋巴细胞毒抗体的检测，发现32例男性PRA阴性(93.7%)，有2例男性PRA阳性(6.3%)PRA值30～38%，23例女病人中17例阴性(73.9%)，有6例病人PRA呈现阳性(占26.1%)，其中有5例PRA值<50%幅度28～46%(占21.7%)，有1例病人PRA值达到61%(占4.3%)。通过统计学分析发现男女性病人PRA值有显著性差异(P<0.05)。见表2。表2 男女性病人PRA值的比较 组别
阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
, http://www.100md.com
P
男性
2
30
32
6.3
女性
6
17
23
26.1
合计
8
47
, http://www.100md.com
55
14.5
<0.05
3.3 对曾经输血35例病人检测其中PRA阳性有6例病人(17.1%)，PRA阳性率都<50%。未输血病人20例，其中有2例病人PRA是阳性(占10%)，其中有1例PRA值<50%(占5%)。另外1例PRA值>50%(占5%)。通过统计学处理发现曾经输血与未输血病人PRA值并没有显著性差异(P>0.05)。见表3。
表3 输血组与未输血组的比较 组别
阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
, 百拇医药
P
曾输血
6
29
35
17.1
未输血
2
18
20
10.0
合计
8
47
, http://www.100md.com
55
14.5
>0.05
4 讨论
4.1 淋巴细胞毒交叉配合实验是实体器官移植前组织配型，用于分析移植受者血清中抗计划供者淋巴细胞的抗体，过去一直认为淋巴细胞毒交叉配合实验是对肾脏移植效果最有影响的因素。淋巴细胞毒交叉配合实验阳性是移植的禁忌，但事实上淋巴细胞毒交叉配合实验相合的受者依然可能发生超急性或加速排斥反应，妨碍移植肾的功能期存活率。我们的实验结果表明CDC实验与PRA实验在显示病人体内致敏状况存在显著性差异，说明淋巴细胞毒交叉配合实验实验敏感性较低，对严重排斥反应的预测能力有限。这主要是因为淋巴细胞毒交叉配合实验检测病人体内是否有针对供者的HLA特定位点的抗体，并不能全面反映体内HLA抗体水平。同时因为HLA抗原之间的交叉反应较多，即使淋巴细胞毒交叉配合实验完全相合，也不能完全避免加速性和急性排斥反应。而PRA是以群体淋巴细胞作为靶细胞，绝大部分HLA位点包括在内，以补体依赖微量淋巴细胞毒性实验对体内存在的HLA抗体进行检测。因此PRA可以弥补淋巴细胞毒交叉配合实验的不足。高PRA受者HLA体液致敏状态的水平是承担抗移植物免疫应答的重要角色，对于选择非致敏移植受者，能够有效地避免不可逆转的排斥反应的发生。
, 百拇医药
4.2 根据上述资料，PRA阳性率与性别存在显著性差异，女性病人PRA阳性率较高，其中1例病人的PRA值高达61%，显示该病人处于高致敏状态。同时我们发现PRA峰值上升男性病人比例逐期减小，女性病人比例逐渐增加。特别是女性病人有妊娠史者PRA阳性率高。说明妊娠是产生PRA的原因。
4.3 肾移植术前由于病人肾功能衰竭导致体内毒物堆积或肾脏分泌的促红细胞生成素减少出现贫血症状，经过输血得以改善，但可能导致机体产生针对HLA的配组淋巴细胞毒抗体。我们对输血组与未输血组病人的PRA值作监测，发现有4例病人随着输血次数的增加PRA随之增高，但没有超过50%。停止输血后1～2个月后出现下降。另外2例的PRA值并没有随输血次数增加而增大，基本维持不变。曾输血组中的3例病人经过多次输血后并没有产生高PRA应答，但有2例未输血患者产生PRA应答。其中1例病人PRA值>50%。统计表明输血与未输血病人PRA阳性率无显著差异，这与文献报道一致[4]。
, 百拇医药 作者简介：陈盛强，男(1966.6-)，学士，助理研究员。研究方向：免疫遗传。
参考文献
[1]陈劲松.肾移植受者的选择与准备.肾脏病与透析[J].肾移植杂志，1994；2：144～48
[2]Terasaki PI,Mcclelland JD.Microdroplet assay of human serum cytotoxins[J].Nature,1996;2:908
[3]戴春笋，杨浚伟，刘志红等.配组淋巴细胞毒抗体检测在肾移值中的应用[J].肾脏病与透析肾移植杂志.1998；7：123～28
[4]肖露露，肖巧珍，张仕光等.配组淋巴细胞毒抗体检测-附180例报告[J].中国免疫学杂志.1990;9：249～31
, 百拇医药
[5]肖露露，张升，叶欣等.肾脏移植受者HLA体液致敏对移植物的影响[J].中华器官移植杂志.1996；12：239～42
[6]肖露露，张升，叶欣等.良好的HLA配型改善高敏受者的移植效果一例报告[J].中国肾脏病杂志，1996；12：389～92
[7]赵明.PRA检测筛选肾移植致敏受者的研究进展[J].国外医学.泌尿系统分册，1996；16：102～104
[8]Tahir MT,Mehra NK.Effect of panel reactive antibody on live related donor kidney transplatation;Indian experience[J].Transpl Immunol,1994;2(3):238～41
[9]Spesiser DE,Jeannet M.Renal transplantation to sensitized patients:decreased graft historical cr survival probability associates with a positivessmatch[J].Transpl Immunol,1995;3(4):334～36
[10]Helmut E,Feucht GO.The humoral immune response towards HLA class Ⅱ determiants inrenal transplantation[J].Kindey Int,1996;50:1464～66
(收稿：1999-10-23), http://www.100md.com
单位：陈盛强 邓维意 欧阳峰(广州医学院神经科学研究所)；李留洋(广州市珠江医院肾移植科)
关键词：配组淋巴细胞毒抗体；微量淋巴细胞毒试验；淋巴细胞毒；交叉配合实验
广州医学院学报000110提要 目的：通过对肾移植病人的配组淋巴细胞毒抗体(panel reactive antibody PRA)的检测，了解与分析肾移植病人配组淋巴细胞毒抗体的差异。方法：以36名健康成人外周血淋巴细胞作为群体淋巴细胞来源。采用补体依赖微量淋巴细胞毒方法，检测病人血清中的配组淋巴细胞毒抗体。结果：55例病人进行血清淋巴细胞毒交叉配合实验检测，只有1例阳性1.82%。而PRA检测8例病人血清为阳性(6女2男)占14.5%。同时此群体中35例病人曾经输血，其中PRA阳性有6例(17.1%)，而未经输血病人20例，其中有2例PRA阳性(10%)。结论：男女病人的PRA结果有显著性差异(P<0.05)。而输血与未输血病人FRA值无显著性差异(P>0.05)。与淋巴细胞毒交叉配合实验对比较，PRA的检测能更准确预测病人体内致敏状况和抗体水平。
, 百拇医药
中图分类号 R617 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0039-04
The Detection of Panel Reactive Antibody in Patients
to Receive Renal Transplantation
Chen Shengqiang,Deng Weiyi,Ou Yangfeng
(Research Institute of Neurosciences,Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
Objective:To investigate the possible difference in the positive rates of panel reactive antibody (PRA) among different patients to receive renal transplantation. Methods:The peripheral blood lymphocytes from 36 healthy adults were used in the study. The serum PRA in patients was detected by using the method of complement-dependent micro-lymphocytotoxicity test. Results:Lymphocyte samples from 55 cases of patients were subject to serum lymphocytotoxicity cross matching test,only one case was found positive (1.82%);while by PRA detection serum from 8 cases (6 female and 2 male) showed positive (14.5%). In these patients 35 cases had ever received blood transfusion,of them 6 cases were PRA-positive (17.2%),while of the 20 cases who had never received blood transfusion only 2 cases were PRA-positive (10%). Conclusion:There was difference in the positive rates of PRA between female and male patients (P<0.05),while no difference was observed between patients having and not having received blood transfusion (P>0.05).Compared with serum lymphocytotoxicity cross test,the detection of PRA is more effective in accurately predicting the in vivo sensitization situation and antibody level in patients.
, 百拇医药
Key words Panel reactive antibody;Micro-lymphocytotoxicity test;Lymphocytotoxicity cross matching test
肾移植是晚期肾功能衰竭最佳治疗方法，面影响移植肾存活的主要原因是发生排斥，尤其是超急性排斥反应常造成移植肾不可逆损伤导致手术失败[1]。组织配型是为肾移植病人寻找合适供者，减小术后排斥反应产生，提高移植成功率的基本方法。ABO血型相配和淋巴细胞毒交叉配合实验在肾移植中的应用，使术后超急性排斥反应发生明显减小，但是加速性和急性排斥反应发生率依然很高。国内外研究发现，病人血清中的配组淋巴细胞毒抗体能够介导超急性和加速性排斥反应，导致移植物功能下降甚至供体肾丧失。因此，配组淋巴细胞毒抗体(PRA)的检测作为一种配型方法，对移植高危患者的筛选，预测术后排斥反应的发生，提高器官移植的成功率具有非常重要的价值。本文通过对肾移植病人的配组淋巴细胞毒抗体(PRA)的检测，了解与分析肾移植宿主配组淋巴细胞毒抗体的差异。现报道如下。1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验材料与病例
1.1.1 病例来源 1998年1月～1998年12月广州珠江医院肾移植术前病人血清55例。其中男性32例、女性23例，分为输血组(35例)与未输血组(2例)。平均年龄41岁(22～47岁)。
1.1.2 淋巴细胞来源 广州医学院HLA标准细胞库。
1.1.3 淋巴细胞分离 取36例健康成人已作HLA分型肝素抗凝血2m1，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用Hank′s液调至淋巴细胞悬液浓度为1500～200/μl。
1.1.4 补体 采用20只未经免疫接种家兔心脏血，混匀分装放-20℃保存。
1.1.5 试剂 伊红与福尔马林以及台盼蓝购自中国医药总公司。
, 百拇医药 2 方法
2.1 细胞活性检验 细胞活性以染料着色能力来判断。用伊红染色，2min后加入福尔马林液固定，根据细胞是否着色区分死活细胞。
2.2 淋巴细胞毒交叉配合实验 参照文献方法[3]基本如下：常规分离供体淋巴细胞，调整细胞浓度，加入受者血清，37℃孵育30min后加入兔补体，37℃再次孵育1h后，1%台盼蓝染色。计算200个细胞，以供体淋巴细胞作为对照，计算淋巴细胞死亡率。高于10%为阳性，低于10%为阴性。
2.3 PRA测定方法 参照文献中微量淋巴毒方法[3]，取泰萨奇板，依次每孔加入1μl血清，5μl石蜡油，1μl冻存淋巴细胞(2000个/孔)，1μl补体(每份血清重复一孔)，室温下(22℃～25℃)孵育1h后，每孔加入1μl伊红，2min后加入5μl福尔马林固定。每孔计算200个细胞，计算细胞死亡率，细胞死亡率高于10%作为阳性孔，阳性孔所占百分比为PRA值。当PRA值>50%表示病人处于高度致敏状态。
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PRA原理： 将包含绝大部分HLA抗原的群体淋巴细胞点在泰萨奇板上，点上病人血清，孵育，加入补体根据细胞死亡率判断病人免疫状态(PRA水平)和HLA抗体的特异性。
2.4 统计学处理方法 计数资料以例数、百分数表示，采用卡方检验。
3 结果
3.1 对55例病人进行淋巴细胞毒交叉配合实验检测有54例病人CDC实验阴性，只有1例病人是阳性(占1.8%)。PRA检测结果显示有8例病人PRA为阳性(占14.5%)，其余47例为阴性。统计学分析表明CDC实验与PRA实验在显示病人体内致敏状况存在显著性差异(P<0.05)。见表1。
表1 肾移植病人淋巴细胞毒交叉
配合实验与PRA实验的比较 组别
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阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
P
CDC
1
54
55
1.8
PRA
8
47
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14.5
<0.01
3.2 对55例病人血清配组淋巴细胞毒抗体的检测，发现32例男性PRA阴性(93.7%)，有2例男性PRA阳性(6.3%)PRA值30～38%，23例女病人中17例阴性(73.9%)，有6例病人PRA呈现阳性(占26.1%)，其中有5例PRA值<50%幅度28～46%(占21.7%)，有1例病人PRA值达到61%(占4.3%)。通过统计学分析发现男女性病人PRA值有显著性差异(P<0.05)。见表2。表2 男女性病人PRA值的比较 组别
阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
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P
男性
2
30
32
6.3
女性
6
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26.1
合计
8
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3.3 对曾经输血35例病人检测其中PRA阳性有6例病人(17.1%)，PRA阳性率都<50%。未输血病人20例，其中有2例病人PRA是阳性(占10%)，其中有1例PRA值<50%(占5%)。另外1例PRA值>50%(占5%)。通过统计学处理发现曾经输血与未输血病人PRA值并没有显著性差异(P>0.05)。见表3。
表3 输血组与未输血组的比较 组别
阳性例数
阴性例数
合计
阳性率%
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P
曾输血
6
29
35
17.1
未输血
2
18
20
10.0
合计
8
47
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4 讨论
4.1 淋巴细胞毒交叉配合实验是实体器官移植前组织配型，用于分析移植受者血清中抗计划供者淋巴细胞的抗体，过去一直认为淋巴细胞毒交叉配合实验是对肾脏移植效果最有影响的因素。淋巴细胞毒交叉配合实验阳性是移植的禁忌，但事实上淋巴细胞毒交叉配合实验相合的受者依然可能发生超急性或加速排斥反应，妨碍移植肾的功能期存活率。我们的实验结果表明CDC实验与PRA实验在显示病人体内致敏状况存在显著性差异，说明淋巴细胞毒交叉配合实验实验敏感性较低，对严重排斥反应的预测能力有限。这主要是因为淋巴细胞毒交叉配合实验检测病人体内是否有针对供者的HLA特定位点的抗体，并不能全面反映体内HLA抗体水平。同时因为HLA抗原之间的交叉反应较多，即使淋巴细胞毒交叉配合实验完全相合，也不能完全避免加速性和急性排斥反应。而PRA是以群体淋巴细胞作为靶细胞，绝大部分HLA位点包括在内，以补体依赖微量淋巴细胞毒性实验对体内存在的HLA抗体进行检测。因此PRA可以弥补淋巴细胞毒交叉配合实验的不足。高PRA受者HLA体液致敏状态的水平是承担抗移植物免疫应答的重要角色，对于选择非致敏移植受者，能够有效地避免不可逆转的排斥反应的发生。
, 百拇医药
4.2 根据上述资料，PRA阳性率与性别存在显著性差异，女性病人PRA阳性率较高，其中1例病人的PRA值高达61%，显示该病人处于高致敏状态。同时我们发现PRA峰值上升男性病人比例逐期减小，女性病人比例逐渐增加。特别是女性病人有妊娠史者PRA阳性率高。说明妊娠是产生PRA的原因。
4.3 肾移植术前由于病人肾功能衰竭导致体内毒物堆积或肾脏分泌的促红细胞生成素减少出现贫血症状，经过输血得以改善，但可能导致机体产生针对HLA的配组淋巴细胞毒抗体。我们对输血组与未输血组病人的PRA值作监测，发现有4例病人随着输血次数的增加PRA随之增高，但没有超过50%。停止输血后1～2个月后出现下降。另外2例的PRA值并没有随输血次数增加而增大，基本维持不变。曾输血组中的3例病人经过多次输血后并没有产生高PRA应答，但有2例未输血患者产生PRA应答。其中1例病人PRA值>50%。统计表明输血与未输血病人PRA阳性率无显著差异，这与文献报道一致[4]。
, 百拇医药 作者简介：陈盛强，男(1966.6-)，学士，助理研究员。研究方向：免疫遗传。
参考文献
[1]陈劲松.肾移植受者的选择与准备.肾脏病与透析[J].肾移植杂志，1994；2：144～48
[2]Terasaki PI,Mcclelland JD.Microdroplet assay of human serum cytotoxins[J].Nature,1996;2:908
[3]戴春笋，杨浚伟，刘志红等.配组淋巴细胞毒抗体检测在肾移值中的应用[J].肾脏病与透析肾移植杂志.1998；7：123～28
[4]肖露露，肖巧珍，张仕光等.配组淋巴细胞毒抗体检测-附180例报告[J].中国免疫学杂志.1990;9：249～31
, 百拇医药
[5]肖露露，张升，叶欣等.肾脏移植受者HLA体液致敏对移植物的影响[J].中华器官移植杂志.1996；12：239～42
[6]肖露露，张升，叶欣等.良好的HLA配型改善高敏受者的移植效果一例报告[J].中国肾脏病杂志，1996；12：389～92
[7]赵明.PRA检测筛选肾移植致敏受者的研究进展[J].国外医学.泌尿系统分册，1996；16：102～104
[8]Tahir MT,Mehra NK.Effect of panel reactive antibody on live related donor kidney transplatation;Indian experience[J].Transpl Immunol,1994;2(3):238～41
[9]Spesiser DE,Jeannet M.Renal transplantation to sensitized patients:decreased graft historical cr survival probability associates with a positivessmatch[J].Transpl Immunol,1995;3(4):334～36
[10]Helmut E,Feucht GO.The humoral immune response towards HLA class Ⅱ determiants inrenal transplantation[J].Kindey Int,1996;50:1464～66
(收稿：1999-10-23), http://www.100md.com