体外培养心脏成纤维细胞增殖的检测方法
作者：林岚 洪华山 王一波 江琼
单位：林岚(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 洪华山(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 王一波(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 江琼(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001)
关键词：心肌,细胞学；细胞分裂；DNA
福建医科大学学报000104
摘要:目的 在培养的心脏成纤维细胞模型上建立检测增殖的方法。方法 (1)差速贴壁分离法培养乳鼠心脏成纤维细胞，用光镜、电镜及免疫细胞化学染色进行鉴定。(2)同步测定心脏成纤维细胞在不同浓度胎牛血清作用下BrdU掺入和WST-1代谢活性。结果 (1)培养的细胞经形态学观察和波形蛋白SP染色，鉴定为成纤维细胞。(2)在0,1%,2.5%,5%和10%的胎牛血清作用下，心脏成纤维细胞BrdU，WST-1的OD值分别是0.186±0.025,0.300±0.073；0.466±0.049,0.531±0.072;0.761±0.039,0.716±0.064；0.834±0.048,0.833±0.073和0.905±0.064，0.935±0.053(P<0.01)。结论 (1)WST-1可在活的心脏成纤维细胞代谢，WST-1法适用于该细胞的增殖。(2)BrdU、WST-1 ELISA可同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成及其代谢活性，是检测细胞增殖的新方法。
, 百拇医药
合成；成纤维细胞；细胞周期
中图分类号:Q813.1+1;R329.2 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0010-04
Detective Method for Proliferative Quantity of Cultured Cardiac Fibroblasts in Vitro
LIN Lan,HONG Hua-shan,WANG Yi-bo,et al
(Department of Cardiovascular,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University，Fuzhou 350001,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To establish a new procedure for the quantification of cell proliferation on the cultured cardiac fibroblasts.Methods (1)The neonatal rat cardiac fibroblasts were cultured by the differential attachment technique and were identified with light microscopy,electromicroscopy and immunocytochemistry. (2)At different concentrations of fetal calf serum(FCS),BrdU incorporation and WST-1 metabolic activity on the cultured neonatal rat cardiac fibroblasts were measured simultaneously with BrdU,WST-1 ELISA.Results (1)The cultured cells identified by morphology and SP staining with vimentin showed the characteristic of fibroblasts. (2)At 0,1%,2.5%,5% and 10% FCS,the absorbance spectra(optical density) of BrdU incorporation and WST-1 cleavage products on the cultured cardiac fibroblasts were following respectively:0.186±0.025，0.300±0.073；0.466±0.049，0.531±0.072；0.76±0.039，0.716±0.064；0.834±0.048，0.833±0.073 and 0.905±0.064，0.935±0.053(P<0.01).Conclusion (1)WST-1 can be metabolized by the viable cardiac fibroblasts,thus WST-1 ELISA is suitable for proliferation research of this cell type. (2)The combination of BrdU and WST-1 ELISA can be used for the simultaneous measurment of DNA synthesis and metabolic activity and as a new procedure for the quantification of cell proliferation of cardiac fibroblasts.
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KEY WORDS:myocardium cytology;cytodiaeresis;DNA synthesis;fibroblast;cell cycle
近年来研究表明，心脏间质细胞(主要是成纤维细胞)不仅具有重要的生理功能，而且其细胞增殖参与了高血压左室肥厚、缺血性心脏病、扩张型心肌病、充血性心力衰竭等许多心血管疾病的病理过程[1]。因此，心脏成纤维细胞增殖的病理生理学成为现代心血管疾病研究的一个热点。检测细胞增殖的方法较多，各有利弊[2]。最直接的细胞计数法操作繁琐，细胞用量较大；噻唑蓝(MTT)法因其产生难溶结晶物，测定步骤较多，敏感性相对较低；而WST-1(a water-soluble sulfonated tetrazolium，即4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate,4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝苯基)-2H-5-四氮唑]-1,3-苯磺酸钠)是稳定的即用型试剂，其在活细胞中的代谢产物为水溶性，具有可以与非同位素的5'-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'- deoxyurine，BrdU)掺入同步测定一个细胞群体的代谢活性及其DNA合成的优点，但其不足之处在于 WST-1不能被所有的细胞所代谢。笔者报道WST-1在体外培养的乳鼠心脏成纤维细胞中的代谢变化并建立以同步测定BrdU掺入和WST-1代谢活性来检测心脏成纤维细胞增殖的方法。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养[3]无菌条件下，取下1～4日龄Sprague-Dawley大鼠乳鼠(上海医科大学实验动物中心提供)心室，浸入D-Hanks液中剪碎。用0.1%胰蛋白酶(美国DIFCO公司)于37℃水浴并在磁力搅拌器上(速率100 r/min)消化细胞，每10 min收集一次细胞。将离心后所得的全部细胞用含10%胎牛血清(FCS，杭州四季清生物技术材料研究所)的IMDM培养液(美国GIBCO公司)充分混匀，一并收集于100 ml大培养瓶中，送入37℃ 5%CO2培养箱(2300型SHEL-LAB，美国Sheldon公司)中培养60～90 min。在培养时间内，成纤维细胞贴壁速度较快，先附于瓶底，而心肌细胞仍存在于细胞悬液中,将细胞悬液倒掉，经两次差速贴壁后仍附于瓶底的绝大多数为成纤维细胞。加入含10% FCS的IMDM培养液(完全培养液)培养至细胞汇合(约2～3天)，用0.15%胰蛋白酶消化传代(1∶2.5)。第二代细胞用于实验。
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1.2 细胞观察与鉴定 用倒置显微镜(重庆光学仪器厂)及透射电镜(Hu-12A型，日本日立公司)观察细胞形态及超微结构。用即用型SP免疫细胞化学方法[4]，波形蛋白单克隆抗体(福州迈新公司)为一抗，对心脏成纤维细胞进行染色，PBS作阴性对照。
1.3 实验细胞准备与分组 第二代心脏成纤维细胞稀释成5×104/ml，均匀接种在24孔或96孔培养板上。待细胞生长至50%汇合时，吸去原培养液，D-Hanks洗涤两次，用不含血清的IMDM培养液静止(quiescent)培养24 h，然后分别加入含不同浓度FCS的培养液培养24 h后进行实验。
实验共分5组: 无血清组,1%,2.5%,5%及10%FCS组。每组重复3孔。
1.4 细胞计数 生长在24孔培养板上的细胞经不同浓度血清作用24 h后，用0.15%胰蛋白酶消化至细胞分离，收集各孔细胞，用血细胞计数板和锥虫蓝染液进行活细胞计数。
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1.5 同步测定细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性。
1.5.1 实验试剂 试剂盒购自德国Boehringer Mannheim 公司。
100 μmol/L BrdU标记液 用无菌IMDM培养液以1∶100稀释原10 mmol/L BrdU标记溶剂(无菌水剂)，使终浓度为100 μmol/L。
Anti-BrdU-POD抗体工作液 用双蒸水1.1 ml溶解Anti-BrdU-POD粉剂10 min，充分混匀制成抗体储存液，-20℃存放。实验时用试剂盒提供的抗体稀释液将储存液稀释100倍，即为抗体工作液(即配即用)。
PBS洗涤液 用双蒸水将试剂盒提供的10×PBS储存液稀释10倍。
1.5.2 对照孔设置 每次实验均设2个空白对照孔(以IMDM培养液代替细胞)和1个BrdU背景对照孔(含细胞，但不加BrdU标记液，余步骤不变)，上述对照孔吸光值均应<0.1。
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1.5.3 实验步骤 在96孔板上生长的细胞经不同浓度的血清作用24 h后，加入无菌100 μmol/L BrdU标记液10 μl/孔(终浓度为10 μmol/L)，置培养箱孵育9 h，加入即用型WST-1溶液10 μl/孔，继续孵育3 h。取出培养板，置振荡器上充分振荡(300 r/min)1 min，在酶标仪(Bio-RAD型550，日本伯乐公司)450/655 nm双波长处检测OD值，即WST-1检测值。充分倾出原培养板各孔内液体，加入FixDenat液200 μl/孔(使细胞固定，DNA变性)，室温下(18～25℃)孵育30 min，充分倾出FixDenat液，加入Anti-BrdU-POD工作液100 μl/孔，室温下孵育90 min。倾出上清液，加入PBS洗涤液300 μl/孔，洗3×5 min，倾出洗涤液，加入即用型底液100 μl/孔，室温下孵育至显色充分(约20 min)。加入1 mol/L H2SO4 25 μl/孔终止反应，置振荡器上充分振荡(300 r/min)1 min，立即在酶标仪450/655 nm双波长处检测OD值(在加入终止液5 min内完成检测)，即BrdU检测值。每份样本检测2次(分别用不同的空白对照孔调零)，取平均值。
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1.6 数据处理 实验数据以均值±标准差(
)表示，用SPSS软件包 One-Way ANOVA进行统计学处理。
2 结 果
2.1 心脏成纤维细胞的形态及免疫鉴定结果 倒置显微镜观察,心脏成纤维细胞生长迅速，2～3天即呈汇合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长。与心肌细胞不同，心脏成纤维细胞呈梭形，胞体较大，胞质透明；细胞核较大，呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动。
透射电镜下见心脏成纤维细胞胞质内有丰富的粗面内质网，未见肌原纤维；细胞核大，可见2个以上细胞核，核仁明显，有的可见双核仁。细胞表面有许多短小突起，局部细胞间隙中可见胶原纤维，未见细胞间连接结构(图1)。
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图1 心脏成纤维细胞
细胞表面见胶原纤维(A,B),无肌原纤维和细胞间连接结构.×9000(A为右下角局部放大)
SP免疫细胞化学染色显示，心脏成纤维细胞波形蛋白呈阳性反应，即胞浆内围绕细胞呈红色丝状网络形态，阳性率在 95%以上(图2)；PBS对照呈阴性。
图2 心脏成纤维细胞波形蛋白SP染色阳性×3300
2.2 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞数量的影响 随着FCS浓度的逐渐增加，心脏成纤维细胞数量增加(图3)。在0,1%,2.5%,5%和10%FCS作用下，心脏成纤维细胞活细胞数(×104/孔)分别为8.84±0.90,9.62±0.63,11.31±0.97,12.28±0.98和13.85±0.69，二者呈明显量效关系(P<0.05或 0.01)。
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图3 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞数量的影响
2.3 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性的影响 不同浓度FCS均使心脏成纤维细胞BrdU 掺入与代谢活性升高(P<0.01)，且呈明显量效关系(附表,图4)。
附表 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入与代谢活性的影响 FCS(%)
BrdU
WST-1
0
0.186±0.025
0.300±0.073
1
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0.466±0.049*
0.531±0.072*
2.5
0.761±0.039*#
0.716±0.064*#
5
0.834±0.048*△
0.833±0.073*△
10
0.905±0.064*▲
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0.935±0.053*▲
n=8. 与0%FCS组比较，*:P<0.01；与1%FCS组比较，#:P<0.01；与2.5%FCS组比较，△:P<0.01；与5%FCS组比较，▲:P<0.01.
图4 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性的影响
▲ : BrdU;■: WST-1.
3 讨 论
心脏成纤维细胞的增殖及其胞外基质的堆积,在心肌肥厚等许多心血管疾病的病理过程中起重要作用。本组实验用反复差速贴壁方法培养的细胞经形态学观察和波形蛋白SP染色，鉴定为心脏成纤维细胞，为进一步的增殖动力学研究提供了基础条件。
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反映细胞增殖状况的指标有活细胞数量、DNA合成、细胞代谢活性和细胞周期等，其中最直接的指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多。四唑盐—MTT、XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylaminocarbonyl)-2H-tetrazolium hydroxide)及WST-1等因其可在活细胞中裂解成有色的甲
产物(formazan)而被用于细胞代谢活性的检测。与传统的MTT(其裂解产物为难溶结晶体)法相比，XTT和WST-1能直接产生水溶性的有色产物，具有更加敏感、方便、省时(仅需0.5～4 h)的优点；而WST-1又比XTT稳定，可作即用型试剂。近年来国外学者采用WST-1方法定量测定培养细胞的活性与增殖能力，证实了其方法的可靠性和简易性[5,6]。WST-1的局限在于不能被所有细胞所代谢。笔者的研究结果表明，随着血清浓度增高，乳鼠心脏成纤维细胞活细胞数量增加，其WST-1代谢活性亦升高，说明心脏成纤维细胞可对WST-1进行代谢，因此适用于该细胞的增殖研究。
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DNA合成是细胞增殖的先决条件[7]，细胞增殖时，DNA合成增加，活细胞数目增多，代谢活性亦升高。但是DNA合成增加并不一定意味着细胞增殖，相反地，有时却是细胞凋亡的先兆。如 Kirshenbaum[8]、Liu[9] 等的研究表明，腺病毒E1A在诱导成年心肌细胞凋亡的同时却促进其DNA合成；Wagner[5]等的研究亦发现，低浓度的幽门螺杆菌能使胃上皮细胞数目减少,但其DNA合成增加。此外，放线菌素D可抑制细胞DNA合成，但并不影响细胞代谢活性[10]，可见细胞DNA合成与代谢活性并不总是呈平行关系。因此，对同一细胞群体同步测定其代谢活性与DNA合成，能比较真实全面地反映细胞的增殖动力学变化，在研究某种因子或药物促进DNA合成却诱导细胞凋亡，或者抑制DNA合成而不影响其代谢活性的作用时尤具有特殊意义。目前在对心脏成纤维细胞的增殖动力学研究中，尚未见同步测定细胞代谢活性和DNA合成的报道。笔者结合WST-1检测和BrdU掺入(后者被公认为非同位素的反映细胞DNA合成的主要方法)的特点，用ELISA法同步测定乳鼠心脏成纤维细胞的代谢活性和DNA合成以反映细胞的增殖状态，获得成功。结果显示，随着血清浓度的逐渐增加，心脏成纤维细胞的WST-1代谢活性及其BrdU掺入(即DNA合成)同步增加，证实胎牛血清对心脏成纤维细胞具有显著促增殖作用，这与细胞直接计数的结果相符。此外，BrdU、WST-1 ELISA在微量滴定板上实验，方法快速方便，并可减少细胞数量，适用于多样本的研究。
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笔者认为，WST-1能在活的心脏成纤维细胞中进行代谢，适用于该细胞的增殖研究。BrdU、WST-1 ELISA同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成及其代谢活性以反映细胞的增殖状态，具有结果真实可靠、方法敏感快速、无放射毒性等优点，为在体外培养的细胞模型上进行心脏各种病理过程的研究提供了测定细胞增殖的新方法。
基金项目:福建省科委科技基金资助课题(99-Z-163)
作者简介:林 岚,女，1969年9月生，医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease:The fibrillar collagen network[J]. JACC,1989;13(7):1637 [2]江 谦. 现代医学实验方法[M]. 北京: 人民卫生出版社,1997: 146～186
, 百拇医药
[3]Sadoshima J,Iaumo S. Molecular characterization of angiotensin Ⅱ induced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts[J]. Circ Res,1993;73:413
[4]Osborn M,Weber K. Intermediate filaments: cell-type-specific markers in differentiation and pathology[J]. Cell,1982;31:303
[5]Wagner S,Bei W,Westermann J,et al. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori: Evidence for a major role of apoptosis[J]. Gastroenterology,1997;113(6):1836
, 百拇医药
[6]Mgbonyebi OP,Russo J,Russo IH. Roscovitine inhibits the proliferative activity of immortal and neoplastic human breast epithelial cells[J]. Anticancer Res,1998;18(2A):751
[7]Soonpaa M,Field LJ. Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis[J]. Circ Res,1998;83:15
[8]Kirshenbaum LA,Schneider MD. Adenovirus E1A represses cardiac gene transcription and reactivates DNA synthesis in ventricular myocytes,via alternative pocket protein-and p300-binding domains[J]. J Biol Chem,1995;270:7791
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[9]Liu Y,Kitsis RN. Induction of DNA synthesis and apoptosis in cardiac myocytes by E1A on protein[J]. J Cell Biol,1996;133:325
[10] Berridge MV,Tan AS,McGoy KA,et al. The biothemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts[J]. Biochemica,1996;4:15
收稿日期:1999-10-22, http://www.100md.com
单位：林岚(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 洪华山(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 王一波(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001); 江琼(福建医科大学 附属协和医院心内科,福州 350001)
关键词：心肌,细胞学；细胞分裂；DNA
福建医科大学学报000104
摘要:目的 在培养的心脏成纤维细胞模型上建立检测增殖的方法。方法 (1)差速贴壁分离法培养乳鼠心脏成纤维细胞，用光镜、电镜及免疫细胞化学染色进行鉴定。(2)同步测定心脏成纤维细胞在不同浓度胎牛血清作用下BrdU掺入和WST-1代谢活性。结果 (1)培养的细胞经形态学观察和波形蛋白SP染色，鉴定为成纤维细胞。(2)在0,1%,2.5%,5%和10%的胎牛血清作用下，心脏成纤维细胞BrdU，WST-1的OD值分别是0.186±0.025,0.300±0.073；0.466±0.049,0.531±0.072;0.761±0.039,0.716±0.064；0.834±0.048,0.833±0.073和0.905±0.064，0.935±0.053(P<0.01)。结论 (1)WST-1可在活的心脏成纤维细胞代谢，WST-1法适用于该细胞的增殖。(2)BrdU、WST-1 ELISA可同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成及其代谢活性，是检测细胞增殖的新方法。
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合成；成纤维细胞；细胞周期
中图分类号:Q813.1+1;R329.2 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0010-04
Detective Method for Proliferative Quantity of Cultured Cardiac Fibroblasts in Vitro
LIN Lan,HONG Hua-shan,WANG Yi-bo,et al
(Department of Cardiovascular,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University，Fuzhou 350001,China)
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ABSTRACT:Objective To establish a new procedure for the quantification of cell proliferation on the cultured cardiac fibroblasts.Methods (1)The neonatal rat cardiac fibroblasts were cultured by the differential attachment technique and were identified with light microscopy,electromicroscopy and immunocytochemistry. (2)At different concentrations of fetal calf serum(FCS),BrdU incorporation and WST-1 metabolic activity on the cultured neonatal rat cardiac fibroblasts were measured simultaneously with BrdU,WST-1 ELISA.Results (1)The cultured cells identified by morphology and SP staining with vimentin showed the characteristic of fibroblasts. (2)At 0,1%,2.5%,5% and 10% FCS,the absorbance spectra(optical density) of BrdU incorporation and WST-1 cleavage products on the cultured cardiac fibroblasts were following respectively:0.186±0.025，0.300±0.073；0.466±0.049，0.531±0.072；0.76±0.039，0.716±0.064；0.834±0.048，0.833±0.073 and 0.905±0.064，0.935±0.053(P<0.01).Conclusion (1)WST-1 can be metabolized by the viable cardiac fibroblasts,thus WST-1 ELISA is suitable for proliferation research of this cell type. (2)The combination of BrdU and WST-1 ELISA can be used for the simultaneous measurment of DNA synthesis and metabolic activity and as a new procedure for the quantification of cell proliferation of cardiac fibroblasts.
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KEY WORDS:myocardium cytology;cytodiaeresis;DNA synthesis;fibroblast;cell cycle
近年来研究表明，心脏间质细胞(主要是成纤维细胞)不仅具有重要的生理功能，而且其细胞增殖参与了高血压左室肥厚、缺血性心脏病、扩张型心肌病、充血性心力衰竭等许多心血管疾病的病理过程[1]。因此，心脏成纤维细胞增殖的病理生理学成为现代心血管疾病研究的一个热点。检测细胞增殖的方法较多，各有利弊[2]。最直接的细胞计数法操作繁琐，细胞用量较大；噻唑蓝(MTT)法因其产生难溶结晶物，测定步骤较多，敏感性相对较低；而WST-1(a water-soluble sulfonated tetrazolium，即4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate,4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝苯基)-2H-5-四氮唑]-1,3-苯磺酸钠)是稳定的即用型试剂，其在活细胞中的代谢产物为水溶性，具有可以与非同位素的5'-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'- deoxyurine，BrdU)掺入同步测定一个细胞群体的代谢活性及其DNA合成的优点，但其不足之处在于 WST-1不能被所有的细胞所代谢。笔者报道WST-1在体外培养的乳鼠心脏成纤维细胞中的代谢变化并建立以同步测定BrdU掺入和WST-1代谢活性来检测心脏成纤维细胞增殖的方法。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养[3]无菌条件下，取下1～4日龄Sprague-Dawley大鼠乳鼠(上海医科大学实验动物中心提供)心室，浸入D-Hanks液中剪碎。用0.1%胰蛋白酶(美国DIFCO公司)于37℃水浴并在磁力搅拌器上(速率100 r/min)消化细胞，每10 min收集一次细胞。将离心后所得的全部细胞用含10%胎牛血清(FCS，杭州四季清生物技术材料研究所)的IMDM培养液(美国GIBCO公司)充分混匀，一并收集于100 ml大培养瓶中，送入37℃ 5%CO2培养箱(2300型SHEL-LAB，美国Sheldon公司)中培养60～90 min。在培养时间内，成纤维细胞贴壁速度较快，先附于瓶底，而心肌细胞仍存在于细胞悬液中,将细胞悬液倒掉，经两次差速贴壁后仍附于瓶底的绝大多数为成纤维细胞。加入含10% FCS的IMDM培养液(完全培养液)培养至细胞汇合(约2～3天)，用0.15%胰蛋白酶消化传代(1∶2.5)。第二代细胞用于实验。
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1.2 细胞观察与鉴定 用倒置显微镜(重庆光学仪器厂)及透射电镜(Hu-12A型，日本日立公司)观察细胞形态及超微结构。用即用型SP免疫细胞化学方法[4]，波形蛋白单克隆抗体(福州迈新公司)为一抗，对心脏成纤维细胞进行染色，PBS作阴性对照。
1.3 实验细胞准备与分组 第二代心脏成纤维细胞稀释成5×104/ml，均匀接种在24孔或96孔培养板上。待细胞生长至50%汇合时，吸去原培养液，D-Hanks洗涤两次，用不含血清的IMDM培养液静止(quiescent)培养24 h，然后分别加入含不同浓度FCS的培养液培养24 h后进行实验。
实验共分5组: 无血清组,1%,2.5%,5%及10%FCS组。每组重复3孔。
1.4 细胞计数 生长在24孔培养板上的细胞经不同浓度血清作用24 h后，用0.15%胰蛋白酶消化至细胞分离，收集各孔细胞，用血细胞计数板和锥虫蓝染液进行活细胞计数。
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1.5 同步测定细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性。
1.5.1 实验试剂 试剂盒购自德国Boehringer Mannheim 公司。
100 μmol/L BrdU标记液 用无菌IMDM培养液以1∶100稀释原10 mmol/L BrdU标记溶剂(无菌水剂)，使终浓度为100 μmol/L。
Anti-BrdU-POD抗体工作液 用双蒸水1.1 ml溶解Anti-BrdU-POD粉剂10 min，充分混匀制成抗体储存液，-20℃存放。实验时用试剂盒提供的抗体稀释液将储存液稀释100倍，即为抗体工作液(即配即用)。
PBS洗涤液 用双蒸水将试剂盒提供的10×PBS储存液稀释10倍。
1.5.2 对照孔设置 每次实验均设2个空白对照孔(以IMDM培养液代替细胞)和1个BrdU背景对照孔(含细胞，但不加BrdU标记液，余步骤不变)，上述对照孔吸光值均应<0.1。
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1.5.3 实验步骤 在96孔板上生长的细胞经不同浓度的血清作用24 h后，加入无菌100 μmol/L BrdU标记液10 μl/孔(终浓度为10 μmol/L)，置培养箱孵育9 h，加入即用型WST-1溶液10 μl/孔，继续孵育3 h。取出培养板，置振荡器上充分振荡(300 r/min)1 min，在酶标仪(Bio-RAD型550，日本伯乐公司)450/655 nm双波长处检测OD值，即WST-1检测值。充分倾出原培养板各孔内液体，加入FixDenat液200 μl/孔(使细胞固定，DNA变性)，室温下(18～25℃)孵育30 min，充分倾出FixDenat液，加入Anti-BrdU-POD工作液100 μl/孔，室温下孵育90 min。倾出上清液，加入PBS洗涤液300 μl/孔，洗3×5 min，倾出洗涤液，加入即用型底液100 μl/孔，室温下孵育至显色充分(约20 min)。加入1 mol/L H2SO4 25 μl/孔终止反应，置振荡器上充分振荡(300 r/min)1 min，立即在酶标仪450/655 nm双波长处检测OD值(在加入终止液5 min内完成检测)，即BrdU检测值。每份样本检测2次(分别用不同的空白对照孔调零)，取平均值。
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1.6 数据处理 实验数据以均值±标准差(
)表示，用SPSS软件包 One-Way ANOVA进行统计学处理。2 结 果
2.1 心脏成纤维细胞的形态及免疫鉴定结果 倒置显微镜观察,心脏成纤维细胞生长迅速，2～3天即呈汇合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长。与心肌细胞不同，心脏成纤维细胞呈梭形，胞体较大，胞质透明；细胞核较大，呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动。
透射电镜下见心脏成纤维细胞胞质内有丰富的粗面内质网，未见肌原纤维；细胞核大，可见2个以上细胞核，核仁明显，有的可见双核仁。细胞表面有许多短小突起，局部细胞间隙中可见胶原纤维，未见细胞间连接结构(图1)。
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图1 心脏成纤维细胞
细胞表面见胶原纤维(A,B),无肌原纤维和细胞间连接结构.×9000(A为右下角局部放大)
SP免疫细胞化学染色显示，心脏成纤维细胞波形蛋白呈阳性反应，即胞浆内围绕细胞呈红色丝状网络形态，阳性率在 95%以上(图2)；PBS对照呈阴性。
图2 心脏成纤维细胞波形蛋白SP染色阳性×3300
2.2 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞数量的影响 随着FCS浓度的逐渐增加，心脏成纤维细胞数量增加(图3)。在0,1%,2.5%,5%和10%FCS作用下，心脏成纤维细胞活细胞数(×104/孔)分别为8.84±0.90,9.62±0.63,11.31±0.97,12.28±0.98和13.85±0.69，二者呈明显量效关系(P<0.05或 0.01)。
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图3 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞数量的影响
2.3 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性的影响 不同浓度FCS均使心脏成纤维细胞BrdU 掺入与代谢活性升高(P<0.01)，且呈明显量效关系(附表,图4)。
附表 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入与代谢活性的影响 FCS(%)
BrdU
WST-1
0
0.186±0.025
0.300±0.073
1
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0.466±0.049*
0.531±0.072*
2.5
0.761±0.039*#
0.716±0.064*#
5
0.834±0.048*△
0.833±0.073*△
10
0.905±0.064*▲
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0.935±0.053*▲
n=8. 与0%FCS组比较，*:P<0.01；与1%FCS组比较，#:P<0.01；与2.5%FCS组比较，△:P<0.01；与5%FCS组比较，▲:P<0.01.
图4 不同浓度FCS对心脏成纤维细胞BrdU掺入和WST-1代谢活性的影响
▲ : BrdU;■: WST-1.
3 讨 论
心脏成纤维细胞的增殖及其胞外基质的堆积,在心肌肥厚等许多心血管疾病的病理过程中起重要作用。本组实验用反复差速贴壁方法培养的细胞经形态学观察和波形蛋白SP染色，鉴定为心脏成纤维细胞，为进一步的增殖动力学研究提供了基础条件。
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反映细胞增殖状况的指标有活细胞数量、DNA合成、细胞代谢活性和细胞周期等，其中最直接的指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多。四唑盐—MTT、XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylaminocarbonyl)-2H-tetrazolium hydroxide)及WST-1等因其可在活细胞中裂解成有色的甲
产物(formazan)而被用于细胞代谢活性的检测。与传统的MTT(其裂解产物为难溶结晶体)法相比，XTT和WST-1能直接产生水溶性的有色产物，具有更加敏感、方便、省时(仅需0.5～4 h)的优点；而WST-1又比XTT稳定，可作即用型试剂。近年来国外学者采用WST-1方法定量测定培养细胞的活性与增殖能力，证实了其方法的可靠性和简易性[5,6]。WST-1的局限在于不能被所有细胞所代谢。笔者的研究结果表明，随着血清浓度增高，乳鼠心脏成纤维细胞活细胞数量增加，其WST-1代谢活性亦升高，说明心脏成纤维细胞可对WST-1进行代谢，因此适用于该细胞的增殖研究。, 百拇医药
DNA合成是细胞增殖的先决条件[7]，细胞增殖时，DNA合成增加，活细胞数目增多，代谢活性亦升高。但是DNA合成增加并不一定意味着细胞增殖，相反地，有时却是细胞凋亡的先兆。如 Kirshenbaum[8]、Liu[9] 等的研究表明，腺病毒E1A在诱导成年心肌细胞凋亡的同时却促进其DNA合成；Wagner[5]等的研究亦发现，低浓度的幽门螺杆菌能使胃上皮细胞数目减少,但其DNA合成增加。此外，放线菌素D可抑制细胞DNA合成，但并不影响细胞代谢活性[10]，可见细胞DNA合成与代谢活性并不总是呈平行关系。因此，对同一细胞群体同步测定其代谢活性与DNA合成，能比较真实全面地反映细胞的增殖动力学变化，在研究某种因子或药物促进DNA合成却诱导细胞凋亡，或者抑制DNA合成而不影响其代谢活性的作用时尤具有特殊意义。目前在对心脏成纤维细胞的增殖动力学研究中，尚未见同步测定细胞代谢活性和DNA合成的报道。笔者结合WST-1检测和BrdU掺入(后者被公认为非同位素的反映细胞DNA合成的主要方法)的特点，用ELISA法同步测定乳鼠心脏成纤维细胞的代谢活性和DNA合成以反映细胞的增殖状态，获得成功。结果显示，随着血清浓度的逐渐增加，心脏成纤维细胞的WST-1代谢活性及其BrdU掺入(即DNA合成)同步增加，证实胎牛血清对心脏成纤维细胞具有显著促增殖作用，这与细胞直接计数的结果相符。此外，BrdU、WST-1 ELISA在微量滴定板上实验，方法快速方便，并可减少细胞数量，适用于多样本的研究。
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笔者认为，WST-1能在活的心脏成纤维细胞中进行代谢，适用于该细胞的增殖研究。BrdU、WST-1 ELISA同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成及其代谢活性以反映细胞的增殖状态，具有结果真实可靠、方法敏感快速、无放射毒性等优点，为在体外培养的细胞模型上进行心脏各种病理过程的研究提供了测定细胞增殖的新方法。
基金项目:福建省科委科技基金资助课题(99-Z-163)
作者简介:林 岚,女，1969年9月生，医师，医学硕士.
参考文献:
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[9]Liu Y,Kitsis RN. Induction of DNA synthesis and apoptosis in cardiac myocytes by E1A on protein[J]. J Cell Biol,1996;133:325
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收稿日期:1999-10-22, http://www.100md.com