人肝细胞癌血管内皮细胞生长因子的表达
作者：韩圣华 黄建富 殷凤峙
单位：韩圣华(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001); 黄建富(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001); 殷凤峙(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001)
关键词：内皮；血管；血管生长因子；癌，肝细胞；免疫组织化学
福建医科大学学报000112
摘要:目的 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与原发性肝细胞癌(HCC)侵袭、转移和预后的关系。方法 采用免疫组化SP法检测85例HCC的VECF表达。结果 HCC的VEGF表达与肿瘤大小、肿瘤个数、有无门静脉瘤栓形成、包膜是否完整有关(P<0.05)；与术前甲胎蛋白(AFP)水平、HBsAg、分化程度无关(P>0.05)。VEGF的表达与预后有关，术后平均无瘤生存期VEGF阴性组为53月，阳性组为18月(P<0.01)。结论 VEGF与HCC的侵袭、转移有关，VEGF阳性者HCC预后较差。
, 百拇医药
中图分类号:R735.7 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0033-03
Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and its Correlations with Clinicopathological Variables in Human Hepatocellular Carcinoma
HAN Sheng-hua,HUANG Jian-fu,YIN feng-zhi
(Department of Hepatobiliary Surgery,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in hepatocellular carcinoma cell(HCC) and its correlations with invasion,metastasis and prognosis of HCC.Methods 85 specimens of HCC were studied using immunohistochemical SP method respectively.Results The VEGF expression of HCC correlated with tumor size(P<0.05),numbers of tumors(P<0.05),tumor emboli in portal vein(P<0.05) and tumor capsule(P<0.05),but not with HBsAg,Alpha-fetoprotein and tumor differentiation(P>0.05).The significantly negative correlation was found between VEGF expression and tumor free survival time of postoperative patients with HCC.The mean tumor free survival time of VEGF(+) was 22 months,whereas it was 58 months of VEGF(-)(P<0.01).Conclusion Expression of VEGF may contribute to invasion and metastasis of HCC.VEGF is associated with poor prognosis.
, http://www.100md.com
KEY WORDS:endothelial,vascular;vascular growth factor;carcinoma,hepatocyte;immunohistochemy
肿瘤生长和转移依赖于血管生成，肿瘤细胞能释放多种血管生成因子(tumor angiogenesis factor,TAF)，通过旁分泌途径诱导血管生成。在目前已知的20多种血管生长因子中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用最为重要[1]。大量临床研究表明，肿瘤VEGF表达与肿瘤侵袭性相关，可作为许多实体性恶性肿瘤的不良预后因子[2]。原发性肝细胞癌(HCC)常为多血管型肿瘤，血管生成的研究具有特殊意义。笔者在1998年1月～1998年10月应用免疫组化方法检测85例HCC的VEGF表达，旨在探讨其与临床病理指标和预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 本科1990～1996年进行肝癌切除术的85例患者，经病理证实为原发性肝细胞癌，组织选取癌与癌旁交界处。术前未经任何治疗。男性79例，女性6例,年龄51.56±11.45岁(21～77岁)。所有病例均有完整随访资料。肝癌的复发均获典型的影像学诊断(B超或/和CT)。随访自手术日起，复发者以复发为观察终点，未复发者以最后随访日期为终点，85例患者在随访过程中46例复发。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 兔抗人VEGF多克隆抗体(美国Oncogene公司)，工作浓度1∶20；SP免疫组化试剂盒、胰蛋白酶消化试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。
1.3 方法 石蜡标本4 μm连续切片，免疫组化采用SP法。石蜡切片经胰蛋白酶消化(37℃ 20 min)修复抗原，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。已知阳性片作阳性对照，PBS替代一抗做阴性对照。
1.4 结果判断 5%以上细胞浆或细胞膜呈棕黄或棕褐色染色者为VEGF蛋白表达阳性[3]。
1.5 统计学处理 采用SPSS统计软件包进行，χ2 检验组间差异，Kaplan-Meier生存曲线计算平均无瘤生存时间，并行Log-rank检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 VEGF定位于阳性细胞细胞浆，显示棕黄或棕褐色染色(图1)。HCC中VEGF的表达率为64.7%(55/85)，VEGF的表达与肿瘤大小、病灶个数、有无门静脉瘤栓形成、包膜是否完整有关(P<0.05)，与术前甲胎蛋白水平、HBsAg、肿瘤分化程度无关(P>0.05)(附表)。
图1 原发性肝癌组织中VEGF阳性表达 ×400
附表 原发性肝细胞癌VEGF表达与临床病理指标的关系 临床病理指标
n
阳 性
n
%
, http://www.100md.com
肿瘤大小(cm)
≤3
20
8
40.0#
～≤5
18
11
61.1
～≤10
30
22
73.3*
, http://www.100md.com
>10
17
14
82.4**
甲胎蛋白(μg/L)
≥400
30
19
63.3
<400
55
36
65.5
, http://www.100md.com
HBsAg
阳性
69
47
65.3
阴性
16
8
50.0
病理分级
Ⅰ级
15
6
, 百拇医药 40.0
Ⅱ级
51
34
66.7
Ⅲ、Ⅳ级
19
15
78.9
病灶个数
多发
29
23
79.3#
, http://www.100md.com
单发
56
32
57.1*
门静脉瘤栓
有
26
21
80.8#
无
59
34
57.6*
, 百拇医药
肿瘤包膜
完整
45
24
53.3#
不完整或无
40
31
77.5*
各组内与#比较,*:P<0.05,**:P<0.01.
2.2 VEGF的表达与术后无瘤生存期有关，术后平均无瘤生存期VEGF阴性组为53个月，阳性组为18个月(P<0.001)(图2)。
, 百拇医药
图2 不同VEGF表达组HCC患者Kaplan-Meier生存曲线--:VEGF(+),…:VEGF(-).Log-rank检验,P<0.001.
3 讨 论
VEGF又称血管通透因子(VPF)[1]，是一种分子量为40～45 kD的分泌性糖蛋白，基因定位于第六对染色体的长臂上，含8个外显子，由于mRNA剪接的不同，人体细胞分泌4种多肽，分别由206,189,165或121个氨基酸残基组成。VEGF选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体—flt-1和KDR，使血管内皮细胞内钙离子浓度升高，它还通过磷酸肌醇特异性磷酸酯酶C，使细胞内IP3浓度升高而发挥作用[4]。
VEGF具有双重功能[1～5]: 增加微血管通透性，促进血浆纤维蛋白原的外渗，产生纤维素网络，有利于肿瘤间质及新生血管的形成；刺激内皮细胞增殖、迁移，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、组织因子、基质胶原酶等，这不仅有利于新生血管的形成，而且有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散。
, http://www.100md.com
本文显示，随着肿瘤的增大，VEGF表达有增高的趋势，<3 cm组VEGF表达明显低于>5 cm各组，这与多数肝癌的生物学特性似以3 cm为界限这一观点相符[6]。同时还表明，VEGF和反映肿瘤侵袭性的病理因素有关，门静脉瘤栓形成、突破包膜生长及形成肝内播散的VEGF的表达均显著高于无门静脉瘤栓、包膜完整、无肝内播散者。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞分泌的VEGF急剧增加，通过旁分泌途径导致血管生成显著增多，生成大量结构和功能异常的肿瘤血管，加速肿瘤演进过程，表现出侵袭、转移特征。因此，VEGF表达的检测有助于判断肝癌的侵袭性。
本文结果可以看出，癌组织中VEGF的表达不一致，肝癌坏死区周围的残余癌细胞VEGF表达强阳性，与Suzuki等报道相似[5]。肿瘤坏死是由于肿瘤中心癌细胞的快速增殖导致间质压力迅速增高，引起毛细血管受压闭合所致，在坏死的发生过程中，缺氧导致VEGF表达增高。已有细胞培养证实: 在缺氧状态下肿瘤细胞VEGF表达增高[7]。
, 百拇医药
肝癌术后肿瘤复发多见于肝内,多为单中心来源，与原发肿瘤残余的死灰复燃有关[8]。VEGF表达阳性者肝癌较阴性者更易于早期复发，提示阳性者存在肝内微小转移灶可能性大于阴性者，进一步说明VEGF在肝癌发展中的作用，可作为HCC预后指标。
笔者认为，VEGF与肝癌的生长、侵袭、转移有关，可作为反映肝癌生物学特性的指标之一。阻断VEGF与受体的结合可抑制血管的生成，并进而抑制肿瘤的生长，可望成为肝癌的一个新的治疗方向。
作者简介:韩圣华，男，1971年12月生，医师.医学硕士.
参考文献:
[1]Kamat BR,Brown LF,Manseau EJ,et al.Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor by human granulosa and theca lutein cells.Role in corpus leteum development[J]..Am J Pathol,1995;146:157～165
, 百拇医药
[2]Maeda K,Chung YS,Ogawa Y,et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma[J].Cancer,1996;77:858～863
[3]Chow NH,Hsu PI,Lin XZ,et al.Expression of vascular endothelial growth factor in normal liver and hepatocellular carcinoma,an immunohistochemical study[J].Human Pathology,1997;28:698～703
[4]Brock TA,Dvorak HF,Senger DR.Tumor-secreted vascular permeability factor increases cytosolic Ca2+ and Von Willebrand factor release in human endothelial cells[J].Am J Pathol,1991;138:213～221
, 百拇医药
[5]Suzuki K,Hayashi N,Miyamoto Y,et al.Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,1996;56:3004～3009
[6]丛文铭,吴孟超,陈 汉.小肝细胞癌的临床病理特点(附93例分析) [J].中华肿瘤杂志,1993;15:372～374
[7]Shweiki D,Itin A,Soffer D.Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis[J].Nature,1992;359:843～845
[8]丛文铭,吴孟超,陈 汉.DNA含量分析对复发肝细胞癌克隆来源及其临床意义的初步研究[J].临床肝胆病杂志，1993;9:3～5
收稿日期:1999-09-30, http://www.100md.com
单位：韩圣华(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001); 黄建富(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001); 殷凤峙(福建医科大学附属协和医院肝胆医科，福州 350001)
关键词：内皮；血管；血管生长因子；癌，肝细胞；免疫组织化学
福建医科大学学报000112
摘要:目的 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与原发性肝细胞癌(HCC)侵袭、转移和预后的关系。方法 采用免疫组化SP法检测85例HCC的VECF表达。结果 HCC的VEGF表达与肿瘤大小、肿瘤个数、有无门静脉瘤栓形成、包膜是否完整有关(P<0.05)；与术前甲胎蛋白(AFP)水平、HBsAg、分化程度无关(P>0.05)。VEGF的表达与预后有关，术后平均无瘤生存期VEGF阴性组为53月，阳性组为18月(P<0.01)。结论 VEGF与HCC的侵袭、转移有关，VEGF阳性者HCC预后较差。
, 百拇医药
中图分类号:R735.7 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0033-03
Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and its Correlations with Clinicopathological Variables in Human Hepatocellular Carcinoma
HAN Sheng-hua,HUANG Jian-fu,YIN feng-zhi
(Department of Hepatobiliary Surgery,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in hepatocellular carcinoma cell(HCC) and its correlations with invasion,metastasis and prognosis of HCC.Methods 85 specimens of HCC were studied using immunohistochemical SP method respectively.Results The VEGF expression of HCC correlated with tumor size(P<0.05),numbers of tumors(P<0.05),tumor emboli in portal vein(P<0.05) and tumor capsule(P<0.05),but not with HBsAg,Alpha-fetoprotein and tumor differentiation(P>0.05).The significantly negative correlation was found between VEGF expression and tumor free survival time of postoperative patients with HCC.The mean tumor free survival time of VEGF(+) was 22 months,whereas it was 58 months of VEGF(-)(P<0.01).Conclusion Expression of VEGF may contribute to invasion and metastasis of HCC.VEGF is associated with poor prognosis.
, http://www.100md.com
KEY WORDS:endothelial,vascular;vascular growth factor;carcinoma,hepatocyte;immunohistochemy
肿瘤生长和转移依赖于血管生成，肿瘤细胞能释放多种血管生成因子(tumor angiogenesis factor,TAF)，通过旁分泌途径诱导血管生成。在目前已知的20多种血管生长因子中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用最为重要[1]。大量临床研究表明，肿瘤VEGF表达与肿瘤侵袭性相关，可作为许多实体性恶性肿瘤的不良预后因子[2]。原发性肝细胞癌(HCC)常为多血管型肿瘤，血管生成的研究具有特殊意义。笔者在1998年1月～1998年10月应用免疫组化方法检测85例HCC的VEGF表达，旨在探讨其与临床病理指标和预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 本科1990～1996年进行肝癌切除术的85例患者，经病理证实为原发性肝细胞癌，组织选取癌与癌旁交界处。术前未经任何治疗。男性79例，女性6例,年龄51.56±11.45岁(21～77岁)。所有病例均有完整随访资料。肝癌的复发均获典型的影像学诊断(B超或/和CT)。随访自手术日起，复发者以复发为观察终点，未复发者以最后随访日期为终点，85例患者在随访过程中46例复发。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 兔抗人VEGF多克隆抗体(美国Oncogene公司)，工作浓度1∶20；SP免疫组化试剂盒、胰蛋白酶消化试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。
1.3 方法 石蜡标本4 μm连续切片，免疫组化采用SP法。石蜡切片经胰蛋白酶消化(37℃ 20 min)修复抗原，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。已知阳性片作阳性对照，PBS替代一抗做阴性对照。
1.4 结果判断 5%以上细胞浆或细胞膜呈棕黄或棕褐色染色者为VEGF蛋白表达阳性[3]。
1.5 统计学处理 采用SPSS统计软件包进行，χ2 检验组间差异，Kaplan-Meier生存曲线计算平均无瘤生存时间，并行Log-rank检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 VEGF定位于阳性细胞细胞浆，显示棕黄或棕褐色染色(图1)。HCC中VEGF的表达率为64.7%(55/85)，VEGF的表达与肿瘤大小、病灶个数、有无门静脉瘤栓形成、包膜是否完整有关(P<0.05)，与术前甲胎蛋白水平、HBsAg、肿瘤分化程度无关(P>0.05)(附表)。
图1 原发性肝癌组织中VEGF阳性表达 ×400
附表 原发性肝细胞癌VEGF表达与临床病理指标的关系 临床病理指标
n
阳 性
n
%
, http://www.100md.com
肿瘤大小(cm)
≤3
20
8
40.0#
～≤5
18
11
61.1
～≤10
30
22
73.3*
, http://www.100md.com
>10
17
14
82.4**
甲胎蛋白(μg/L)
≥400
30
19
63.3
<400
55
36
65.5
, http://www.100md.com
HBsAg
阳性
69
47
65.3
阴性
16
8
50.0
病理分级
Ⅰ级
15
6
, 百拇医药 40.0
Ⅱ级
51
34
66.7
Ⅲ、Ⅳ级
19
15
78.9
病灶个数
多发
29
23
79.3#
, http://www.100md.com
单发
56
32
57.1*
门静脉瘤栓
有
26
21
80.8#
无
59
34
57.6*
, 百拇医药
肿瘤包膜
完整
45
24
53.3#
不完整或无
40
31
77.5*
各组内与#比较,*:P<0.05,**:P<0.01.
2.2 VEGF的表达与术后无瘤生存期有关，术后平均无瘤生存期VEGF阴性组为53个月，阳性组为18个月(P<0.001)(图2)。
, 百拇医药
图2 不同VEGF表达组HCC患者Kaplan-Meier生存曲线--:VEGF(+),…:VEGF(-).Log-rank检验,P<0.001.
3 讨 论
VEGF又称血管通透因子(VPF)[1]，是一种分子量为40～45 kD的分泌性糖蛋白，基因定位于第六对染色体的长臂上，含8个外显子，由于mRNA剪接的不同，人体细胞分泌4种多肽，分别由206,189,165或121个氨基酸残基组成。VEGF选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体—flt-1和KDR，使血管内皮细胞内钙离子浓度升高，它还通过磷酸肌醇特异性磷酸酯酶C，使细胞内IP3浓度升高而发挥作用[4]。
VEGF具有双重功能[1～5]: 增加微血管通透性，促进血浆纤维蛋白原的外渗，产生纤维素网络，有利于肿瘤间质及新生血管的形成；刺激内皮细胞增殖、迁移，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、组织因子、基质胶原酶等，这不仅有利于新生血管的形成，而且有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散。
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本文显示，随着肿瘤的增大，VEGF表达有增高的趋势，<3 cm组VEGF表达明显低于>5 cm各组，这与多数肝癌的生物学特性似以3 cm为界限这一观点相符[6]。同时还表明，VEGF和反映肿瘤侵袭性的病理因素有关，门静脉瘤栓形成、突破包膜生长及形成肝内播散的VEGF的表达均显著高于无门静脉瘤栓、包膜完整、无肝内播散者。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞分泌的VEGF急剧增加，通过旁分泌途径导致血管生成显著增多，生成大量结构和功能异常的肿瘤血管，加速肿瘤演进过程，表现出侵袭、转移特征。因此，VEGF表达的检测有助于判断肝癌的侵袭性。
本文结果可以看出，癌组织中VEGF的表达不一致，肝癌坏死区周围的残余癌细胞VEGF表达强阳性，与Suzuki等报道相似[5]。肿瘤坏死是由于肿瘤中心癌细胞的快速增殖导致间质压力迅速增高，引起毛细血管受压闭合所致，在坏死的发生过程中，缺氧导致VEGF表达增高。已有细胞培养证实: 在缺氧状态下肿瘤细胞VEGF表达增高[7]。
, 百拇医药
肝癌术后肿瘤复发多见于肝内,多为单中心来源，与原发肿瘤残余的死灰复燃有关[8]。VEGF表达阳性者肝癌较阴性者更易于早期复发，提示阳性者存在肝内微小转移灶可能性大于阴性者，进一步说明VEGF在肝癌发展中的作用，可作为HCC预后指标。
笔者认为，VEGF与肝癌的生长、侵袭、转移有关，可作为反映肝癌生物学特性的指标之一。阻断VEGF与受体的结合可抑制血管的生成，并进而抑制肿瘤的生长，可望成为肝癌的一个新的治疗方向。
作者简介:韩圣华，男，1971年12月生，医师.医学硕士.
参考文献:
[1]Kamat BR,Brown LF,Manseau EJ,et al.Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor by human granulosa and theca lutein cells.Role in corpus leteum development[J]..Am J Pathol,1995;146:157～165
, 百拇医药
[2]Maeda K,Chung YS,Ogawa Y,et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma[J].Cancer,1996;77:858～863
[3]Chow NH,Hsu PI,Lin XZ,et al.Expression of vascular endothelial growth factor in normal liver and hepatocellular carcinoma,an immunohistochemical study[J].Human Pathology,1997;28:698～703
[4]Brock TA,Dvorak HF,Senger DR.Tumor-secreted vascular permeability factor increases cytosolic Ca2+ and Von Willebrand factor release in human endothelial cells[J].Am J Pathol,1991;138:213～221
, 百拇医药
[5]Suzuki K,Hayashi N,Miyamoto Y,et al.Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,1996;56:3004～3009
[6]丛文铭,吴孟超,陈 汉.小肝细胞癌的临床病理特点(附93例分析) [J].中华肿瘤杂志,1993;15:372～374
[7]Shweiki D,Itin A,Soffer D.Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis[J].Nature,1992;359:843～845
[8]丛文铭,吴孟超,陈 汉.DNA含量分析对复发肝细胞癌克隆来源及其临床意义的初步研究[J].临床肝胆病杂志，1993;9:3～5
收稿日期:1999-09-30, http://www.100md.com