大鼠脑缺血再灌流脑区一氧化氮合酶的变化
作者：刘友尧 张洪 许国英 吴秀丽 慕容慎行
单位：刘友尧(福建医科大学 生物化学教研室,福州 350004); 张洪(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 许国英(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 吴秀丽(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 慕容慎行(福建医科大学附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005)
关键词：脑缺血；再灌注；一氧化氮合酶；大鼠
福建医科大学学报000113
摘要:目的 研究大鼠脑缺血再灌流后大脑皮层、海马、纹状体和小脑组织一氧化氮合酶(NOS)的变化。方法 采用放射免疫法检测脑组织中NOS的活性。结果 大鼠脑缺血后5 min，各脑区结构型NOS(cNOS)活性明显升高，持续到脑缺血30 min，脑缺血30～60 min开始下降;诱导型NOS(iNOS)活性在脑缺血后10～15 min开始升高，并持续到脑缺血60 min；脑缺血30 min再灌流15min，各脑区cNOS和iNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.05或P<0.01)。结论 提示脑缺血再灌流时脑组织NOS活性增强，采用特异NOS抑制剂可能有助于阻断脑缺血再灌流时由一氧化氮(NO)介导的脑损伤作用。
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中图分类号:R743.31 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0036-03
Change of Nitric Oxide Synthase in Different Brain Regions in Rats during Cerebral Ischemia and Reperfusion
LIU You-yao,et al
(Department of Biochemistry,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)
ZHANG Hong,XU Guo-ying
(Department of Neurology,The Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
, 百拇医药
ABSTRCT:Objective To study the change of nitric oxide synthase(NOS) in rat cerebral cortex,hippocampus，striatum and cerebellum during cerebral ischemia/reperfusion.Methods The activity of constitutive NOS(cNOS) and inducible NOS(iNOS) were measured with radioimmunoassay.Results The activity of cNOS in four regions significantly increased at 5 min，and decreased in cerebral cortex，hippocampus and striatum at 60 min，in cerebellum at 15 min.The activity of iNOS markerly increased in cerebral cortex and striatum at 15 min，in hippocampus and cerebellum at 10 min，and persisted to 60 min.After 30 min ischemia plus 15 min reperfusion，the activity of cNOS and iNOS in four regions significantly increased compared with 30 min ischemia(P<0.05 or P<0.01).Conclusion The activity of cNOS and iNOS were significantly higher in rat during cerebral ischemia/reperfusion.Using specific NOS inhibitors to suppress the activity of NOS may assist in the treatment for cerebral ischemia.
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KEY WORDS:cerebral ischemia；reperfusion；nitric oxide synthase；rat；
—氧化氮(NO)是结构简单的小分子气体物质，常作为一种重要的信使分子参与生物体内的各种病理生理过程，具有广泛的生物学作用。己知NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸和分子氧而生成的，根据NOS的功能不同而分为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)[1]。本实验通过检测大鼠全脑缺血再灌流时cNOS和iNOS活性变化，探讨NO在脑缺血损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 健康雄性SD大鼠，体重300±20 g，由福建省神经病学研究所动物室提供。随机分为假手术组和脑缺血5,10,15,30,60 min以及脑缺血30 min再灌注15 min(30/15)组，每组8只。
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1.2 脑缺血动物模型的制备 采用改良Pulsinelli方法[2]。20%氨基甲酸乙酯(l g/kg)腹腔麻醉，大鼠固定在手术台上,作头背部正中切口，分离肌肉，暴露第一颈椎翼小孔，分离小孔周围组织，用尖端约0.5 mm直径的电针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉。在手术显微镜下观察并证实椎动脉确已烧断后，迅速翻转大鼠，作颈前正中切口，分离双侧颈总动脉(CCA)，用1-0丝线或止血镊夹闭双侧CCA，造成缺血模型。缺血时间从双侧CCA关闭的瞬间开始计算。再灌流时间以放开双侧止血镊的瞬间计算。假手术组分离出翼小孔和CCA，不行烧灼或夹闭。
1.3 NOS活性测定 NOS放射免疫测定试剂由中国医学科学院基础医学研究所药理室提供。参照Bredt等的方法[3,4]，所有操作过程在0～4℃进行。称取冻存脑组织，按1∶5(W/V)比例加入预冷的50 mmol/L Hepes pH 7.4(内含0.32 mol蔗糖，1 mmol EDTA，0.1 mmol EGTA,1 mmol MDTT，1 μmol Leupetin，2 μmol Pepstatin)。在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆，离心(4℃，20000 g)60 min，上清即为N0S提取液。取N0S提取液50 μl，加入反应Buffer 50 μl,使其终浓度为50 mmol Hepes pH 7.4，内含有0.1 mmol NADPH，30 μl BH4，10 nmol CaM，1.25 mmol CaCl2，1 mmol EGTA(诱导型iN0S测定管不加CaM和CaCl2)而加入3 mmol EGTA)，3H-精氨酸0.2 μCi；反应管中加入1 mmol LnitroArg作为本底，37℃水浴反应15 min。用预冷的Buffer C 2 ml(20 mol Hepes pH 5.5，内含2 mmol EDTA，0.2 mmol EGTA，l mmol L-Cit)终止反应。经0.5～0.7 ml Dowex；50WX 8(Na+型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H流出液和蒸馏水洗脱液2 ml，将收集的样品混匀后，取出l ml于闪烁杯中，加入甲苯-Triton X-100闪烁液7 ml。在液体闪烁计数仪(Beckman L-9800型)上测定样品的放射性活性，由此计算3H-胍氨酸的生成量。结合蛋白质浓度计算N0S的比活性。
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1.4 组织蛋白质测定 采用Bradford法[1]。
1.5 统计学处理 实验结果以
表示，组间差别的显著性用t检验。
2 结 果
2.1 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区cNOS活性变化(表l)
表1 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区cNOS活性变化(pmol/mg蛋白/min) 分组
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
, http://www.100md.com
假手术组
41.80±5.82
36.91±9.51
101.08±9.55
175.75±9.86
缺血(min)
5
96.36±8.23**
202.30±35.92**
167.40±23.12**
446.72±61.76**
, http://www.100md.com
10
163.86±29.99**
248.36±45.81**
454.75±47.15*+
490.11±43.06**
15
174.46±41.50**
151.04±13.16**
282.60±29.74**
, http://www.100md.com 173.41±19.51
30
216.35±43.29**
96.30±11.35**
136.93±10.43**
51.09±12.52**
30/15
380.28±32.38▲▲
245.82±28.75▲▲
221.57±14.00▲▲
, http://www.100md.com
181.60±15.76▲▲
60
51.86±9.82
81.21±4.20**
86.43±11.39*
51.37±13.49**
Cnos:诱导型一氧化氮合酶.与假手术组相比，*:P<0.05,**:P<0.01;与缺血30min相比,▲:P<0.05,▲▲:P<0.01(下表同).
大鼠脑缺血后5 min，大脑皮层、海马、纹状体和小脑组织中cNOS活性升高，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.01)。其中cNOS活性在大脑皮层于缺血30 min达高峰，而在海马、纹状体和小脑于缺血10 min升高最明显。脑缺血60 min后，各脑区cNOS活性开始下降。脑缺血30 min再灌流15 min，各脑区cNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.01)。
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2.2 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区iNOS活性的变化(表2)
表2 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区iNOS活性变化(fmol/mg蛋白/min) 分组
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
假手术组
10.16±2.82
9.48±2.92
11.32±2.82
16.16±2.41
, 百拇医药
缺血(min)
5
9.75±1.89
7.29±2.41
12.24±2.04
16.68±2.72
10
10.63±2.38
33.35±3.71**
12.66±2.87
27.17±5.79**
, 百拇医药
15
16.31±3.34*
28.74±4.35**
29.19±5.83**
28.21±4.10**
30
15.61±4.85*
37.62±4.11**
52.61±5.81**
28.86±4.64**
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30/15
51.08±8.02▲▲
46.79±7.79▲
71.71±4.48▲▲
51.33±6.56▲▲
60
43.44±7.85**
32.90±4.60**
35.98±4.70**
31.75±5.05**
, 百拇医药
iNOS:诱导型一氧化氮合酶.
大鼠脑缺血后10 min，海马和小脑iNOS活性增加，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.01)；脑缺血后15 min，大脑皮层和纹状体iNOS活性增高，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。脑缺血30 min再灌流15 min，各脑区iNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.05或P<0.01)。
3 讨 论
近年来大量的研究发现NO参与脑缺血的病理损伤过程。由于NO是由NOS催化左旋精氨酸而生成的，因此，通过检测组织中NOS活性可判断组织中NO的含量。神经系统中的NOS是一种单体酶蛋白分子，目前已有3种特异的NOS被克隆，即脑细胞、内皮细胞和巨嗜细胞NOS，它们由不同的基因表达而产生。cNOS在生理状态下即具有活性，在细胞内钙增加时可被进一步激活，因而认为cNOS表现为“生理状态”的酶。研究认为脑细胞cNOS活性可通过NO本身进行负反馈调节，在底物左旋精氨酸存在时NO的形成主要靠cNOS;在底物缺乏时，脑细胞cNOS可产生超氧化物和过氧化氢。cNOS的这种特性表明其在病理情况下，具有潜在的严重的神经毒性作用。钙离子阻滞剂可通过阻断脑缺血cNOS活性而具有保护作用。iNOS在通常情况下活性低，但在脂多糖和一些炎性介质的作用下，活性明显增加，产生比cNOS多的NO，因而认为iNOS是一种“病理生理性”的酶。脑缺血时给予选择性iNOS抑制剂氨基胍可使脑缺血面积明显缩小，在缺乏iNOS基因的小鼠脑缺血实验中观察到突变型小鼠脑缺血面积明显缩小[6]，说明iNOS参与了脑缺血的神经元的损伤。本实验的结果显示，大鼠全脑缺血后4个脑区cNOS活性和iNOS活性出现不同程度的增高，与对照组相比差异有显著性；脑缺血再灌流时cNOS和iNOS活性进一步增加。这一结果与文献报道相似[7～10]。
, 百拇医药
脑缺血后NOS活性增高可能是由于脑缺血时缺血区兴奋性氨基酸谷氨酸的分泌增多，作用于细胞膜上的NMDA受体，引起细胞内钙增加，进而激活cNOS活性；脑缺血后组织细胞产生细胞因子如IL-1和TNF增多，通过激活iNOS活性，使NO的生成增[11,12]；同时，脑缺血时，由于ATP减少，NOS发生去磷酸化，导致NOS活性增加。至于随后NOS活性下降可能是由于快速升高NO本身的反馈调节，或是由于NOS中的巯基发生亚硝基化，导致NOS失活。
在生理情况下，脑组织细胞分泌一定量的NO具有调节脑血管阻力、调节血液粘稠度和发挥信使的作用。但在脑缺血时，组织细胞中产生大量NO可能加重脑缺血损伤。脑缺血时NO毒性作用表现如下:与一些含铁硫簇蛋白，如线粒体NADH泛醌氧化还原酶和NADH-琥珀酸盐氧化还原酶反应，抑制它们的活性，进而抑制氧化磷酸化作用导致神经损伤;抑制顺乌头酸酶，进而抑制糖酵解过程;与氧竞争细胞色素氧化酶，抑制线粒体呼吸。此外，NO可通过与蛋白质中巯基结合，导致S-硝基化作用;通过亚硝基修饰作用抑制肌酸激酶的活性。通过抑制磷酸肌酸和ATP间磷酰基转移，导致ATP生成减少，使神经元受损。最近的研究认为，脑缺血时，由于缺乏底物左旋精氨酸，NO主要与O2-反应形成强氧化剂过氧化亚硝酰基离子(ONOO-)，使线粒体中Mn-SOD失活，使线粒体不能消除O2-，引起级联式神经损伤[13]。
, 百拇医药
本文提示脑缺血再灌流时NOS的活性增高，说明NO参与脑缺血再灌注损伤过程。开发应用特异的NOS抑制剂以阻断脑缺血再灌流时NOS活性，有可能预防和延迟由NO介导的脑缺血性损伤，从而为临床治疗脑缺血提供一种新的方法。
作者简介:刘友尧，男，1933年6月生，教授.
参考文献:
[1]Moncada S，Palmer RMJ，Higgs EA.Nitric oxide；physiology，pathophysiology and pharmacology[J].Pharmacol Rev,1991;43:109～142
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, 百拇医药
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[4]Mayer B，John M，Bohme E.Purification of a Ca2/Calmodulin-dependent nitric oxide synthase from poretine cerebellum；cofactor role of tetrahydrobiopterin[J].FEBS Lett,1990;227:215～219
[5]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quitities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding[J].Anal Biochem,1976;72:248～250
, http://www.100md.com
[6]Parmentier S，Bohme GA，Lerouet D，et al.Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents ischemic brain injury[J].Br J Pharmacol,1999;127:546～552
[7]Rao AM，Dogan A，Hatcher JF,et al.Flurometric assay of nitrite and nitrate in brain tissue after traumatic brain injury and cerebral ischemia[J].Brain Res,1998;793:265～270
[8]Wei G，Dawson VL，Zweier JL.Role of neuronal and endothelial nitric oxide synthase in nitric oxide generation in the brain following cerebral ischemia[J].Biochim Biophy Acta,1999;1455:23～34
, 百拇医药
[9]Ashwal S，Tone B，Tian HR，et al.Core and pneumral nitric oxide synthase activity during cerebral ischemia and reperfusion in the rat pup[J].Pediatr Res,1999;46:390～400
[10]Lubec B，Kozlow AV,Krapfenbauer K，et al.Nitric oxide and nitric oxide synthase in the early phase of perinatal asphyxia of the rat[J].Neuroscieme,1999;93:1017～1023
[11]Wang X，Yue TL，Barone FC，et al.Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRNAs follows early response gene expression in transient focal ischemia[J].Mol Chem Neuro Pathol,1994;23:103～114
, 百拇医药
[12]Iadecola C，Zhang F,Xu S，et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in brain following cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,1995;15:378～384
[13]Strijbos PJ.Nitric oxide in cerebral ischemic neurodegeneration and excitotoxicity[J].Crit Rev Neurobiol,1998;12:223～243
收稿日期:1999-07-02, 百拇医药
单位：刘友尧(福建医科大学 生物化学教研室,福州 350004); 张洪(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 许国英(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 吴秀丽(福建医科大学 附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005); 慕容慎行(福建医科大学附属第一医院神经内科,福建省神经病学研究所,福州 350005)
关键词：脑缺血；再灌注；一氧化氮合酶；大鼠
福建医科大学学报000113
摘要:目的 研究大鼠脑缺血再灌流后大脑皮层、海马、纹状体和小脑组织一氧化氮合酶(NOS)的变化。方法 采用放射免疫法检测脑组织中NOS的活性。结果 大鼠脑缺血后5 min，各脑区结构型NOS(cNOS)活性明显升高，持续到脑缺血30 min，脑缺血30～60 min开始下降;诱导型NOS(iNOS)活性在脑缺血后10～15 min开始升高，并持续到脑缺血60 min；脑缺血30 min再灌流15min，各脑区cNOS和iNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.05或P<0.01)。结论 提示脑缺血再灌流时脑组织NOS活性增强，采用特异NOS抑制剂可能有助于阻断脑缺血再灌流时由一氧化氮(NO)介导的脑损伤作用。
, http://www.100md.com
中图分类号:R743.31 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0036-03
Change of Nitric Oxide Synthase in Different Brain Regions in Rats during Cerebral Ischemia and Reperfusion
LIU You-yao,et al
(Department of Biochemistry,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)
ZHANG Hong,XU Guo-ying
(Department of Neurology,The Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
, 百拇医药
ABSTRCT:Objective To study the change of nitric oxide synthase(NOS) in rat cerebral cortex,hippocampus，striatum and cerebellum during cerebral ischemia/reperfusion.Methods The activity of constitutive NOS(cNOS) and inducible NOS(iNOS) were measured with radioimmunoassay.Results The activity of cNOS in four regions significantly increased at 5 min，and decreased in cerebral cortex，hippocampus and striatum at 60 min，in cerebellum at 15 min.The activity of iNOS markerly increased in cerebral cortex and striatum at 15 min，in hippocampus and cerebellum at 10 min，and persisted to 60 min.After 30 min ischemia plus 15 min reperfusion，the activity of cNOS and iNOS in four regions significantly increased compared with 30 min ischemia(P<0.05 or P<0.01).Conclusion The activity of cNOS and iNOS were significantly higher in rat during cerebral ischemia/reperfusion.Using specific NOS inhibitors to suppress the activity of NOS may assist in the treatment for cerebral ischemia.
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KEY WORDS:cerebral ischemia；reperfusion；nitric oxide synthase；rat；
—氧化氮(NO)是结构简单的小分子气体物质，常作为一种重要的信使分子参与生物体内的各种病理生理过程，具有广泛的生物学作用。己知NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸和分子氧而生成的，根据NOS的功能不同而分为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)[1]。本实验通过检测大鼠全脑缺血再灌流时cNOS和iNOS活性变化，探讨NO在脑缺血损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 健康雄性SD大鼠，体重300±20 g，由福建省神经病学研究所动物室提供。随机分为假手术组和脑缺血5,10,15,30,60 min以及脑缺血30 min再灌注15 min(30/15)组，每组8只。
, 百拇医药
1.2 脑缺血动物模型的制备 采用改良Pulsinelli方法[2]。20%氨基甲酸乙酯(l g/kg)腹腔麻醉，大鼠固定在手术台上,作头背部正中切口，分离肌肉，暴露第一颈椎翼小孔，分离小孔周围组织，用尖端约0.5 mm直径的电针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉。在手术显微镜下观察并证实椎动脉确已烧断后，迅速翻转大鼠，作颈前正中切口，分离双侧颈总动脉(CCA)，用1-0丝线或止血镊夹闭双侧CCA，造成缺血模型。缺血时间从双侧CCA关闭的瞬间开始计算。再灌流时间以放开双侧止血镊的瞬间计算。假手术组分离出翼小孔和CCA，不行烧灼或夹闭。
1.3 NOS活性测定 NOS放射免疫测定试剂由中国医学科学院基础医学研究所药理室提供。参照Bredt等的方法[3,4]，所有操作过程在0～4℃进行。称取冻存脑组织，按1∶5(W/V)比例加入预冷的50 mmol/L Hepes pH 7.4(内含0.32 mol蔗糖，1 mmol EDTA，0.1 mmol EGTA,1 mmol MDTT，1 μmol Leupetin，2 μmol Pepstatin)。在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆，离心(4℃，20000 g)60 min，上清即为N0S提取液。取N0S提取液50 μl，加入反应Buffer 50 μl,使其终浓度为50 mmol Hepes pH 7.4，内含有0.1 mmol NADPH，30 μl BH4，10 nmol CaM，1.25 mmol CaCl2，1 mmol EGTA(诱导型iN0S测定管不加CaM和CaCl2)而加入3 mmol EGTA)，3H-精氨酸0.2 μCi；反应管中加入1 mmol LnitroArg作为本底，37℃水浴反应15 min。用预冷的Buffer C 2 ml(20 mol Hepes pH 5.5，内含2 mmol EDTA，0.2 mmol EGTA，l mmol L-Cit)终止反应。经0.5～0.7 ml Dowex；50WX 8(Na+型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H流出液和蒸馏水洗脱液2 ml，将收集的样品混匀后，取出l ml于闪烁杯中，加入甲苯-Triton X-100闪烁液7 ml。在液体闪烁计数仪(Beckman L-9800型)上测定样品的放射性活性，由此计算3H-胍氨酸的生成量。结合蛋白质浓度计算N0S的比活性。
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1.4 组织蛋白质测定 采用Bradford法[1]。
1.5 统计学处理 实验结果以
表示，组间差别的显著性用t检验。2 结 果
2.1 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区cNOS活性变化(表l)
表1 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区cNOS活性变化(pmol/mg蛋白/min) 分组
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
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假手术组
41.80±5.82
36.91±9.51
101.08±9.55
175.75±9.86
缺血(min)
5
96.36±8.23**
202.30±35.92**
167.40±23.12**
446.72±61.76**
, http://www.100md.com
10
163.86±29.99**
248.36±45.81**
454.75±47.15*+
490.11±43.06**
15
174.46±41.50**
151.04±13.16**
282.60±29.74**
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30
216.35±43.29**
96.30±11.35**
136.93±10.43**
51.09±12.52**
30/15
380.28±32.38▲▲
245.82±28.75▲▲
221.57±14.00▲▲
, http://www.100md.com
181.60±15.76▲▲
60
51.86±9.82
81.21±4.20**
86.43±11.39*
51.37±13.49**
Cnos:诱导型一氧化氮合酶.与假手术组相比，*:P<0.05,**:P<0.01;与缺血30min相比,▲:P<0.05,▲▲:P<0.01(下表同).
大鼠脑缺血后5 min，大脑皮层、海马、纹状体和小脑组织中cNOS活性升高，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.01)。其中cNOS活性在大脑皮层于缺血30 min达高峰，而在海马、纹状体和小脑于缺血10 min升高最明显。脑缺血60 min后，各脑区cNOS活性开始下降。脑缺血30 min再灌流15 min，各脑区cNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.01)。
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2.2 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区iNOS活性的变化(表2)
表2 大鼠脑缺血再灌流时不同脑区iNOS活性变化(fmol/mg蛋白/min) 分组
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
假手术组
10.16±2.82
9.48±2.92
11.32±2.82
16.16±2.41
, 百拇医药
缺血(min)
5
9.75±1.89
7.29±2.41
12.24±2.04
16.68±2.72
10
10.63±2.38
33.35±3.71**
12.66±2.87
27.17±5.79**
, 百拇医药
15
16.31±3.34*
28.74±4.35**
29.19±5.83**
28.21±4.10**
30
15.61±4.85*
37.62±4.11**
52.61±5.81**
28.86±4.64**
, http://www.100md.com
30/15
51.08±8.02▲▲
46.79±7.79▲
71.71±4.48▲▲
51.33±6.56▲▲
60
43.44±7.85**
32.90±4.60**
35.98±4.70**
31.75±5.05**
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iNOS:诱导型一氧化氮合酶.
大鼠脑缺血后10 min，海马和小脑iNOS活性增加，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.01)；脑缺血后15 min，大脑皮层和纹状体iNOS活性增高，与假手术组相比，差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。脑缺血30 min再灌流15 min，各脑区iNOS活性明显高于缺血30 min(P<0.05或P<0.01)。
3 讨 论
近年来大量的研究发现NO参与脑缺血的病理损伤过程。由于NO是由NOS催化左旋精氨酸而生成的，因此，通过检测组织中NOS活性可判断组织中NO的含量。神经系统中的NOS是一种单体酶蛋白分子，目前已有3种特异的NOS被克隆，即脑细胞、内皮细胞和巨嗜细胞NOS，它们由不同的基因表达而产生。cNOS在生理状态下即具有活性，在细胞内钙增加时可被进一步激活，因而认为cNOS表现为“生理状态”的酶。研究认为脑细胞cNOS活性可通过NO本身进行负反馈调节，在底物左旋精氨酸存在时NO的形成主要靠cNOS;在底物缺乏时，脑细胞cNOS可产生超氧化物和过氧化氢。cNOS的这种特性表明其在病理情况下，具有潜在的严重的神经毒性作用。钙离子阻滞剂可通过阻断脑缺血cNOS活性而具有保护作用。iNOS在通常情况下活性低，但在脂多糖和一些炎性介质的作用下，活性明显增加，产生比cNOS多的NO，因而认为iNOS是一种“病理生理性”的酶。脑缺血时给予选择性iNOS抑制剂氨基胍可使脑缺血面积明显缩小，在缺乏iNOS基因的小鼠脑缺血实验中观察到突变型小鼠脑缺血面积明显缩小[6]，说明iNOS参与了脑缺血的神经元的损伤。本实验的结果显示，大鼠全脑缺血后4个脑区cNOS活性和iNOS活性出现不同程度的增高，与对照组相比差异有显著性；脑缺血再灌流时cNOS和iNOS活性进一步增加。这一结果与文献报道相似[7～10]。
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脑缺血后NOS活性增高可能是由于脑缺血时缺血区兴奋性氨基酸谷氨酸的分泌增多，作用于细胞膜上的NMDA受体，引起细胞内钙增加，进而激活cNOS活性；脑缺血后组织细胞产生细胞因子如IL-1和TNF增多，通过激活iNOS活性，使NO的生成增[11,12]；同时，脑缺血时，由于ATP减少，NOS发生去磷酸化，导致NOS活性增加。至于随后NOS活性下降可能是由于快速升高NO本身的反馈调节，或是由于NOS中的巯基发生亚硝基化，导致NOS失活。
在生理情况下，脑组织细胞分泌一定量的NO具有调节脑血管阻力、调节血液粘稠度和发挥信使的作用。但在脑缺血时，组织细胞中产生大量NO可能加重脑缺血损伤。脑缺血时NO毒性作用表现如下:与一些含铁硫簇蛋白，如线粒体NADH泛醌氧化还原酶和NADH-琥珀酸盐氧化还原酶反应，抑制它们的活性，进而抑制氧化磷酸化作用导致神经损伤;抑制顺乌头酸酶，进而抑制糖酵解过程;与氧竞争细胞色素氧化酶，抑制线粒体呼吸。此外，NO可通过与蛋白质中巯基结合，导致S-硝基化作用;通过亚硝基修饰作用抑制肌酸激酶的活性。通过抑制磷酸肌酸和ATP间磷酰基转移，导致ATP生成减少，使神经元受损。最近的研究认为，脑缺血时，由于缺乏底物左旋精氨酸，NO主要与O2-反应形成强氧化剂过氧化亚硝酰基离子(ONOO-)，使线粒体中Mn-SOD失活，使线粒体不能消除O2-，引起级联式神经损伤[13]。
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本文提示脑缺血再灌流时NOS的活性增高，说明NO参与脑缺血再灌注损伤过程。开发应用特异的NOS抑制剂以阻断脑缺血再灌流时NOS活性，有可能预防和延迟由NO介导的脑缺血性损伤，从而为临床治疗脑缺血提供一种新的方法。
作者简介:刘友尧，男，1933年6月生，教授.
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收稿日期:1999-07-02, 百拇医药