胸腺因子D/重组白细胞介素2高效诱导人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的增殖及杀伤活性
作者：康德智 张国安 刘小朋 陈锦峰
单位：康德智(福建医科大学 附属第一医院神经外科,福州 350005); 张国安(空军福州医院 临床免疫研究室,福州 350002); 刘小朋(空军福州医院 临床免疫研究室,福州 350002); 陈锦峰(福建医科大学 附属第一医院神经外科,福州 350005)
关键词：淋巴细胞,肿瘤浸润；细胞培养；胸腺因子，循环；白细胞介素2；神经胶质瘤；脑肿瘤
福建医科大学学报000107
摘要:目的 探讨建立胸腺因子D(TFD)/重组白细胞介素2(rIL-2)高效诱导人脑胶质瘤浸润淋巴细胞(GIL)的可行性。方法 按TFD与rIL-2的不同组合，分组在体外对GIL进行培养，分别用MTT法、4 h 51Cr释放法和间接免疫荧光法检测其增殖、杀伤活性及rIL-2受体的表达情况。结果 TFD与rIL-2共同诱导GIL，与对照组相比，其增殖活性及对自体瘤细胞的杀伤活性显著增强且持续时间更长(P<0.01)。结论 应用TFD/rIL-2体外诱导方法，可望获取足量高活性的GIL用于临床脑胶质瘤的过继免疫冶疗。
, http://www.100md.com
中图分类号:R730.264 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0018-03
Efficiently Induced in Proliferation and Cytotoxicity of Human Brain Glioma Infiltrating Lymphocytes with Thymic Factor D and Recombinant Interleukin-2 in Vitro
KANG De-zhi,et al
(1.Department of Neurosurgery,The Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
, 百拇医药
ZHANG Guo-an,LIU Xiao-peng
(Institute Division of Clinical Immunology,Air Force Hospital,Fuzhou 350002,China)
ABSTRACT:Objective To study the feasibility of efficiently activated on human brain glioma infiltrating lymphocytes(GILs) with thymic factor D(TFD) and recombinant interleukin-2(rIL-2) in vitro.Methods GILs were cultured in the different combination groups of TFD and rIL-2.Their proliferate ability and cytotoxicity were investigated with MTT method,4 hour 51Cr release assay and indirect immunofluoresecence assay.Results The proliferative reaction of fresh GILs was significantly enhanced after the cultured treated with rIL-2 and TFD as compared with the culture treated with rIL-2 alone(P<0.01).GILs preincubated with rIL-2(250 U/ml) for 24 hours,and then added with TFD(50 μg/ml) showed that their cytotoxicity of GILs on autologous glioma cells was significantly enhanced and lasted for a longer term as compared with that of control groups(P<0.01).These results achieved were related to the continuously strong expression of IL-2 receptors on the surface of GILs activated by TFD.Conclusion We could get enough numbers of GILs with strong cytotoxicity during a longer term with the help of combined induction of TFD and rIL-2,then,take these GILs together with rIL-2 and TFD for the more effective adoptive immunotherapy of patients with brain glioma without increasing the dosage of rIL-2 and its side effects.
, 百拇医药
KEY WORDS:lymphocytes,tumor infiltrating;cell culture;thymic factor,circulation;interleukin-2;glioma;brain tumor
人脑胶质瘤浸润淋巴细胞(GIL)作为一种特异性强的免疫效应细胞能否在临床治疗中发挥作用，除了要辅以较大剂量的重组白细胞介素2(rIL-2)外，主要取决于其数量和活性[1]。因此，建立一种简便、廉价、高效的体外诱导方法有重要的应用价值。为此，笔者1995年7月～1997年5月观察激素类免疫调节剂胸腺因子D(TFD)对低剂量rIL-2体外诱导的人GIL的增殖和杀伤活性的影响及其可能的作用机制，以期建立TFD/rIL-2联合诱导方法。
1 材料与方法
1.1 GIL的分离和靶细胞的制备 取18例手术切取的人脑胶质瘤组织(星形细胞瘤Ⅱ～Ⅲ级)，其中10例分离出可供研究的GIL，同时留取相应的瘤细胞作靶细胞。主要试剂: TFD(福州金山制药厂)；rIL-2(美国Cetus公司)；MTT(瑞士FLuka公司)；51Cr，Na2, 51CrO4(中国原子能科研院同位素所)。方法见文献[2]。
, 百拇医药
1.2 GIL增殖反应 按Rosman法[3]稍加改良。用含20%LAK上清的RPMI 1640培养液将GIL配成5×105/ml的细胞悬液，分四组: (1)单纯培养液组(对照)；(2)rIL-2组；(3)TFD组；(4)rIL-2+TFD 组。取上述细胞悬液按0.2 ml/孔加入96孔培养板中，每组设三个复孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养96 h，取出后每孔加入MTT溶液10 μl，再置37℃孵育6 h，然后各孔加入100 μl,10%SDS-0.01 mol/L HCl，静置数分钟，置酶标仪上测OD590值。
1.3 GIL杀伤活性测定 分6组: (1)对照组；(2)rIL-2组；(3)TFD组；(4)rIL-2+TFD同时组；(5)TFD+rIL-2(24 h后)；(6)rIL-2+TFD(24 h后)。按1×106/孔细胞数加入24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养，按设定时间收获细胞。采用4 h 51Cr释放法测定活性。
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1.4 GIL IL-2受体表达测定 将经rIL-2和/或TFD作用96 h后的GIL，按106/管细胞数加入2 ml的试管中，用PBS洗3次，每管加入一抗(Anti-Tac)振荡混匀，4℃，30 min后再用PBS洗3次，每管加入1∶15稀释的二抗(FITC-羊抗鼠IgG荧光抗体)50 μl，置4℃,30 min PBS洗3次，滴入血细胞计数板中，荧光显微镜计数荧光细胞百分率。
2 结 果
2.1 TFD对GIL增殖反应的影响 TFD不能单独刺激新鲜分离未活化的GIL的增殖，但能协同rIL-2诱导GIL增殖反应(图1)。与单用rIL-2相比，差异具有显著性(P<0.01)。
图1 TFD对rIL-2诱导的GILs增殖反应的影
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浅色: 均值；深色: 标准差.
2.2 TFD对GIL杀伤自体瘤细胞活性的影响
2.2.1 TFD加入时间对GIL活性诱导的影响 各实验组诱导至第20天时，测定活性。TFD 本身不能使新鲜分离的GIL活化；在与rIL-2配伍用时，TFD提前24 h加入或与rIL-2同时加入，也不能使rIL-2所诱导的GIL杀伤活性进一步提高；而先加入rIL-2活化24 h后再加入TFD进行诱导，其杀伤活性明显高于单用rIL-2组(表1)(P<0.01)。
表1 TFD对GIL活性的影响(%) 分 组
GIL活性
对照组
25±5.9
, 百拇医药
TFD组
26±7.1
rIL-2组
66±6.7
TFD+rIL-2(24 h后)
70±6.9
rIL-2+TFD(24 h后)
81±6.3
n=10.与rIL-2组比较，*:P<0.01.
2.2.2 不同诱导时间TFD对GIL活性的影响(图2) 在同时加用rIL-2和TFD，第12天时活性比单用rIL-2组略高，无统计学意义(P>0.05)。但前组比后组却维持更长的高活性期。至培养40天时，rIL-2+TFD组活性仍高达72%±6.4%，而rIL-2组活性仅为57%±6.1%，两组比较,差异有非常显著性(P<0.01) 。
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图2 TFD协同rIL-2诱导的GILs活性动态变化
◆:TFD;□:rIL-2;▲:TFD+rIL-2.
2.3 TFD对GIL IL-2受体表达的影响(表2)
表2 TFD对GILIL-2受体表达的影响(%) 分 组
IL-2受体
对照组
23.1±3.3
TFD组
36.8±2.9*
rIL-2组
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43.2±2.7*
TFD+rIL-2
57.7±2.6**
n=10.与对照组比较，*: P<0.05；**: P< 0.01.
3 讨 论
研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞白细胞介素2受体(IL-2R)的表达是其激活及增殖的重要前提，同时也反映了其杀伤活性和增殖潜力的变化[5]。TFD是分子量小于14.4 kD的多肽，在体外可促进淋巴细胞的花环形成，具有很强的免疫调节作用[4]。笔者的研究显示，TFD本身不能刺激新鲜分离的GIL的增殖，也不能诱导其杀伤活性，但对rIL-2诱导的GIL增殖和杀伤活性有协同和增强作用,这可能与TFD协同和增强rIL-2诱导的IL-2R表达从而使后者高水平和持久的表达有关。rIL-2诱导的GIL杀伤活性在第8天开始上升，持续2～3周的高活性期，而加用TFD后则出现了较长时间的高活性期，至培养第40天时仍有较强活性，同时由于加用TFD增强了GIL的增殖活性，这就使得获取足量、高杀伤活性的GIL成为可能。此外，笔者的研究仅用rIL-2常规诱导剂量的半量和TFD共同诱导GIL，仍获得较强的增殖及杀伤活性，说明TFD可部分替代rIL-2。
, 百拇医药
笔者认为，研究结果对促进GIL的临床应用有实际意义,一方面可应用rIL-2/TFD联合诱导的方法，使GIL在体外长期高活性地扩增，从而为临床提供足量、高活性的GIL用于脑胶质瘤的过继免疫治疗；另方面，临床上可望用TFD部分替代rIL-2，从而减少rIL-2的用量，以减少其副作用并降低费用，提高疗效。此外，也可能为其他免疫活性细胞长期扩增培养，开辟一条新的途径。
基金项目:福建省卫生厅青年研究基金资助项目(95Q06)
作者简介:康德智,男，1963年11月生，副主任医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Sawamura Y,Hosokawa M,Kuppner MC,et al.Antitumor activity and surface phenotypes of human glioma-infiltrating lymphocytes after in vitro expansion in the presence of interleukin 2.[J] Cancer Research,1989;49:1843
, 百拇医药
[2]康德智,张国安,刘小朋，等.脑胶质瘤浸润淋巴细胞的分离、培养与表型及体外抗肿瘤活性测定[J].福建医学院学报,1994;2:120
[3]Rosmam T.Rapid colorimetric assays for cellular growth and cytotoxity assays[J].J Immunol,1983;65:55
[4]陈紫榕,李龙详,刘小朋，等.胸腺因子D研究[J].福建医药杂志,1988;4:25
[5]Kaplan DR,Braciale VL,Braciale TJ,et al.Antigen dependent regulation of interleukin 2 receptor expression on cloned human cytotoxic T lymphocytes[J].J Immunol,1984;133:1966
收稿日期:2000-01-21, 百拇医药
单位：康德智(福建医科大学 附属第一医院神经外科,福州 350005); 张国安(空军福州医院 临床免疫研究室,福州 350002); 刘小朋(空军福州医院 临床免疫研究室,福州 350002); 陈锦峰(福建医科大学 附属第一医院神经外科,福州 350005)
关键词：淋巴细胞,肿瘤浸润；细胞培养；胸腺因子，循环；白细胞介素2；神经胶质瘤；脑肿瘤
福建医科大学学报000107
摘要:目的 探讨建立胸腺因子D(TFD)/重组白细胞介素2(rIL-2)高效诱导人脑胶质瘤浸润淋巴细胞(GIL)的可行性。方法 按TFD与rIL-2的不同组合，分组在体外对GIL进行培养，分别用MTT法、4 h 51Cr释放法和间接免疫荧光法检测其增殖、杀伤活性及rIL-2受体的表达情况。结果 TFD与rIL-2共同诱导GIL，与对照组相比，其增殖活性及对自体瘤细胞的杀伤活性显著增强且持续时间更长(P<0.01)。结论 应用TFD/rIL-2体外诱导方法，可望获取足量高活性的GIL用于临床脑胶质瘤的过继免疫冶疗。
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中图分类号:R730.264 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0018-03
Efficiently Induced in Proliferation and Cytotoxicity of Human Brain Glioma Infiltrating Lymphocytes with Thymic Factor D and Recombinant Interleukin-2 in Vitro
KANG De-zhi,et al
(1.Department of Neurosurgery,The Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
, 百拇医药
ZHANG Guo-an,LIU Xiao-peng
(Institute Division of Clinical Immunology,Air Force Hospital,Fuzhou 350002,China)
ABSTRACT:Objective To study the feasibility of efficiently activated on human brain glioma infiltrating lymphocytes(GILs) with thymic factor D(TFD) and recombinant interleukin-2(rIL-2) in vitro.Methods GILs were cultured in the different combination groups of TFD and rIL-2.Their proliferate ability and cytotoxicity were investigated with MTT method,4 hour 51Cr release assay and indirect immunofluoresecence assay.Results The proliferative reaction of fresh GILs was significantly enhanced after the cultured treated with rIL-2 and TFD as compared with the culture treated with rIL-2 alone(P<0.01).GILs preincubated with rIL-2(250 U/ml) for 24 hours,and then added with TFD(50 μg/ml) showed that their cytotoxicity of GILs on autologous glioma cells was significantly enhanced and lasted for a longer term as compared with that of control groups(P<0.01).These results achieved were related to the continuously strong expression of IL-2 receptors on the surface of GILs activated by TFD.Conclusion We could get enough numbers of GILs with strong cytotoxicity during a longer term with the help of combined induction of TFD and rIL-2,then,take these GILs together with rIL-2 and TFD for the more effective adoptive immunotherapy of patients with brain glioma without increasing the dosage of rIL-2 and its side effects.
, 百拇医药
KEY WORDS:lymphocytes,tumor infiltrating;cell culture;thymic factor,circulation;interleukin-2;glioma;brain tumor
人脑胶质瘤浸润淋巴细胞(GIL)作为一种特异性强的免疫效应细胞能否在临床治疗中发挥作用，除了要辅以较大剂量的重组白细胞介素2(rIL-2)外，主要取决于其数量和活性[1]。因此，建立一种简便、廉价、高效的体外诱导方法有重要的应用价值。为此，笔者1995年7月～1997年5月观察激素类免疫调节剂胸腺因子D(TFD)对低剂量rIL-2体外诱导的人GIL的增殖和杀伤活性的影响及其可能的作用机制，以期建立TFD/rIL-2联合诱导方法。
1 材料与方法
1.1 GIL的分离和靶细胞的制备 取18例手术切取的人脑胶质瘤组织(星形细胞瘤Ⅱ～Ⅲ级)，其中10例分离出可供研究的GIL，同时留取相应的瘤细胞作靶细胞。主要试剂: TFD(福州金山制药厂)；rIL-2(美国Cetus公司)；MTT(瑞士FLuka公司)；51Cr，Na2, 51CrO4(中国原子能科研院同位素所)。方法见文献[2]。
, 百拇医药
1.2 GIL增殖反应 按Rosman法[3]稍加改良。用含20%LAK上清的RPMI 1640培养液将GIL配成5×105/ml的细胞悬液，分四组: (1)单纯培养液组(对照)；(2)rIL-2组；(3)TFD组；(4)rIL-2+TFD 组。取上述细胞悬液按0.2 ml/孔加入96孔培养板中，每组设三个复孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养96 h，取出后每孔加入MTT溶液10 μl，再置37℃孵育6 h，然后各孔加入100 μl,10%SDS-0.01 mol/L HCl，静置数分钟，置酶标仪上测OD590值。
1.3 GIL杀伤活性测定 分6组: (1)对照组；(2)rIL-2组；(3)TFD组；(4)rIL-2+TFD同时组；(5)TFD+rIL-2(24 h后)；(6)rIL-2+TFD(24 h后)。按1×106/孔细胞数加入24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养，按设定时间收获细胞。采用4 h 51Cr释放法测定活性。
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1.4 GIL IL-2受体表达测定 将经rIL-2和/或TFD作用96 h后的GIL，按106/管细胞数加入2 ml的试管中，用PBS洗3次，每管加入一抗(Anti-Tac)振荡混匀，4℃，30 min后再用PBS洗3次，每管加入1∶15稀释的二抗(FITC-羊抗鼠IgG荧光抗体)50 μl，置4℃,30 min PBS洗3次，滴入血细胞计数板中，荧光显微镜计数荧光细胞百分率。
2 结 果
2.1 TFD对GIL增殖反应的影响 TFD不能单独刺激新鲜分离未活化的GIL的增殖，但能协同rIL-2诱导GIL增殖反应(图1)。与单用rIL-2相比，差异具有显著性(P<0.01)。
图1 TFD对rIL-2诱导的GILs增殖反应的影
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浅色: 均值；深色: 标准差.
2.2 TFD对GIL杀伤自体瘤细胞活性的影响
2.2.1 TFD加入时间对GIL活性诱导的影响 各实验组诱导至第20天时，测定活性。TFD 本身不能使新鲜分离的GIL活化；在与rIL-2配伍用时，TFD提前24 h加入或与rIL-2同时加入，也不能使rIL-2所诱导的GIL杀伤活性进一步提高；而先加入rIL-2活化24 h后再加入TFD进行诱导，其杀伤活性明显高于单用rIL-2组(表1)(P<0.01)。
表1 TFD对GIL活性的影响(%) 分 组
GIL活性
对照组
25±5.9
, 百拇医药
TFD组
26±7.1
rIL-2组
66±6.7
TFD+rIL-2(24 h后)
70±6.9
rIL-2+TFD(24 h后)
81±6.3
n=10.与rIL-2组比较，*:P<0.01.
2.2.2 不同诱导时间TFD对GIL活性的影响(图2) 在同时加用rIL-2和TFD，第12天时活性比单用rIL-2组略高，无统计学意义(P>0.05)。但前组比后组却维持更长的高活性期。至培养40天时，rIL-2+TFD组活性仍高达72%±6.4%，而rIL-2组活性仅为57%±6.1%，两组比较,差异有非常显著性(P<0.01) 。
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图2 TFD协同rIL-2诱导的GILs活性动态变化
◆:TFD;□:rIL-2;▲:TFD+rIL-2.
2.3 TFD对GIL IL-2受体表达的影响(表2)
表2 TFD对GILIL-2受体表达的影响(%) 分 组
IL-2受体
对照组
23.1±3.3
TFD组
36.8±2.9*
rIL-2组
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43.2±2.7*
TFD+rIL-2
57.7±2.6**
n=10.与对照组比较，*: P<0.05；**: P< 0.01.
3 讨 论
研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞白细胞介素2受体(IL-2R)的表达是其激活及增殖的重要前提，同时也反映了其杀伤活性和增殖潜力的变化[5]。TFD是分子量小于14.4 kD的多肽，在体外可促进淋巴细胞的花环形成，具有很强的免疫调节作用[4]。笔者的研究显示，TFD本身不能刺激新鲜分离的GIL的增殖，也不能诱导其杀伤活性，但对rIL-2诱导的GIL增殖和杀伤活性有协同和增强作用,这可能与TFD协同和增强rIL-2诱导的IL-2R表达从而使后者高水平和持久的表达有关。rIL-2诱导的GIL杀伤活性在第8天开始上升，持续2～3周的高活性期，而加用TFD后则出现了较长时间的高活性期，至培养第40天时仍有较强活性，同时由于加用TFD增强了GIL的增殖活性，这就使得获取足量、高杀伤活性的GIL成为可能。此外，笔者的研究仅用rIL-2常规诱导剂量的半量和TFD共同诱导GIL，仍获得较强的增殖及杀伤活性，说明TFD可部分替代rIL-2。
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笔者认为，研究结果对促进GIL的临床应用有实际意义,一方面可应用rIL-2/TFD联合诱导的方法，使GIL在体外长期高活性地扩增，从而为临床提供足量、高活性的GIL用于脑胶质瘤的过继免疫治疗；另方面，临床上可望用TFD部分替代rIL-2，从而减少rIL-2的用量，以减少其副作用并降低费用，提高疗效。此外，也可能为其他免疫活性细胞长期扩增培养，开辟一条新的途径。
基金项目:福建省卫生厅青年研究基金资助项目(95Q06)
作者简介:康德智,男，1963年11月生，副主任医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Sawamura Y,Hosokawa M,Kuppner MC,et al.Antitumor activity and surface phenotypes of human glioma-infiltrating lymphocytes after in vitro expansion in the presence of interleukin 2.[J] Cancer Research,1989;49:1843
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[2]康德智,张国安,刘小朋，等.脑胶质瘤浸润淋巴细胞的分离、培养与表型及体外抗肿瘤活性测定[J].福建医学院学报,1994;2:120
[3]Rosmam T.Rapid colorimetric assays for cellular growth and cytotoxity assays[J].J Immunol,1983;65:55
[4]陈紫榕,李龙详,刘小朋，等.胸腺因子D研究[J].福建医药杂志,1988;4:25
[5]Kaplan DR,Braciale VL,Braciale TJ,et al.Antigen dependent regulation of interleukin 2 receptor expression on cloned human cytotoxic T lymphocytes[J].J Immunol,1984;133:1966
收稿日期:2000-01-21, 百拇医药