抗乳腺癌单抗CDI 315B可变区基因的序列分析
作者：樊晓晖 Natasa Kopitar-Jerala Franc Gubensek
单位：樊晓晖(广西医科大学微生物学与免疫学教研室 南宁 530021)；Natasa Kopitar-Jerala Franc Gubensek(Dept.of Biochemistry and M olecular Biology,Jozef Stefan Institute,Slovenia)
关键词：抗乳腺癌单克隆抗体；可变区基因；序列分析
广西医科大学学报000124
摘要 目的：克隆抗乳腺癌CDI 315B单抗可变区基因，并对其进行 序列分析。方法：利用前导肽序列设计引物，采用RT-PCR技术从分泌抗人乳腺 癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI 315B 分离克隆了抗体轻重链可变区基因，用Sanger双脱 氧末端终止法测定扩增的CDI 315B单抗VK和VH基因的序列,对其进行序列分析。结果：和国际标准的小鼠Kabat 分类体系进行对比分析，CDI 315B 单抗的VK属于第4或第5组的第6亚组(VI)；CDI 315B单抗的VH则属于第2族(VH2)。结论：抗乳腺癌CDI 315B单抗可变区基因的克隆及序列分析为构建 人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链打下基础。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 Q753
SEQUENCE OF V ARIABLE VREGION GENES FOR ANTI-BREAST CANCER McAb CDI 31 5B
Fan Xiaohui,Natasa Kopitar-Jerala，Franc Gubensek
(Dept. of Micr obiology and Immunology,Guangxi Medical University,Nanning 530021 China)
Abstract Objective:To clone and sequence the V region genes o f anti-breast cancer McAb CDI 315B.Methods:The entire VH and VK genes of anti-breast cancer McAb CDI 315B were amplified by RT-PCR method from CDI 315B hybridoma cell,usin g 5′primer and 3′primer as leader sequences for the light chain gene and heavy chain gene,respectively.Their nucleotide sequences were determined using Sange r′s method.Results:The cDNA sequences of VH and VK region genes were compared to the murine sequences from Kabat database,in which the CDI 315B VK region belongs to the 4/5 group VK subgroup VI and the CDI 315 VH region bel ongs to VH2 family.Conclusion:This result will lay a foundation for the construct ion of CDI 315B human-mouse chimeric light chain and heavy chain.
, 百拇医药
Key words:anti-breast cancer McAb;V region genes;sequence
自1975年单克隆抗体问世[1]以来，在医学领域里，鼠源性单克隆抗体得到广 泛应用，既可用于体外的临床检测，也可用在体内的肿瘤导向治疗上。由于鼠源性单克隆抗 体为异种蛋白，应用于人体可引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody,HAMA)反 应，限制其在临床上的广泛应用。近年来兴起的单克隆抗体技术，研制出人源化的重组单克 隆抗体大大减少HAMA反应[2，3]。为组建人鼠嵌合的单克隆抗体，我们利用RT-PC R技术从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤CDI 315B细胞株分离克隆抗体轻重链可变区基 因序列，对其进行序列分析。
1 材料和方法
1.1材料：CDI 315B单抗杂交瘤细胞株，由Jozef Stefan 研究所免疫研究室保存；T4DN A连接酶、限制性内切酶及Taq酶(New England Biolabs 公司，美国)。
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1.2 寡核苷酸引物的设计：
轻链：5′端引物：GTGTGCACTCTGATATTGT-
GATGACGCAGGCTGCATT
3′端引物：GGATACAGTTGGTGCAGC
重链：5′端引物：GTGTGCACTCTGAGGGTGC-
AGCAG
3′端引物：TGGTGCACGCAGAGGAGA-
CGGT
1.3 VK和基因的扩增及克隆：参照Trizol Regent Kit说明书的方法，从1X108 CDI31 5B单抗杂交瘤细胞中提取RNA，以RT-PCR法扩增。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收后， 克隆到pUC19载体上。
, 百拇医药
1.4 DNA序列的测定和分析：采用Sanger双脱氧末端终止法测定扩增CDI 315B单抗VK和V H基因的序列。
2 结 果
CDI 315B单抗VK和VH基因的克隆及序列分析：从CDI 315B单抗杂交瘤细胞中分离到 总RNA，用RT-PCR和PCR扩增VK和VH基因，将VK和VH分别克隆到pUC19,测序结果如 下：
Fig 1 The VK gene nucleotides and amino acids sequences for the CDI 315B(A) & The gene nucleotides and amino acids sequences for the CDI 315B(B)
, 百拇医药
Complementarity determing regions (CDR) are underlined some deduced amino acids .
3 讨 论
肿瘤细胞的抗体已用在临床肿瘤的特异治疗上，因鼠源性单克隆抗体对人体有较强的免 疫原性，限制它在人体的应用；人源化单克隆抗体因其大大降低对人体的免疫原性而应用前 景较广阔，近年来，用基因工程抗体技术生产的人源化单克隆抗体的研究发展很快，国外已 有20多种嵌合人源单克隆抗体用于临床试验[4]。笔者克隆乳腺癌CDI 315B单抗的V K和VH基因，对其进行序列分析，和国际标准的小鼠单抗Kabat 分类体系[5]进 行对比分析，CDI 315B单抗的VK属于第4或第5组的第6亚组(VI)，CDI 315B单抗的VH则 属于第2族(VH2)。我们将利用这一结果进一步组建人源化乳腺癌CDI 315B单克隆抗体。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Kohler G，Milstein C.Continuous culture of fused cells sec- reting antibody of pre-defined specificity.Nature,1975,256:495 -497.
2，Morrison SL,Johnson MJ,Herzenberg LA,et al.Chimeric human antibody mo lecular: mouse antigen-binding domains with human constant region domains.Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:6 851-6 965.
3，Neuberger MS,Williams GT,Mitchell EB,et al.A hapten
, http://www.100md.com
-specific chime ric IgE antibody with human physiological effector function.Nature,1985,314:268 -270.
4，Tristan JV,Janek O，Philip RT.Human antibodies design.Nature Biot ehnology,1998,16:535-539.
5，Kabat EA,Wu TT,Perry HM,et al.Sequence of proteins of immunological i nterest.5th edition .USA Department of Health and Human Service,Bethesda,1991 .
收稿日期：1998-08-11, http://www.100md.com
单位：樊晓晖(广西医科大学微生物学与免疫学教研室 南宁 530021)；Natasa Kopitar-Jerala Franc Gubensek(Dept.of Biochemistry and M olecular Biology,Jozef Stefan Institute,Slovenia)
关键词：抗乳腺癌单克隆抗体；可变区基因；序列分析
广西医科大学学报000124
摘要 目的：克隆抗乳腺癌CDI 315B单抗可变区基因，并对其进行 序列分析。方法：利用前导肽序列设计引物，采用RT-PCR技术从分泌抗人乳腺 癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI 315B 分离克隆了抗体轻重链可变区基因，用Sanger双脱 氧末端终止法测定扩增的CDI 315B单抗VK和VH基因的序列,对其进行序列分析。结果：和国际标准的小鼠Kabat 分类体系进行对比分析，CDI 315B 单抗的VK属于第4或第5组的第6亚组(VI)；CDI 315B单抗的VH则属于第2族(VH2)。结论：抗乳腺癌CDI 315B单抗可变区基因的克隆及序列分析为构建 人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链打下基础。
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中国图书资料分类法分类号 Q753
SEQUENCE OF V ARIABLE VREGION GENES FOR ANTI-BREAST CANCER McAb CDI 31 5B
Fan Xiaohui,Natasa Kopitar-Jerala，Franc Gubensek
(Dept. of Micr obiology and Immunology,Guangxi Medical University,Nanning 530021 China)
Abstract Objective:To clone and sequence the V region genes o f anti-breast cancer McAb CDI 315B.Methods:The entire VH and VK genes of anti-breast cancer McAb CDI 315B were amplified by RT-PCR method from CDI 315B hybridoma cell,usin g 5′primer and 3′primer as leader sequences for the light chain gene and heavy chain gene,respectively.Their nucleotide sequences were determined using Sange r′s method.Results:The cDNA sequences of VH and VK region genes were compared to the murine sequences from Kabat database,in which the CDI 315B VK region belongs to the 4/5 group VK subgroup VI and the CDI 315 VH region bel ongs to VH2 family.Conclusion:This result will lay a foundation for the construct ion of CDI 315B human-mouse chimeric light chain and heavy chain.
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Key words:anti-breast cancer McAb;V region genes;sequence
自1975年单克隆抗体问世[1]以来，在医学领域里，鼠源性单克隆抗体得到广 泛应用，既可用于体外的临床检测，也可用在体内的肿瘤导向治疗上。由于鼠源性单克隆抗 体为异种蛋白，应用于人体可引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody,HAMA)反 应，限制其在临床上的广泛应用。近年来兴起的单克隆抗体技术，研制出人源化的重组单克 隆抗体大大减少HAMA反应[2，3]。为组建人鼠嵌合的单克隆抗体，我们利用RT-PC R技术从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤CDI 315B细胞株分离克隆抗体轻重链可变区基 因序列，对其进行序列分析。
1 材料和方法
1.1材料：CDI 315B单抗杂交瘤细胞株，由Jozef Stefan 研究所免疫研究室保存；T4DN A连接酶、限制性内切酶及Taq酶(New England Biolabs 公司，美国)。
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1.2 寡核苷酸引物的设计：
轻链：5′端引物：GTGTGCACTCTGATATTGT-
GATGACGCAGGCTGCATT
3′端引物：GGATACAGTTGGTGCAGC
重链：5′端引物：GTGTGCACTCTGAGGGTGC-
AGCAG
3′端引物：TGGTGCACGCAGAGGAGA-
CGGT
1.3 VK和基因的扩增及克隆：参照Trizol Regent Kit说明书的方法，从1X108 CDI31 5B单抗杂交瘤细胞中提取RNA，以RT-PCR法扩增。PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化回收后， 克隆到pUC19载体上。
, 百拇医药
1.4 DNA序列的测定和分析：采用Sanger双脱氧末端终止法测定扩增CDI 315B单抗VK和V H基因的序列。
2 结 果
CDI 315B单抗VK和VH基因的克隆及序列分析：从CDI 315B单抗杂交瘤细胞中分离到 总RNA，用RT-PCR和PCR扩增VK和VH基因，将VK和VH分别克隆到pUC19,测序结果如 下：
Fig 1 The VK gene nucleotides and amino acids sequences for the CDI 315B(A) & The gene nucleotides and amino acids sequences for the CDI 315B(B)
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Complementarity determing regions (CDR) are underlined some deduced amino acids .
3 讨 论
肿瘤细胞的抗体已用在临床肿瘤的特异治疗上，因鼠源性单克隆抗体对人体有较强的免 疫原性，限制它在人体的应用；人源化单克隆抗体因其大大降低对人体的免疫原性而应用前 景较广阔，近年来，用基因工程抗体技术生产的人源化单克隆抗体的研究发展很快，国外已 有20多种嵌合人源单克隆抗体用于临床试验[4]。笔者克隆乳腺癌CDI 315B单抗的V K和VH基因，对其进行序列分析，和国际标准的小鼠单抗Kabat 分类体系[5]进 行对比分析，CDI 315B单抗的VK属于第4或第5组的第6亚组(VI)，CDI 315B单抗的VH则 属于第2族(VH2)。我们将利用这一结果进一步组建人源化乳腺癌CDI 315B单克隆抗体。
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参 考 文 献
1，Kohler G，Milstein C.Continuous culture of fused cells sec- reting antibody of pre-defined specificity.Nature,1975,256:495 -497.
2，Morrison SL,Johnson MJ,Herzenberg LA,et al.Chimeric human antibody mo lecular: mouse antigen-binding domains with human constant region domains.Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:6 851-6 965.
3，Neuberger MS,Williams GT,Mitchell EB,et al.A hapten
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-specific chime ric IgE antibody with human physiological effector function.Nature,1985,314:268 -270.
4，Tristan JV,Janek O，Philip RT.Human antibodies design.Nature Biot ehnology,1998,16:535-539.
5，Kabat EA,Wu TT,Perry HM,et al.Sequence of proteins of immunological i nterest.5th edition .USA Department of Health and Human Service,Bethesda,1991 .
收稿日期：1998-08-11, http://www.100md.com