雌激素哌嗪类衍生物的合成及其促骨生长活性
作者：李灵芝 郑虎 翁玲玲
单位：李灵芝(华西医科大学药学院，成都 610041)；郑虎(华西医科大学药学院，成都 610041)；翁玲玲(华西医科大学药学院，成都 610041)；李灵芝(现址：武警医学院药学教研室，天津300162)
关键词：雌激素；哌嗪；合成；骨吸收；骨形成
中国药物化学杂志000109 摘 要：设计合成了以籍次乙基为桥将雌激素通过3-OH醚化与4种不同哌嗪环相连的衍生物，包括中间体共合成了12个化合物，其中8个目标物及3个中间体未见文献报道.结构经质谱、核磁共振谱、红外光谱及元素分析确定.同时测定了目标物对体外培养小鼠胚胎长骨生长的影响，结果显示由雌酚酮和雌二醇与不同的哌嗪环相连所得到的衍生物抑制骨吸收、促进骨形成的作用均不低于相应的母体雌激素.表明哌嗪环的引入不影响雌激素对骨的药理作用，所合成的4种化合物可以作为骨靶向雌激素的弹头，进一步与骨靶向载体连接.
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The Synthesis of Derivatives of Estrogen
Linked to Piperazines and Determination of Their Activities
Li Lingzhi Zheng Hu Weng Lingling
(West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract：Eight of the derivatives of estrogen in which estrone or estradiol was linked respectively to 1,4-piperazine-2-carboxylic acid methyl ester,2-ketopiperazine,3-oxo-2-acetic acid ethyl ester and 2,5-piperazinedione through ethyl were designed and synthesized.All of the target compounds and three of the inter-mediates were new compounds.The structures of these new compounds were confirmed by MS,1H-NMR,13C-NMR,IR and elemental analysis.The effects of the target compounds on bone growth were determined.The results showed that the activities of enhancing bone information and inhibiting bone resorption of all the target compounds synthesized were not lower than that of their original estrogen.The results indicated that the effects of estrogen on bones were not changed by importing piperazine rings and suggested that the target compounds synthesized could be used for synthesis of bone-targeted estrogen.
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Key words：estrogen;piperazines;synthesis;bone information;bone resorption▲
雌激素可维持成骨细胞的正常功能，降低破骨细胞活性，对于维持骨量具有重要作用，被广泛用于绝经后雌激素分泌不足所致的骨质疏松症.但长期使用雌激素可能有促使子宫内膜癌和乳腺癌发病率增高的危险，因此设法将雌激素促进骨形成、抑制骨吸收的作用与其对非骨组织如子宫、乳腺等的副作用加以分离具有重要的意义.
1 合成路线
破骨细胞、成骨细胞和软骨细胞中均存在雌激素受体〔1～3〕，表明这类甾体激素可通过受体介导机制发挥对骨组织的影响作用.通过一种骨靶向载体可以使雌激素选择性地作用于骨组织，同时降低非骨组织的雌激素浓度.哌嗪环类常常被许多药物分子引入以调节脂-水分配系数，从而改善药物的生物利用度；此外，哌嗪环化合物分子中含有双N—H基团，因而是一类连接雌激素与骨靶向载体的理想桥梁.据此，设计并合成了不同哌嗪环经乙基为桥与雌激素3-OH成醚的4个系列共8个目标化合物，均未见文献报道，并从组织学和形态学两方面测定了化合物对体外培养小鼠胚胎长骨生长的影响，以从中选择可用于合成骨靶向雌激素的中间体.
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目标物的合成是以雌酚酮或雌二醇为原料，在四正丁基溴化铵(TBAB)催化下经相转移反应制得相应的3-位溴乙基醚或3-位氯乙基醚，然后分别与2-哌嗪羧酸甲酯、2-哌嗪酮、3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯、2，5-哌嗪二酮在丙酮或二甲基甲酰胺中进行烃化反应制得.合成路线见图1.
Fig.1 The route of synthesis
2 合成实验
熔点用毛细管法测定，温度未经校正.元素分析用Carlo-Erba 1106型自动元素分析仪测定.核磁共振谱用Bruker-AG-E 200型核磁共振仪测定，TMS为内标，CDCl3作溶剂.红外光谱用PE-983型红外光谱仪测定，溴化钾压片或液膜法.
2.1 雌酚酮-3-β-溴乙基醚(1)的制备
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方法1：将8.1 g(30 mmol)雌酚酮，9.9 mL(150 mmol)二溴乙烷及1.59 g(5 mmol)四正丁基溴化铵溶于120 mL甲苯中，升温至外温80℃，缓缓滴入18 mL 50%氢氧化钠溶液，TLC追踪反应，约3 h反应完毕，分出甲苯层，水层以甲苯萃取3次，合并甲苯层，2 mol/L氢氧化钠溶液洗涤，水洗至中性，浓缩除去甲苯，残留物加少许甲醇，结晶，抽滤得白色块状结晶，95%乙醇重结晶，得白色结晶4.5 g，mp 84～86 ℃，收率：40.0%.
：2930，2886(CH3)，1731(CO)，1606(
).MS m/z：376(M+)，270.1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.69(m,2H,ArH),4.25(t,2H,ArOCH2)，3.61(t,2H,BrCH2)，2.87(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).
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方法2：将1.35 g(5 mmol)雌酚酮，3.3 mL(50 mmol)二溴乙烷及1.39 g(10 mmol)无水碳酸钾置于100 mL甲苯中，加热回流72 h，滤除固体，甲苯层以2 mol/L氢氧化钠溶液洗涤，水洗至中性，浓缩后，硅胶柱色谱纯化，得白色结晶0.66 g，收率：35.0%，mp 84～86℃.
2.2 雌二醇-3-β-溴乙基醚(2)的制备
用类似于“2.1”节的方法，雌二醇和二溴乙烷反应制得(2)，为白色块状结晶，收率：32.8%，mp 83～85 ℃.：3440(OH)，2950，2885(CH3)，1610().MS m/z：378(M+).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),4.25(t,2H,ArOCH2)，3.72(t,1H,17-CH)，3.61(t,2H,CH2Br)，2.82(m,2H,ArCH2)，1.48(锐峰，重水交换后消失，17-OH)，0.77(s,3H,18-CH3).
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2.3 雌酚酮-3-β-氯乙基醚(3)的合成〔4〕
将2.70 g(10 mmol)雌酚酮，0.024 g(0.7 mmol)四正丁基溴化铵溶于40 mL 1，2-二氯乙烷中，升温至外温75℃，缓缓滴入6 mL 50%氢氧化钠溶液，约2.5 h滴完，回流30 min，静置冷却，分出有机层，水层以1，2-二氯乙烷提取，合并有机层，水洗至中性，浓缩，残留物用甲醇结晶，得白色块状结晶3.2 g，mp 86～88 ℃，收率：97.3%(熔点和收率与文献〔4〕值相同).
2.4 雌二醇-3-β-氯乙基醚(4)的合成
方法同化合物(3).化合物(4)为白色结晶，收率：96.5%，mp 84～86℃.：3440(OH)，2950，2885(CH3)，1605().MS m/z：334(M+)；1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),4.19(t,2H,ArOCH2)，3.68～3.81(m,3H,ClCH2，17-CH)，3.61(t,2H,CH2Br)，2.82(m,2H,ArCH2)，1.58(锐峰，重水交换后消失，17-OH)，0.76(s,3H,18-CH3).
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2.5 雌酚酮-3-β-〔N4-(2-甲氧羰酰基)-哌嗪〕-乙基醚(1a)的合成
2.3 g(7.5 mmol)2-哌嗪羧酸甲酯双氢溴酸盐(参照文献〔5〕制备)、2.12 g(20 mmol)无水碳酸钠，加70 mL丙酮混匀，回流10 min，加入1.98 g(5 mmol)化合物(1)继续回流，TLC监测，约48 h反应完毕后，静置冷却，过滤，滤液浓缩，残渣加氯仿溶解，5%食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，回收氯仿，硅胶柱色谱，氯仿-丙酮-石油醚(V∶V∶V=2∶2∶1)洗脱，得微带黄色油状物1.41 g，收率：64.0%.：3441(NH)，2928，2880(CH3)，1737(C
O)，1608().MS m/z：440(M+)，157(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.69(m,2H,ArH),4.06(t,2H,ArOCH2)，3.72(s,3H,OCH3)，3.61(dd,1H,NCHCO)，3.09～3.02(m,2H,OCCH2N)，2.92～2.71(m,8H,NCH2CH2N，ArOCH2，ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.7，172.2，156.6，137.6，132.1，126.2，114.5，112.1，65.5，57.3，57.1，55.5，53.5，51.9，50.2，47.9，43.8，38.2，35.7，31.4，29.5，26.4，25.8，21.5，13.7.
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2.6 雌二醇-3-β-〔N4-(2-甲氧羰酰基)-哌嗪〕-乙基醚(1b)的合成
方法同“2.5”节，由化合物(2)与2-哌嗪羧酸甲酯双氢溴酸盐反应制得(1b)，无色油状物，收率：67.0%.：3338(OH)，2924，2867(CH3)，1680(酯羰基)，1609(CC).MS m/z：442(M+)，157(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.67(m,2H,ArH),4.08(t,2H,ArOCH2)，3.72(s,3H,OCH3)，3.70(t,1H,17-CH)，3.62(dd,1H,NCHCO)，3.08～3.02(m,2H,OCCCH2N)，2.91～2.71(m,8H,NCH2CH2N，ArOCH2,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：172.0，156.4，137.9，132.8，127.0，114.5，112.0，81.8，65.5，57.3，56.9，55.3，53.4，52.0，50.0，44.1，43.9，38.7，36.6，30.4，29.9，27.1，26.2，23.0，11.0.
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2.7 雌酚酮-3-β-〔N4-(2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(2a)的合成
将0.63 g(1.676 mmol)化合物(1)、0.167 g(1.676 mmol)2-哌嗪酮、0.178 g(1.676 mmol)无水碳酸钠及4 mL二甲基甲酰胺(DMF)混匀，外温75℃保温反应7 h，TLC监测反应.反应完毕后，滤除不溶物，减压蒸干，残渣溶于氯仿，水洗，2 mol/L盐酸溶液萃取，水层以碳酸氢钠中和至pH 8～9，滤除沉淀，快速硅胶柱色谱，得白色固体(2a)0.55 g，收率：83.3%,mp 200～202℃.：3198(NH)，2935，2885(CH3)，1733(CO)，1660(CO)，1610(CC).MS m/z：396(M+)，113(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),5.98(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.09(t,2H,ArOCH2)，3.40(t,2H,CH2NCO)，3.30(s,2H,NCH2CO)，2.90～2.79(m,6H,ArCH2，NCH2C，ArOCCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.8，169.5，156.4，137.7，132.3，126.2，114.5，112.0，65.7，57.1，56.0，50.2，49.2，47.6，43.8，41.0，38.2，35.7，31.4，29.5，26.4，25.7，21.4，13.7.
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2.8 雌二醇-3-β-〔N4-(2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(2b)的合成
方法同“2.7”节，由0.57 g(1.507 mmol)化合物(2)与2-哌嗪酮反应制得(2b)，得白色固体0.45 g,mp 194～196℃，收率：75.4%.：3431(OH)，2916(CH3)，1660(CO)，1612(CC).MS m/z：398(M+)，113(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),6.03(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.09(t,2H,ArOCH2)，3.37(t,1H,17-CH)，3.40(t,2H,CH2NCO)，3.29(s,2H,NCH2CO)，2.90～2.80(m,6H,ArCH2，NCH2C，ArOCCH2)，1.68(宽峰，重水交换消失，17-OH)，0.76(s,3H,18-CH3).
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2.9 雌酚酮-3-β-〔N4-(3-乙氧羰甲基-2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(3a)的合成
将0.94 g(5 mmol)3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯(参照文献〔6〕制备)、1.88 g(5 mmol)化合物(1)、无水碳酸钠0.53 g(5 mmol)与20 mL DMF混匀，升温至外温80℃，保温反应12 h.滤除不溶物，滤液减压浓缩至小体积，加水搅拌，倾出上清液，半固体物加乙酸乙酯固化，过滤，得1.5 g白色固体，乙酸乙酯液以2 mol/L盐酸溶液萃取3次，合并萃取液，碳酸氢钠中和至pH 8～9，过滤得固体0.8 g，两次固体合并，硅胶柱色谱，丙酮-石油醚(V∶V=1∶2)洗脱，得白色固体1.23 g，收率：50.8%,mp 188～190℃.：3298(NH)，2931(CH3)，1734(CO)，1671(酰胺CO)，1608(CC).MS m/z：482(M+)，199(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.66(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.18～4.05(m,4H,OCOCH2，ArOCH2)，3.61(m,1H,NCHCO)，3.37(t,2H,CH2NCO)，1.24(t,3H,OCH2CH3)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.0，171.1，156.5，137.8，132.4，126.3，114.5，112.0，68.1，61.6，60.5，53.0，50.4，47.9，46.9，43.9，39.9，38.3，36.1，35.8，31.5，29.6，26.5，25.9,14.1，13.8.
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2.10 雌二醇-3-β-〔N4-(3-乙氧羰甲基-2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(3b)的合成
方法同“2.9”节，1.10 g(2.910 mmol)化合物(2)与3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯反应制得(3b)，得白色固体0.60 g，收率：42.5%,mp 184～186 ℃；：3440(OH)，2930(CH3)，1735(CO)，1670(酰胺CO)，1609(CC).MS m/z：484(M+)，199(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.43(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.18～4.06(m,4H,OCOCH2，ArOCH2)，3.71(t,1H,17—CH)，3.61(t,1H,NCHCO)，3.36(m,2H,CH2NCO)，1.23(t,3H,OCH2CH3)，0.76(s,3H,18—CH3).
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2.11 雌酚酮-3-β-〔N4-(2，5-二氧)-哌嗪〕-乙基醚(4a)的合成
将2.28 g(10 mmol)2，5-哌嗪二酮(参照文献〔7〕制备)与40 mL甲醇混匀，升温至回流，尽量使溶，缓缓滴入含0.28 g(5 mmol)氢氧化钾的甲醇溶液10 mL，滴毕，蒸除甲醇，残渣加20 mL DMF和1.66 g(5 mmol)化合物(3),升温至外温80℃，保温反应7 h(TLC监测).蒸除DMF，残渣加氯仿溶解，过滤得粗品，硅胶柱色谱，氯仿-丙酮-石油醚(V∶V∶V=2∶2∶1)洗脱，得白色针状结晶0.7 g，收率：34.0%,mp 220～222℃.：3273(NH)，2929(CH3)，1733(CO)，1680(酰胺CO)，1572(CC).MS m/z：410(M+)，141(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.25(s,2H,NCH2CO)，4.16(t,2H,ArOCH2)，4.02(s,2H,OCCH2)，3.74(t,2H,ArOCCH2)，2.88(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.9，166.4，163.7，156.0，137.9，132.6，126.4，114.3，111.7，66.2，51.8，50.2，47.9，46.5，44.9，43.8，38.2，35.7，31.4，29.5，26.3，25.8，21.6，13.7.
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2.12 雌二醇-3-β-〔N4-(2，5-二氧)-哌嗪〕-乙基醚(4b)的合成
方法同“2.11”节，由1.67 g(5 mmol)化合物(4)与2，5-哌嗪二酮反应制得(4b)，得白色针状结晶0.64 g，收率：31.2%,mp 218～220℃.：3480(OH)，2929(CH3)，1680(酰胺CO)，1572(CC).MS m/z：412(M+)，141(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.25(s,2H,NCH2CO)，4.16(t,2H,ArOCH2)，4.02(s,2H,OCCH2)，3.74(t,2H,ArOCCH2)，2.88(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).化合物(1)，(2)，(4)及所有目标化合物均未见文献报道，其元素分析结果与理论值相比误差均小于千分之三.
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3 目标物促骨生长活性测定
将16 d胎龄雌性小鼠尺骨置于含有BGJb培养基的培养瓶中，分别加入待测目标化合物，同时设不加化合物的正常对照组和分别加雌酚酮(与1a,2a,3a,4a组对照)和雌二醇(与1b,2b,3b,4b组对照)的阳性对照组.将培养瓶固定在旋转装置上，通入体积分数为O2∶CO2∶N2=45%∶5%∶50%)的混合气体，气流量为1.5 L/min，于(37.5±0.5)℃旋转培养，转速为35 r/min，24 h后补充气体一次.培养48 h后，将尺骨转移至培养皿中，在解剖显微镜下测量其骨总长度和骨干长度.测毕，将尺骨在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中(pH 7.2)固定，用7%EDTA磷酸缓冲液(pH 7.2，4℃)脱钙，其间每天更换EDTA磷酸缓冲液一次，16 d后，将骨组织用双蒸水漂洗，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，纵切成5 μm厚切片，H.E染色，二甲苯透明，封片.显微镜下对破骨细胞及肥大软骨细胞进行计数.实验结果表明：浓度为10-7 mol/L时，(1a,2a,3a,4a)组骨干长和骨总长高于对照组(P>0.05)，低于雌二醇组(P<0.01)，与雌酚酮组无明显差异(P>0.05).与对照组相比，(1a,2a,3a,4a)组的破骨细胞数目显著降低(P<0.01)，肥大软骨细胞显著增加(P<0.01)，与雌酚酮组相比无差异(P>0.05);(1b,2b,3b,4b)组骨干长和骨总长高于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05)；(1b,2b,3b,4b)组破骨细胞数目低于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05)；肥大软骨细胞数目高于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05).
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破骨细胞在骨吸收过程中起主要作用，对骨的吸收活动相当活跃，可从一个部位游走到另一个部位，施行其破骨活动，一个破骨细胞可以溶解吸收由100个成骨细胞所形成的骨质〔8〕，所以，破骨细胞数目的变化是考察骨吸收程度的一个最直接的指标.肥大软骨细胞在软骨内成骨过程中，在功能上与成骨细胞、脉管细胞和破骨细胞的生成相关联〔9〕，其数目变化在一定程度上可以反映软骨细胞分化和骨形成的情况.实验结果显示由雌酚酮和雌二醇与不同的哌嗪环相连所得到的衍生物((1a～4a,1b～4b)，其抑制骨吸收、促进骨形成的作用均不低于相应的母体雌激素雌酚酮或雌二醇，表明4种哌嗪环的引入不影响雌激素对骨的药理作用，所合成的化合物可以作为骨靶向雌激素的弹头，可进一步与骨靶向载体连接.■
基金项目：国家自然科学基金资助课题 No.39430120
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收稿日期:1999-08-31, 百拇医药
单位：李灵芝(华西医科大学药学院，成都 610041)；郑虎(华西医科大学药学院，成都 610041)；翁玲玲(华西医科大学药学院，成都 610041)；李灵芝(现址：武警医学院药学教研室，天津300162)
关键词：雌激素；哌嗪；合成；骨吸收；骨形成
中国药物化学杂志000109 摘 要：设计合成了以籍次乙基为桥将雌激素通过3-OH醚化与4种不同哌嗪环相连的衍生物，包括中间体共合成了12个化合物，其中8个目标物及3个中间体未见文献报道.结构经质谱、核磁共振谱、红外光谱及元素分析确定.同时测定了目标物对体外培养小鼠胚胎长骨生长的影响，结果显示由雌酚酮和雌二醇与不同的哌嗪环相连所得到的衍生物抑制骨吸收、促进骨形成的作用均不低于相应的母体雌激素.表明哌嗪环的引入不影响雌激素对骨的药理作用，所合成的4种化合物可以作为骨靶向雌激素的弹头，进一步与骨靶向载体连接.
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The Synthesis of Derivatives of Estrogen
Linked to Piperazines and Determination of Their Activities
Li Lingzhi Zheng Hu Weng Lingling
(West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract：Eight of the derivatives of estrogen in which estrone or estradiol was linked respectively to 1,4-piperazine-2-carboxylic acid methyl ester,2-ketopiperazine,3-oxo-2-acetic acid ethyl ester and 2,5-piperazinedione through ethyl were designed and synthesized.All of the target compounds and three of the inter-mediates were new compounds.The structures of these new compounds were confirmed by MS,1H-NMR,13C-NMR,IR and elemental analysis.The effects of the target compounds on bone growth were determined.The results showed that the activities of enhancing bone information and inhibiting bone resorption of all the target compounds synthesized were not lower than that of their original estrogen.The results indicated that the effects of estrogen on bones were not changed by importing piperazine rings and suggested that the target compounds synthesized could be used for synthesis of bone-targeted estrogen.
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Key words：estrogen;piperazines;synthesis;bone information;bone resorption▲
雌激素可维持成骨细胞的正常功能，降低破骨细胞活性，对于维持骨量具有重要作用，被广泛用于绝经后雌激素分泌不足所致的骨质疏松症.但长期使用雌激素可能有促使子宫内膜癌和乳腺癌发病率增高的危险，因此设法将雌激素促进骨形成、抑制骨吸收的作用与其对非骨组织如子宫、乳腺等的副作用加以分离具有重要的意义.
1 合成路线
破骨细胞、成骨细胞和软骨细胞中均存在雌激素受体〔1～3〕，表明这类甾体激素可通过受体介导机制发挥对骨组织的影响作用.通过一种骨靶向载体可以使雌激素选择性地作用于骨组织，同时降低非骨组织的雌激素浓度.哌嗪环类常常被许多药物分子引入以调节脂-水分配系数，从而改善药物的生物利用度；此外，哌嗪环化合物分子中含有双N—H基团，因而是一类连接雌激素与骨靶向载体的理想桥梁.据此，设计并合成了不同哌嗪环经乙基为桥与雌激素3-OH成醚的4个系列共8个目标化合物，均未见文献报道，并从组织学和形态学两方面测定了化合物对体外培养小鼠胚胎长骨生长的影响，以从中选择可用于合成骨靶向雌激素的中间体.
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目标物的合成是以雌酚酮或雌二醇为原料，在四正丁基溴化铵(TBAB)催化下经相转移反应制得相应的3-位溴乙基醚或3-位氯乙基醚，然后分别与2-哌嗪羧酸甲酯、2-哌嗪酮、3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯、2，5-哌嗪二酮在丙酮或二甲基甲酰胺中进行烃化反应制得.合成路线见图1.
Fig.1 The route of synthesis
2 合成实验
熔点用毛细管法测定，温度未经校正.元素分析用Carlo-Erba 1106型自动元素分析仪测定.核磁共振谱用Bruker-AG-E 200型核磁共振仪测定，TMS为内标，CDCl3作溶剂.红外光谱用PE-983型红外光谱仪测定，溴化钾压片或液膜法.
2.1 雌酚酮-3-β-溴乙基醚(1)的制备
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方法1：将8.1 g(30 mmol)雌酚酮，9.9 mL(150 mmol)二溴乙烷及1.59 g(5 mmol)四正丁基溴化铵溶于120 mL甲苯中，升温至外温80℃，缓缓滴入18 mL 50%氢氧化钠溶液，TLC追踪反应，约3 h反应完毕，分出甲苯层，水层以甲苯萃取3次，合并甲苯层，2 mol/L氢氧化钠溶液洗涤，水洗至中性，浓缩除去甲苯，残留物加少许甲醇，结晶，抽滤得白色块状结晶，95%乙醇重结晶，得白色结晶4.5 g，mp 84～86 ℃，收率：40.0%.
：2930，2886(CH3)，1731(CO)，1606().MS m/z：376(M+)，270.1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.69(m,2H,ArH),4.25(t,2H,ArOCH2)，3.61(t,2H,BrCH2)，2.87(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3)., http://www.100md.com
方法2：将1.35 g(5 mmol)雌酚酮，3.3 mL(50 mmol)二溴乙烷及1.39 g(10 mmol)无水碳酸钾置于100 mL甲苯中，加热回流72 h，滤除固体，甲苯层以2 mol/L氢氧化钠溶液洗涤，水洗至中性，浓缩后，硅胶柱色谱纯化，得白色结晶0.66 g，收率：35.0%，mp 84～86℃.
2.2 雌二醇-3-β-溴乙基醚(2)的制备
用类似于“2.1”节的方法，雌二醇和二溴乙烷反应制得(2)，为白色块状结晶，收率：32.8%，mp 83～85 ℃.
：3440(OH)，2950，2885(CH3)，1610().MS m/z：378(M+).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),4.25(t,2H,ArOCH2)，3.72(t,1H,17-CH)，3.61(t,2H,CH2Br)，2.82(m,2H,ArCH2)，1.48(锐峰，重水交换后消失，17-OH)，0.77(s,3H,18-CH3)., http://www.100md.com
2.3 雌酚酮-3-β-氯乙基醚(3)的合成〔4〕
将2.70 g(10 mmol)雌酚酮，0.024 g(0.7 mmol)四正丁基溴化铵溶于40 mL 1，2-二氯乙烷中，升温至外温75℃，缓缓滴入6 mL 50%氢氧化钠溶液，约2.5 h滴完，回流30 min，静置冷却，分出有机层，水层以1，2-二氯乙烷提取，合并有机层，水洗至中性，浓缩，残留物用甲醇结晶，得白色块状结晶3.2 g，mp 86～88 ℃，收率：97.3%(熔点和收率与文献〔4〕值相同).
2.4 雌二醇-3-β-氯乙基醚(4)的合成
方法同化合物(3).化合物(4)为白色结晶，收率：96.5%，mp 84～86℃.
：3440(OH)，2950，2885(CH3)，1605().MS m/z：334(M+)；1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),4.19(t,2H,ArOCH2)，3.68～3.81(m,3H,ClCH2，17-CH)，3.61(t,2H,CH2Br)，2.82(m,2H,ArCH2)，1.58(锐峰，重水交换后消失，17-OH)，0.76(s,3H,18-CH3)., http://www.100md.com
2.5 雌酚酮-3-β-〔N4-(2-甲氧羰酰基)-哌嗪〕-乙基醚(1a)的合成
2.3 g(7.5 mmol)2-哌嗪羧酸甲酯双氢溴酸盐(参照文献〔5〕制备)、2.12 g(20 mmol)无水碳酸钠，加70 mL丙酮混匀，回流10 min，加入1.98 g(5 mmol)化合物(1)继续回流，TLC监测，约48 h反应完毕后，静置冷却，过滤，滤液浓缩，残渣加氯仿溶解，5%食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，回收氯仿，硅胶柱色谱，氯仿-丙酮-石油醚(V∶V∶V=2∶2∶1)洗脱，得微带黄色油状物1.41 g，收率：64.0%.
：3441(NH)，2928，2880(CH3)，1737(CO)，1608().MS m/z：440(M+)，157(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.69(m,2H,ArH),4.06(t,2H,ArOCH2)，3.72(s,3H,OCH3)，3.61(dd,1H,NCHCO)，3.09～3.02(m,2H,OCCH2N)，2.92～2.71(m,8H,NCH2CH2N，ArOCH2，ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.7，172.2，156.6，137.6，132.1，126.2，114.5，112.1，65.5，57.3，57.1，55.5，53.5，51.9，50.2，47.9，43.8，38.2，35.7，31.4，29.5，26.4，25.8，21.5，13.7., http://www.100md.com
2.6 雌二醇-3-β-〔N4-(2-甲氧羰酰基)-哌嗪〕-乙基醚(1b)的合成
方法同“2.5”节，由化合物(2)与2-哌嗪羧酸甲酯双氢溴酸盐反应制得(1b)，无色油状物，收率：67.0%.
：3338(OH)，2924，2867(CH3)，1680(酯羰基)，1609(CC).MS m/z：442(M+)，157(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.67(m,2H,ArH),4.08(t,2H,ArOCH2)，3.72(s,3H,OCH3)，3.70(t,1H,17-CH)，3.62(dd,1H,NCHCO)，3.08～3.02(m,2H,OCCCH2N)，2.91～2.71(m,8H,NCH2CH2N，ArOCH2,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：172.0，156.4，137.9，132.8，127.0，114.5，112.0，81.8，65.5，57.3，56.9，55.3，53.4，52.0，50.0，44.1，43.9，38.7，36.6，30.4，29.9，27.1，26.2，23.0，11.0., 百拇医药
2.7 雌酚酮-3-β-〔N4-(2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(2a)的合成
将0.63 g(1.676 mmol)化合物(1)、0.167 g(1.676 mmol)2-哌嗪酮、0.178 g(1.676 mmol)无水碳酸钠及4 mL二甲基甲酰胺(DMF)混匀，外温75℃保温反应7 h，TLC监测反应.反应完毕后，滤除不溶物，减压蒸干，残渣溶于氯仿，水洗，2 mol/L盐酸溶液萃取，水层以碳酸氢钠中和至pH 8～9，滤除沉淀，快速硅胶柱色谱，得白色固体(2a)0.55 g，收率：83.3%,mp 200～202℃.
：3198(NH)，2935，2885(CH3)，1733(CO)，1660(CO)，1610(CC).MS m/z：396(M+)，113(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),5.98(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.09(t,2H,ArOCH2)，3.40(t,2H,CH2NCO)，3.30(s,2H,NCH2CO)，2.90～2.79(m,6H,ArCH2，NCH2C，ArOCCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.8，169.5，156.4，137.7，132.3，126.2，114.5，112.0，65.7，57.1，56.0，50.2，49.2，47.6，43.8，41.0，38.2，35.7，31.4，29.5，26.4，25.7，21.4，13.7., http://www.100md.com
2.8 雌二醇-3-β-〔N4-(2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(2b)的合成
方法同“2.7”节，由0.57 g(1.507 mmol)化合物(2)与2-哌嗪酮反应制得(2b)，得白色固体0.45 g,mp 194～196℃，收率：75.4%.
：3431(OH)，2916(CH3)，1660(CO)，1612(CC).MS m/z：398(M+)，113(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.68(m,2H,ArH),6.03(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.09(t,2H,ArOCH2)，3.37(t,1H,17-CH)，3.40(t,2H,CH2NCO)，3.29(s,2H,NCH2CO)，2.90～2.80(m,6H,ArCH2，NCH2C，ArOCCH2)，1.68(宽峰，重水交换消失，17-OH)，0.76(s,3H,18-CH3)., http://www.100md.com
2.9 雌酚酮-3-β-〔N4-(3-乙氧羰甲基-2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(3a)的合成
将0.94 g(5 mmol)3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯(参照文献〔6〕制备)、1.88 g(5 mmol)化合物(1)、无水碳酸钠0.53 g(5 mmol)与20 mL DMF混匀，升温至外温80℃，保温反应12 h.滤除不溶物，滤液减压浓缩至小体积，加水搅拌，倾出上清液，半固体物加乙酸乙酯固化，过滤，得1.5 g白色固体，乙酸乙酯液以2 mol/L盐酸溶液萃取3次，合并萃取液，碳酸氢钠中和至pH 8～9，过滤得固体0.8 g，两次固体合并，硅胶柱色谱，丙酮-石油醚(V∶V=1∶2)洗脱，得白色固体1.23 g，收率：50.8%,mp 188～190℃.
：3298(NH)，2931(CH3)，1734(CO)，1671(酰胺CO)，1608(CC).MS m/z：482(M+)，199(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.66(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.18～4.05(m,4H,OCOCH2，ArOCH2)，3.61(m,1H,NCHCO)，3.37(t,2H,CH2NCO)，1.24(t,3H,OCH2CH3)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.0，171.1，156.5，137.8，132.4，126.3，114.5，112.0，68.1，61.6，60.5，53.0，50.4，47.9，46.9，43.9，39.9，38.3，36.1，35.8，31.5，29.6，26.5，25.9,14.1，13.8., 百拇医药
2.10 雌二醇-3-β-〔N4-(3-乙氧羰甲基-2-氧)-哌嗪〕-乙基醚(3b)的合成
方法同“2.9”节，1.10 g(2.910 mmol)化合物(2)与3-氧-2-哌嗪乙酸乙酯反应制得(3b)，得白色固体0.60 g，收率：42.5%,mp 184～186 ℃；
：3440(OH)，2930(CH3)，1735(CO)，1670(酰胺CO)，1609(CC).MS m/z：484(M+)，199(基峰).1H-NMR δ：7.20(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.43(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.18～4.06(m,4H,OCOCH2，ArOCH2)，3.71(t,1H,17—CH)，3.61(t,1H,NCHCO)，3.36(m,2H,CH2NCO)，1.23(t,3H,OCH2CH3)，0.76(s,3H,18—CH3)., 百拇医药
2.11 雌酚酮-3-β-〔N4-(2，5-二氧)-哌嗪〕-乙基醚(4a)的合成
将2.28 g(10 mmol)2，5-哌嗪二酮(参照文献〔7〕制备)与40 mL甲醇混匀，升温至回流，尽量使溶，缓缓滴入含0.28 g(5 mmol)氢氧化钾的甲醇溶液10 mL，滴毕，蒸除甲醇，残渣加20 mL DMF和1.66 g(5 mmol)化合物(3),升温至外温80℃，保温反应7 h(TLC监测).蒸除DMF，残渣加氯仿溶解，过滤得粗品，硅胶柱色谱，氯仿-丙酮-石油醚(V∶V∶V=2∶2∶1)洗脱，得白色针状结晶0.7 g，收率：34.0%,mp 220～222℃.
：3273(NH)，2929(CH3)，1733(CO)，1680(酰胺CO)，1572(CC).MS m/z：410(M+)，141(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.25(s,2H,NCH2CO)，4.16(t,2H,ArOCH2)，4.02(s,2H,OCCH2)，3.74(t,2H,ArOCCH2)，2.88(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).13C-NMR δ：220.9，166.4，163.7，156.0，137.9，132.6，126.4，114.3，111.7，66.2，51.8，50.2，47.9，46.5，44.9，43.8，38.2，35.7，31.4，29.5，26.3，25.8，21.6，13.7., 百拇医药
2.12 雌二醇-3-β-〔N4-(2，5-二氧)-哌嗪〕-乙基醚(4b)的合成
方法同“2.11”节，由1.67 g(5 mmol)化合物(4)与2，5-哌嗪二酮反应制得(4b)，得白色针状结晶0.64 g，收率：31.2%,mp 218～220℃.
：3480(OH)，2929(CH3)，1680(酰胺CO)，1572(CC).MS m/z：412(M+)，141(基峰).1H-NMR δ：7.21(d,1H,ArH)，6.65(m,2H,ArH),6.40(宽峰，重水交换消失，NHCO)，4.25(s,2H,NCH2CO)，4.16(t,2H,ArOCH2)，4.02(s,2H,OCCH2)，3.74(t,2H,ArOCCH2)，2.88(m,2H,ArCH2)，0.89(s,3H,18-CH3).化合物(1)，(2)，(4)及所有目标化合物均未见文献报道，其元素分析结果与理论值相比误差均小于千分之三., 百拇医药
3 目标物促骨生长活性测定
将16 d胎龄雌性小鼠尺骨置于含有BGJb培养基的培养瓶中，分别加入待测目标化合物，同时设不加化合物的正常对照组和分别加雌酚酮(与1a,2a,3a,4a组对照)和雌二醇(与1b,2b,3b,4b组对照)的阳性对照组.将培养瓶固定在旋转装置上，通入体积分数为O2∶CO2∶N2=45%∶5%∶50%)的混合气体，气流量为1.5 L/min，于(37.5±0.5)℃旋转培养，转速为35 r/min，24 h后补充气体一次.培养48 h后，将尺骨转移至培养皿中，在解剖显微镜下测量其骨总长度和骨干长度.测毕，将尺骨在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中(pH 7.2)固定，用7%EDTA磷酸缓冲液(pH 7.2，4℃)脱钙，其间每天更换EDTA磷酸缓冲液一次，16 d后，将骨组织用双蒸水漂洗，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，纵切成5 μm厚切片，H.E染色，二甲苯透明，封片.显微镜下对破骨细胞及肥大软骨细胞进行计数.实验结果表明：浓度为10-7 mol/L时，(1a,2a,3a,4a)组骨干长和骨总长高于对照组(P>0.05)，低于雌二醇组(P<0.01)，与雌酚酮组无明显差异(P>0.05).与对照组相比，(1a,2a,3a,4a)组的破骨细胞数目显著降低(P<0.01)，肥大软骨细胞显著增加(P<0.01)，与雌酚酮组相比无差异(P>0.05);(1b,2b,3b,4b)组骨干长和骨总长高于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05)；(1b,2b,3b,4b)组破骨细胞数目低于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05)；肥大软骨细胞数目高于对照组(P<0.001)和雌酚酮组(P<0.01)，与雌二醇组无差异(P>0.05).
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破骨细胞在骨吸收过程中起主要作用，对骨的吸收活动相当活跃，可从一个部位游走到另一个部位，施行其破骨活动，一个破骨细胞可以溶解吸收由100个成骨细胞所形成的骨质〔8〕，所以，破骨细胞数目的变化是考察骨吸收程度的一个最直接的指标.肥大软骨细胞在软骨内成骨过程中，在功能上与成骨细胞、脉管细胞和破骨细胞的生成相关联〔9〕，其数目变化在一定程度上可以反映软骨细胞分化和骨形成的情况.实验结果显示由雌酚酮和雌二醇与不同的哌嗪环相连所得到的衍生物((1a～4a,1b～4b)，其抑制骨吸收、促进骨形成的作用均不低于相应的母体雌激素雌酚酮或雌二醇，表明4种哌嗪环的引入不影响雌激素对骨的药理作用，所合成的化合物可以作为骨靶向雌激素的弹头，可进一步与骨靶向载体连接.■
基金项目：国家自然科学基金资助课题 No.39430120
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收稿日期:1999-08-31, 百拇医药